质谱技术在抗肿瘤药物分析及疗效预测中的作用

质谱技术在抗肿瘤药物分析及疗效预测中的作用质谱仪的发展第一台质谱仪：1912年，J.J.Thomson；早期应用：原子质量、同位素相对丰度等；40年代：高分辨率质谱仪出现，有机化合物结构分析；60年代末：色谱-质谱联用仪出现，有机混合物分离分析；80年代以来：迅速发展。同位素质谱、有机质谱、无机质谱。质谱分析过程进样系统离子源质量分析器记录（质谱图）离子检测器质谱分析过程：1.样品通过进样系统进入离子源，由于结构性质不同而电离为各种不同质荷比（m/z）的气态离子（母离子、碎片离子）；2.带有样品信息的离子被加速进入质量分析器，不同的离子在质量分析器中被分离并按质荷比大小依次抵达检测器，经纪录即得到按质荷比排列的离子质量谱，也就是质谱(massspectrum)。质谱：按离子的质荷比的大小依次排列形成的图谱。质谱分析法：根据质谱给出的信息，进行的定性、定量、结构分析。m/z丰度第一部分：液相色谱质谱联用仪（LC-MS)液相色谱-质谱（LC-MS）联用技术:将色谱对复杂样品的高分离能力，与MS具有高选择性、高灵敏度及能够提供相对分子质量与结构信息的优点结合。主要运用于：1.天然产物鉴定；2.生物制药及药物代谢分析；3.食品成分分析；4.蛋白质及多肽分析；5.农药及兽药残留分析。LC-MS联用的方法开发质谱条件的优化色谱条件的优化样品预处理的优化影响LC-MS联用的主要因素样品结构和性质气流和温度合适的电压流动相的形成流速的影响色谱柱的温度、直径等度还是梯度杂质的影响验证组OS对照组OS（未接受TKI治疗）LC-MS技术检测小分子药物不同给药方式血药浓度检测患者口服给药及静脉给予拓扑替康的血药浓度，分析药物的绝对生物利用度（45.80±11.8%和39.72±15.9%）

验证组OS对照组OS（未接受TKI治疗）检测患者体内总的和游离的多西他赛脂质微球的血药浓度LC-MS技术检测脂质体包裹小分子药物血药浓度超滤法结合LC-MS验证组OSLC/Q-TOF

MS技术检测鉴定小分子药物代谢物成功鉴定了埃克替尼药物的29种代谢物液相色谱/四极杆飞行时间质谱验证组OS对照组OS（未接受TKI治疗）LC-MS技术检测蛋白质药物及其类似物检测人血浆中甘精胰岛素及5种其类似物，特异度和灵敏度高验证组OS对照组OS（未接受TKI治疗）LC-MS技术检测单克隆抗体药物血药浓度显示使用液质联用技术检测曲妥珠单抗的灵敏度高、稀释倍数小，重复性好验证组OS对照组OS（未接受TKI治疗）LC-MS技术检测单克隆抗体结构表征上的运用成功鉴定了曲妥珠单抗的结构特征表征，此方案对于抗体仿制药的研究开发也有非常大的借鉴意义。验证组OS对照组OS（未接受TKI治疗）二维LC-MS技术检测血浆中肿瘤标志物发现了phosphatidylinositol（PI）(16:0/16:1)和PI(18:0/20:4)标志物区分良恶性肿瘤；发现了PI(16:0/18:1),磷脂酰甘油(36:3)和葡糖神经酰胺(d18:1/15:1)评价恶性肿瘤的水平。小结验证组OS液质联用技术在生物大分子和小分子药物的血药浓度检测中起到重要的作用；灵敏度和特异度高；数据结果分析简单；可进行定量、定性和结构分析；验证组OS对照组OS（未接受TKI治疗）

2002年基质辅助激光解析电离（matrixassistedlaserdesorptionionization,MALDI）技术获得诺贝尔化学奖——“生物大分子质谱分析法”。国外已经将此技术用于动物、植物和医学等领域的基因检测第二部分：基质辅助激光解吸-飞行时间质谱仪（MALDI-TOF-MS）基于MALDI-TOF循环肿瘤DNA检测在肿瘤疗效预测中的应用液态活检的应用前景

肿瘤内异质性

EGFRM/WildEGFRM/T790MEGFRM/C-METEGFRM/KRAS

重复活检和动态检测困难

部分患者无组织标本或无足够的组织标本进行基因分型IPASS研究中的4条曲线显示仅有437例(入组1217例)能取到组织标本去检测组织靶基因检测是目前的金标准,但亦存局限验证组OS对照组OS（未接受TKI治疗）应用ctDNA实现疗效动态监测

---用药指导、预后、复发预警液体活检ctDNA检测技术及应用验证组OS对照组OS（未接受TKI治疗）MALDI-TOF-MS检测ctDNA技术流程PCR扩增、突变特异的延伸、磁珠捕获、质谱分析识别一个碱基的差异红色为空白对照验证组OS对照组OS（未接受TKI治疗）MALDI-TOF-MS突变检测探索选取已做过组织基因检测的患者初治血浆样本进行MOLDI-TOF核酸质谱检测，进行一致性分析选取做过基因检测的患者有基线血和治疗过程中连续采血点的样本进行MOLDI-TOF核酸质谱检测，动态监测常见的4个基因突变情况查询病历，收集临床信息和随访得到生存和预后，进行突变丰度和疗效及生存的关联分析鉴于疗效与突变丰度的关系，有突变定量的需求。因此需要一种简单快捷成本低的方法检测EGFR、KRAS、BRAF和NRAS等4个基因300多个突变位点。验证组OS血样保存时间与DNA含量的对比不同保存时间的样本，提取的血浆DNA浓度均能够符合检测标准序号ARMSMOLDI-TOF丰度163WTWT164DelDel56%167DelWT175WTWT176WTDel6%177WTDel6%178L858RDel6%L858R17%179L858RDel6%L858R15%MOLDI-TOF检测性能优势当突变/缺失丰度＞10%时，AMRS和MOLDI-TOF均能检测到突变/缺失；＜10%，只有MOLDI-TOF能够检测到缺失。验证组OS一致性分析从结果分析看，血浆保存时间对结果的影响不大，更关键的可能是前处理和保存方法。导致一致性降低的原因可能是采血时间选择及化疗等治疗手段对结果的影响。抽血时间早于病理诊断时间的一致性较高些。抽血时间结果一致的例数占比早于病理诊断55/13晚于病理诊断11/6基于MALDI-TOF蛋白检测的VeriStrat分类法在肿瘤疗效预测中的应用基于基质辅助激光解析电离飞行时间质谱使用血液样本利用8种不同m/z标记蛋白的信号峰值结合K-nearest算法构建预测模型区分哪些患者可以从治疗中获益（good/poor分组）仅能提供药物疗效预测无法提供预后VeriStrat分类法NSCLC二线厄洛替尼或化疗中的预测价值（PROSE）—由标记物分层的随机III期研究患者血浆经质谱分析，依据8种蛋白信号峰分为VeriStratGood或Poor组；研究VeriStrat分组与化疗或二线EGFR-TKI疗效间的关联性；Prose为完整前瞻性蛋白标记物分层研究。•263例实际入组患者•组织或病理学确诊为肺腺癌•IIIB或IV期VeriStrat分类Good88例Poor41例134例接受厄洛替尼1:1随机分层129例单药化疗（多西他赛74例；培美曲赛55例）Good96例Poor38例VeriStrat运用实例-1验证组OS对照组OS（未接受TKI治疗）吉西他滨+厄洛替尼OS吉西他滨+厄洛替尼PFSVeriStrat-GoodVeriStrat-PoorVeriStrat-Good组中，OS在化疗组与厄洛替尼组间均无差异►VeriStrat-Poor组中，OS在化疗组显著长于厄洛替尼组因此EGFR野生型或突变状态未知的NSCLC患者，可进行VeriStrat分类，对于poor的患者二线不推荐使用厄洛替尼治疗组与VeriStrat分层间的相关性基于埃克替尼对比吉非替尼治疗晚期NSCLC随机双盲的III期临床试验（ICOGEN试验）患者治疗前血浆经质谱分析，依据8种蛋白信号峰分为VeriStratGood或Poor组共检测了386个样本，其中分析了埃克替尼组183个样本，吉非替尼组179个样本

VeriStrat运用实例-2P=0.78P=0.70ABCDP<0.001P<0.001未经VS分类，埃克替尼组与吉非替尼OS及PFS差异无显著性差异经VS分类，good组与poor组间OS和PFS有差异治疗组与VeriStrat分层间的相关性埃克替尼埃克替尼吉非替尼吉非替尼ABCDP<0.001P<0.001P=0.33P=0.02埃克替尼组OS及PFS，VS分类good组均好于poor组吉非替尼组OS及PFS,VS分类good组与poor组间OS有差异，PFS则无显著差异。治疗组与VeriStrat分层间的相关性ABCDGood组Good组Poor组Poor组Good组中，埃克替尼与吉非替尼PFS有差异，OS无显著差异Poor组中，埃克替尼与吉非替尼OS有差异，PFS无显著差异P=0.04P=0.02P=0.64P=0.11治疗组与VeriStrat分层间的相关性基于埃克替尼对比一线化疗加维持治疗EGFR基因敏感突变晚期肺腺癌（CONVINCE试验）患者治疗前血浆经质谱分析，依据8种蛋白信号峰分为VeriStratGood或Poor组共检测了253个样本，其中分析埃克替尼组114个样本，化疗组106个样本，初步分析了两组间的PFS，需要等待OS数据进一步进行分析

VeriStrat运用实例-3Good组中，埃克替尼组与化疗组PFS有差异Poor组中，埃克替尼组与化疗组PFS无显著差异