DB37-T 4058-2020 水生动物细菌性病原检测技术规范-（高清版）

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DB37山 东 省 地 方 标 准DB37/T4058—2020水生动物细菌性病原检测技术规范Inspectionprotocolforbacterialpathogensofaquaticanimals20202020070920200809山东省市场监督管理局发布前言GB/T1.1—2009本标准由山东省渔业标准化委员会（鲁TC03）归口。水生动物细菌性病原检测技术规范范围（Bacterialpathogensofaquaticanimals）本标准适用于山东省水生动物常见细菌性病原检测。GB4789.28食品安全国家标准食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求SC/T7014—2006水生动物检疫实验技术规范SC/T7201.1鱼类细菌病检疫技术规程第1部分：通用技术SN/T2123出入境动物检疫实验样品采集、运输和保存规范3试剂与材料3试剂与材料试剂与材料应符合GB4789.28和附录A的规定。4仪器设备按照SC/T7201.1的规定执行。5采样应使用无菌采样用具。按照SC/T7014—2006中第6章的规定执行。按照SN/T2123的规定执行。6细菌性病原分离培养6.1分离培养规范取样后，采用稀释倒平板法、涂布平板法、平板划线法等方式，在28～3024h15～1824h各30g/1000mL容积，然后将干燥器盖严，用凡士林密封，在28～30h15℃～1824h严格厌氧菌的分离培养应在厌氧工作台中进行。纯培养挑取单菌落，接种于相应培养基上，按照6.1.1的方法培养。挑取单菌落，接种于相应培养基上，按照6.1.2的方法培养。本一致的单菌落，操作步骤应符合6.2的要求。7病原菌检测本一致的单菌落，操作步骤应符合6.2的要求。7病原菌检测16SrDNAPCR按照附录B执行。PCRDNAMarker1472bp左右DNAPCRDNAMarker标准样品未出现条带，则电泳失败，应检查电泳试剂重新进行电泳。DNAMarkerDNA1472bpDNAPCR7.1.3克隆、测序和比对将7.1.2样品扩增条带克隆、测序，序列输入到NCBI网站进行比对，确定细菌的属种。按照SC/T7014—2006中的9.4规定执行。需要鉴定病原菌到属依据7.1.3结果进行判定，需要进一步鉴定到种应结合7.2结果进行综合判定。附录A（规范性附录）试剂的配制TEA液：1mol/LTris·HCl(pH8.0)称取Tris6.06g40mLHCl约2mL调pH至8.050mLB液：0.5mol/LEDTA(pH8.0)称取Na2EDTA·2H2O9.31g35mL1gNaOH至8.050mL（Na2EDTA·2H2O需加入NaOH将pH调至接近8.0时才会溶解）。TE量取液5mL，B液1mL400mLpH至8.0500mL1×TAE称取T称取Tis42.0Na2DT2HO3.2于1800mL5.1mL1000即为50×TAE50附录B（规范性附录）菌落PCR测定制备DNA0.2mLPCR10μL552000r/min1DNAPCRDNAPCR采用50μLPCR反应体系：DNA模板浓度范围为0.2ng/μL～2ng/μL，（用核酸测定仪测定DNA模），10×PCRBuffer（含Mg2+1.5mM）5μL，dNTP（10mM）1μL，（27F）：5′AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3′（1492R）：5′TACGGCTACCTTGTTACGACTT3′（25μM）2μL，Taq酶（2U/μL）1μL～2μL50μL，（）7210min，4注：不同细菌PCR程序可不同。B.3电泳检测设置阳性样品对照（如大肠杆菌DNA）、阴性样品（如鱼的基因组DNA或细菌质粒DNA）对照、空白对照（无DNA）。1×TAE（见附录A.2）缓冲液配置含核酸染料的2PCR扩增产物与6×上DL2000DNAMarker10V/cm电泳30（）7210min，4注：不同细菌PCR程序可不同。B.3电泳检测设置阳性样