多肽及其功能性物质的应用

课程考核学位类型：学科、领域：食品科学与工程研究方向：导师姓名：学生姓名：学号：入学时间：授课教师：课程名称：考核时间：多肽的制备及其功能活性的研究进展摘要科学研究发现生物体内存在多种具有生理活性的多肽物质，它们具有不同的结构和功能活性。人体摄入的蛋白质经酶水解后，主要以肽的形式被消化吸收。几乎所有细胞都受多肽调节，它具有调节机体生理功能和为机体提供营养的双重功效。人们已从包括人、植物、动物在内的各种生物体中分离出各类活性多肽，并且对多肽的性质、制备方法、分离纯化方法、鉴定技术、功能活性及应用等方面进行了大量的研究，并取得了一定的成效。本文概述了不同来源多肽的制备方法和其功能活性研究进展,对多肽的多种功能活性进行了介绍。关键字：多肽；功能活性；分离纯化ABSTRACTScientificstudieshavefoundthatorganismsexistavarietyofphysiologicallyactivepeptideswhichhavedifferentstructureandfunctionalactivity.Aftertheproteinsintakenbyhumansarehydrolyzed,theywillbedigestedandabsorbedintheformsofpeptides.Almostallcellsareregulatedbypeptideswhichregulatethebody'sphysiologicalfunctionandprovidenutrientsforthebody.Peoplehaveisolatedallkindsofactivepeptidesfromavarietyoforganisms,includingpeople,plants,animalsandhavedonealotofresearchandapplicationofthenatureofpeptides,preparationmethods,purificationmethods,identificationtechnology,functionalactivity,etc,andachievedsomeresults.Thisarticlesummarizesamethodforpreparingactivepeptidesandtheprogressoffunctionalactivity.Keywords:peptides;Functionalactivity;Separationandpurification近年来，多肽在生物体内的生理功能受到越来越多的重视。大量研究结果表明，蛋白质由于其分子量大，结构复杂，摄人人体后不易被消化吸收，从而影响了其生理功能和营养价值的有效发挥。多肽是比蛋白质结构简单，分子量小，由2-16个氨基酸通过肽键连接的一类化合物，按氨基酸组成数目可人为分为短肽(2-5个氨基酸)，多肽(6-16个氨基酸)。多肽是涉及生物体内各种细胞功能的生物活性物质。科学发现，几乎所有细胞都受多肽调节，如：细胞分化、神经激素递质调节、免疫调节等均与活性多肽密切相关，它具有调节机体生理功能和为机体提供营养的双重功效。由于多肽具有调节植物神经系统、活化细胞免疫机能、改善心血管功能和抗衰老等生理活性，这为开发肽药物、肽类保健食品提供了理论依据。可见，进行多肽的研究和开发有着十分重要的研究意义和应用前景[1]。1多肽的制备方法目前，国内外制备多肽的方法主要有：蛋白酶水解法、化学合成法、基因重组法、分离提取法等。酶法生产功能性多肽应用较为普遍[2]。龚吉军等人[3]利用茶籽蛋白酶酶解制备菜籽多肽，确定了最佳条件，此条件下氨基酸态氮生成率可达34．64％，制备的茶籽多肽对超氧自由基和羟基自由基具有强烈的清除作用；李书国等人[4]研究了酶法生产大豆多肽的加工工艺，分离得到纯净的酸性水解物溶液，水解率高达95％；班玉凤等人[5]研究了Alcalase水解大豆蛋白制备大豆蛋白寡肽的方法，确定了酶解的最佳条件，其水解液的水解度达到了24.1％；刘大川等[6]也利用碱性蛋白酶对富硒菜籽分离蛋白酶解制备蛋白肽，水解度达32．51％，制得的富硒菜籽蛋白肽分子量分布较好，几乎完全是小分子多肽，分子量均在1500D以下。以下是几种方法优缺点的概述。1.1化学水解酸解法水解度不易控制，容易使氨基酸遭到破坏；碱解法能使L-氨基酸形成D-氨基酸，可能存在营养和毒理方面有害的效应，对于食品多肽的生产不足取，所以这两种方法都很少被使用破坏L型氨基酸。1.2酶法能在一定条件下进行定位水解产生特定的肽，且易于控制水解进程，并且具有高度的专一性，一般不会导致营养方面的损失，也不会产生毒理学上的问题，同时酶作用具有特异性，可在温和条件下进行，因而能较好的满足肽的生产需要。1.3发酵法直接利用微生物发酵过程中产生的蛋白酶降解蛋白，可达到较高的水解率，该技术的要求相对较高，对菌种的依赖性较大，，本质也是酶解。目前采用较多的是酶法。酶法因其水解条件温和，水解度易控制，无环境污染的特点，备受推崇。而酶解法中双酶或多酶协同水解的方式又多被采用。因为这种方式生产下的水解液水解度大、苦味低、多肽种类多。现在蛋白质的水解一般都用酶法水解，在多肽的生产中酶的选择是关键，它不仅影响最后产品的得率，反应速度，而且直接影响产品的风味和理化特性，现有的酶解工艺多采用单酶水解，易产生苦，涩等不良风味影响了食用的要求，因此通常采用复合酶水解，例如：内肽酶和端肽酶，alcalase与flavourzyme得组合酶等。在蛋白质的酶解过程中水解度的控制是十分重要的参数因为过度的水解会产生苦味肽，影响水解蛋白在食品中的应用[7]。多肽制备的一般步骤：原料-前处理-提蛋白-干燥-蛋白粉-酶-灭酶-离心分离-多肽液-干燥-多肽粉。2多肽含量的测定2.1双缩脲法双缩脲反应：在强碱性溶液中双缩脲与硫酸铜反应可生成紫色络合物，其颜色深浅与蛋白质浓度成正比，在540纳米处测吸光值。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键都可发生双缩脲反应。2.2OPA法（邻苯二甲醛法）使用于乳源性的多肽测定，反应试剂：含有25ml100mM的硼砂2.5m120(w/w)SDS、40ragOPA(邻苯二甲醛溶于lml甲醇)，再用去离子水定容至50ml，用不同浓度的胰蛋白酶水解的酪蛋胨(多肽)来制作标准曲线，50/11样品溶液与2ml试剂室温下反应2min，在340nm下比色，查标准曲线即可以得到多肽的含量。3.3紫外吸收法蛋白质溶液在238nm处的光吸收的强弱，与肽键的多少成正比，所以此法适用于多肽的含量测定。因此可以用标准蛋白质溶液配制一系列50-500fg/ml已知浓度的5.0ml蛋白质溶液，测定238nm的光吸收值A238，以A238为纵坐标，蛋白质含量为横坐标，绘制出标准曲线。未知样品的浓度即可由标准曲线求得。多种有机物，如醇、酮、醛、醚、有机酸、酰胺类和过氧化物等都有干扰作用。所以最好用无机盐，无机碱和水溶液进行测定。若含有有机溶剂，可先将样品蒸干，或用其他方法除去干扰物质，然后用水、稀酸和稀碱溶解后再作测定[8]。3多肽的分离纯化随着现代生物技术的发展，用于蛋白质及多肽分离纯化的方法日益先进。常用的提取分离法包括：化学萃取法(如：醇法、丙酮法)、阴阳离子交换吸附柱、Sephadex凝胶过滤柱、凝胶电泳、高效液相色谱(HPLC)、高效毛细管电泳法(HPCE)等方法。Chen等人[9]利用水醇提取法，结合离子交换、凝胶过滤和RP—HPLC从人参中分离到六种含仅氨基酸的小肽。郝林琳等人[10]采用醋酸溶液和乙醇提取了6支鲜二杠马鹿茸的主干顶部、中部、根部3个部位的多肽。金声等人[11]将罂粟的花粉水提取液经H+型阳离子交换柱，Sephadex凝胶过滤柱和HPLC系统提取分离得到了四种多肽。4多肽的活性研究4.1易消化吸收作用过去人们认为，人体主要是以氨基酸的形式吸收蛋白质，但现代营养学研究发现人体摄入的蛋白质经消化道中的酶水解后，主要以寡肽的形式被消化吸收，以游离氨基酸形式吸收的比例很小，所以，多肽比完全游离氨基酸更易更快地被机体吸收利用，且蛋白质以多肽的形式被吸收，也有利于最大限度地利用其生物活性功能。尤其对于消化功能受损的人群，他们的食物蛋白质的吸收受到严重限制和影响，蛋白质、氨基酸循环被破坏，体内不能合成多肽，若直接服用多肽即可补充蛋白质，又可以维持正常的代谢平衡。4.2.降血压作用AcEI抑制肽能抑制血管紧张素转化酶(ACE)的活性，而血管中的AcE能使血管紧张素Ⅱ生成，从而引起末梢血管收缩致使血压升高。可见AcEI抑制肽能够间接阻止血管紧张素Ⅱ的生成，进而起到降低人体血压的作用，是预防和治疗高血压的有效多肽类物质。江南大学刘萍等人利用酶法水解玉米蛋白粉生产降血压肽，结果表明碱性蛋白酶水解玉米蛋白获得的水解液在水解度为15.96%时水解液的ACE抑制率最高，IC50值为0.125mg\ml[12]。张焱等人利用胰蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和碱性蛋白酶分别水解大豆蛋白，制备具有ACE抑制活性的大豆多肽，结果表明碱性蛋白酶是最佳的水解酶，当酶与底物比为2.0，反应时间为80分钟，温度为55℃时可制备出高ACE抑制活性的大豆多肽[13]4.3.降血脂和降胆固醇作用人们早在20世纪初就观察到植物蛋白的水解产物蛋白肽具有比植物蛋白本身更有效的降血脂、降胆圄醇的作用。有研究分析，多肽能刺激甲状腺激素分泌增加，促进了胆固醇的胆汁酸化，使粪便排泄胆固醇增加，从而起到降低血液胆固醇的作用。许多动物实验和临床试验表明：大豆多肽中，分子相对质量大于5000D的部分具有明显降低胆固醇的作用；并且只对胆固醇值高的人有降低胆固醇的作用，对正常人没影响。4.4抗菌作用抗菌肽又称为微生物肽或肽抗生素，是指存在于生物体内具有抵抗外界微生物侵害，消除体内突变细胞的一类由生物细胞特定基因编码产生的小分子多肽。抗菌肽是动物机体具有天然免疫力的重要原因，对动物的非获得性免疫具有特殊意义。它们的碱性基团和微生物的细胞膜有着很强的亲和性，可通过增加细胞膜的通透性杀死微生物。西南大学食品学院霍健聪等人：以带鱼下脚料为原料，制备多肽亚铁螯合物，并研究亚铁鳌合物的抑菌活性[14]。利用风味酶和动物复合蛋白酶双酶法制备水解液，采用氯化亚铁螯合。以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等为测试菌株，，采用牛津杯双层平板法确定亚铁螯合物的抑菌中浓度及探讨pH和温度对亚铁螯合物抑菌活性的影响。结果表明：(1)最佳酶解条件为带鱼下脚料蛋白用量4.1g/100mL，温度4O℃，复合比l:1，酶量6×10IU/100mL，pH7；(2)带鱼下脚料蛋白最佳螯合条件为：pH7，时间15min，温度20℃,抗坏血酸用量0.1％;(3)抑菌活性试验结果表明：亚铁螯舍物对所选取的测试菌株除普通变形杆菌外都有一定抑菌作用，其中对巨大芽胞杆菌抑茵效果最好；在酸性条件下抑茵活性仍然较高，但在碱性环境中抑菌活性明显降低；在较低温度下保持抑茵活性，但高温处理后抑菌活性显著降低。亚铁螯合物对各测试菌株除普通变形杆菌之外均有较强的抑菌活性，是一种对细菌较为广谱的抑菌剂。4.5.抗氧化作用抗氧化性多肽是生物活性肽的一种。抗氧化机理包括通过给抗氧化酶提供氢、缓冲生理pH、螯合金属离子和捕捉自由基等途径起到抗氧化作用。科学研究表明自由基可引起蛋白质损伤、脂质过氧化、核酸损伤等，进而诱发各种疾病。而抗氧化多肽具有清除自由基、防止脂质过氧化等作用，将其添加到功能保健食品中，具有预防多种疾病的作用。抗氧化性多肽还能作为天然抗氧化剂防止油脂氧化，缓衰老的作用。河南工业大学史军，王金水等人[15]利用花生蛋白经过碱性蛋白酶ALCALASE、复合蛋白酶PROTAMEX水解得到活性肽溶液．通过单因素试验及正交试验得到各个因素的优化组合，并进一步研究活性肽的抗氧化特性．结果表明，ALCALAsE对花生蛋白的水解能力优于PROTAMEX，花生肽具有较强的抗氧化性及有效清除羟自由基的能力。4.6促进矿物质吸收某些蛋白肽可通过与人体必需的矿物离子形成螯合物，使钙、铁等离子维持在可溶状态，从而促进机体对矿物质的吸收。如将从牛乳中提取的酪蛋白磷酸肽CPP，也称为促钙吸收肽，添加到儿童和妇女及老年食品中，则可促进钙的吸收。近一个世纪的研究表明，肽是由20个天然氨基酸以不同的组成和排列方式构成的二肽到复杂的线性和环形结构的不同肽类总称，是源于蛋白质的多功能化合物。活性肽广泛存在于自然界中，生物体很多活性物质都以肽的形式存在，没有肽，就没有活性，没有生命[16]。科学家们研究发现了具有免疫调节、激素调节、酶调节、抗病毒、降血压和降血脂等功能性肽[17-18]。由于功能性肽的特殊功能，使得人们对它的需求增加，现在已提取出的多种功能性肽多用于医用和保健，如功能性大豆蛋白肽已经用于降血脂。伴随着需求，人们对肽的结构和功能研究也逐渐深入。5展望近年来,活性多肽的开发越来越受到世界各国的关注,并取得了一定的进步。但由于多肽研究水平仍处于初级阶段,技术水平有待进一步提高,这极大限制了蛋白质资源的有效利用,有些蛋白质资源被当作粗饲料、燃料甚至作为废弃物丢弃。因此,进一步研究活性多肽的制备方法,明确其保健功能的作用机理,开发出有价值的保健功能食品,对提高各种来源蛋白质深加工的转化率和利用率具有重要的现实意义,同时也为综合利用蛋白质资源提供了一条有效途径。生物活性多肽作为食品不仅能提供人体生长发育所需的营养物质,还能起到调节人体生理功能的作用。它不仅对于整个食品工业的各个领域,而且对于医药、化妆品、生物、保健等许多领域的发展均有着重要意义。生物活性多肽开发成具有多种营养保健功能的多肽保健营养品、多肽药物、食品添加剂等,有着广泛的发展前景。相信,随着多肽的制备方法、功能特性及营养价值等内容更深入广泛的研究,将会有越来越多的不同来源、不同制备方法的生物活性多肽广泛应用于食品和医药等行业中。参考文献[1]励建荣，封平．功能肽的研究进展[J]．食品科学，2004，25(11)：415－419．[2]孔令明，等．多肽的功能活性与研究进展[J]．中国食品添加剂，2009，03，71－73．[3]龚吉军，李忠海，钟海雁，等．茶籽多肽的制备及抗氧化活性研究[J]．食品研究与开发，2007，28(10)：59－6l．[4]李书国，陈辉，杜进民，等．大豆多肽的功能特性及加工艺[J]．粮油食品科技，2000，8(1)：14－15．[5]班玉凤，朱海峰，孙明珠．水解大豆蛋白制备大豆蛋白寡肽的研究[J]．现代食品科技，2007，23(11)：5l－53．[6]刘大川，周俊梅，张寒俊．富硒菜籽蛋白肽的制备工艺研究[J]．中国粮油学报，2006，21(3)：245－249．[7]李志忠，袁惠君，张丙云，等．大豆多肽的功能与开发研究[J]．甘肃科技，2006，22(