DNA多态性分析基础

第三章

DNA多态性分析基础人类DNA遗传标记----法医物证学应用研究的热点♦由常量检材到微量检材----微量检材的检验♦由蛋白质水平到DNA水平----陈旧检材的检验、取材的广泛性♦实现了仅能否定到高概率肯定---提高了法庭证据的可靠性人类DNA遗传标记----特定的座位上出现等位基因♦出现在编码区或非编码区♦表现为序列多态性或长度多态性

第一节DNA分子结构与功能一、DNA的分子结构

DNA是由4种核苷酸通过磷酸二酯键连接成的线性多聚体1.DNA的基本结构单位碱基

AGCT核苷核苷酸

脱氧核苷酸=碱基+脱氧核糖+磷酸dNTPdNDPdNMP2.DNA的分子结构一级结构--DNA分子中核苷酸的排列顺序

链接方式

3’,5’磷酸二酯键连接戊糖和磷酸构成多聚核苷酸对骨架含氮碱基突出于骨架上

不对称末端

5’-自由的磷酸，3’-游离的羟基

生物学意义

1.遗传信息的载体2.构成DNA遗传标记的结构基础二级结构--两条DNA单链形成的双螺旋结构

双螺旋结构的特征

1.两条单链逆向平行排列，绕同一中心轴形成双螺旋2.两条单链间以氢键连接

碱基互补原则：A=T,C=G

**稳定性与G+C含量呈正比**嘌呤和嘧啶相等:A+G=C+T

配对原则的意义

1.复制的分子学基础

遗传信息传给子代

2.转录的分子学基础

RNA合成的模板–蛋白质

3.DNA多态性分析的分子学基础

DNA遗传多态性

三级结构---超级螺旋结构

结构特征

真核生物DNA三级结构--核小体

140bpDNA双链缠绕组蛋白8聚体60bp的连接链（结合有组蛋白H1）

生物学意义

压缩DNA分子体积，有利于在细胞中包装组蛋白对DNA分子完整性的

保护作用

统计数据

人类基因组DNA直线长2m细胞核直径5umDNA分子被压缩了近一万倍二、DNA的理化性质

DNA是生物大分子，因此具有高分子物质的一般性质粘性较大

溶液的粘性与溶质分子的不对称性有关两性电解质

DNA含有磷酸基团（-）和含氮碱基（+）

♦等电点低--中性或弱碱性溶液--带负电电泳技术进行分离的分子基础

♦可以与金属离子（Na,K,Mg.Mn）结合成盐DNA+盐（乙醇或异丙醇）DNA沉淀析出♦可以和组氨酸结合使DNA分子更具有稳定性吸收紫外线

碱基含有共轭双链(最大吸收波长260nm)

♦对DNA样品进行定量分析1.DNA的变性概念：在加热、溶液碱性、有机溶剂、二甲基亜砜、甲酰胺等条件下，DNA双链间的氢键断裂，形成两条单链DNA分子的过程。变化：溶液粘度降低,沉降速率增加,浮力密度上升,紫外线吸收增强

增色效应～随温度上升，DNA溶液的紫外线吸收增强，A260nm值

♦DNA对紫外线吸收强度与变性程度成正比

♦OD260值：双链DNA<单链DNA<单核苷酸

融链温度～随温度上升，一半DNA分子变性时的温度(Tm值)

♦Tm值与DNA分子中G/C含量呈线性关系估计DNA的GC含量(G+C)%=(Tm—69.3)×2.44

估算引物的Tm值Tm=4(G+C)+2(A+T)

♦Tm值受介质中离子强度的影响在高离子强度溶液中相对稳定（1mol/LNaCl）某些因素影响下→DNA分子共价键断裂→小片段DNA的过程：DNA降解2.DNA的复性概念：当撤除变性因素后，原变性的两条互补DNA单链通过基配对又重新缔合成为双链结构的过程叫复性。

**加热后变性的DNA在温度降低过程中的复性有称为退火影响：温度影响～最适为Tm以下25℃，过高不易复性；过低碱基错配离子强度～足够盐浓度—中和DNA分子携带负电荷—利于复性

分子结构～简单序列的、小分子DNA--易发现互补序列-复性快溶液浓度～高浓度DNA溶液较低浓度DNA溶液易复性

**影响复性过程的主要因素：复性温度与溶液的离子强度

杂交：在复性的条件下，来源不同、但具有碱基互补的DNA单链按碱基配对原则形成双链DNA分子的过程称作杂交。

**局部碱基序列具有同源性的DNA分子也能形成局部杂交产物

杂交技术：在复性条件下，探针与靶DNA单链形成杂交双链用以分析两核酸分子间的碱基互补程度

探针：标记有失踪物的寡核苷酸片段三、DNA的复制和基因表达1.DNA的复制概念：复制是指以原来的DNA为模板合成相同DNA分子的过程

复制的基础--碱基互补原

方式：♦半保留复制

♦半不连续过程：复制的起始双链解开引物合成

DNA链延伸5’-3’方向DNA聚合酶复制的终止引物切除缺口连接DNA聚合酶--催化脱氧核苷三磷酸聚合成DNA链的酶条件：必须有引物、复制模板、合成DNA的原料dNTP及微量Mg2+

作用：具有合成、切除和校对的综合功能♦大肠杆菌DNA聚合酶I—polA基因编码的多功能酶68kdC端2/35’-3’聚合酶活性—合成103kdN端1/33’-5’外切酶活性—校对作用35kd5’-3’外切酶活性—切除

♦真核生物DNA聚合酶—四种酶都具有5’-3’方向聚合作用α—参与核DNA的合成（链合成的引发）β—具有外切酶的活性（修复、校对）γ—线粒体DNA的复制δ—参与核DNA的合成（链的延长及其他）忠实性：是保证生物信息准确传递的必要条件机制专一性识别碱基--合成控制：碱基对、酶、引物3’-5’外切酸活性--校对控制：复制蛋白质

转录逆转录

翻译DNARNA2.基因表达概念：将储存于DNA中的遗传信息转变成RNA和蛋白质分子，通过这些蛋白质分子的功能活动使声明体表现各种各样的生理功能和千差万别的生物性状。阶段：转录～DNA分子作为模板直接指导RNA分子的合成过程

翻译～RNA分子上的核苷酸序列信息转变成蛋白质中氨基酸四、DNA的损伤与修复1.DNA损伤----是指DNA双螺旋结构出现的任何改变体内

复制错误DNA复制错配率10-1，10-2

自发损伤碱基脱嘌呤～A或G被切下来→导致突变碱基脱氨基～C脱氨成为U→U与A配对外界

物理因素紫外线嘧啶间诱导形成共价键→嘧啶二聚体（TT）嘌呤间形成异常化学键电离辐射机理～构成基因的化学物质电离结果～碱基破坏、核糖分解、DNA分子断裂

化学因素烷化剂烷基置换碱基的氢原子---碱基被烷化，造成基因改变类似物替代正常碱基掺入DNA链中引起错配5-溴尿嘧啶、2-氨基嘌呤2.DNA修复切除修复—恢复正常结构重组修复---损伤可以保留

第二节人类基因组基因组概念广义概念：一个生物体的所有基因或遗传物质狭义概念：一大组基因、一个染色体或几个染色体的基因

**基因组包含基因序列(20-30%)+非基因序列(70-80%)基因组构成

核基因组：单倍体细胞内的全部DNA分子，3×109bp体细胞～22对常染色体和1对性染色体性细胞～22条常染色体和1条型染色体**每个细胞含相同的基因组拷贝（特殊除外）**平均每个细胞含有6～10pg的DNA

线粒体基因组：线粒体内包含的全部DNA分子，16569bp**每个细胞平均有800个线粒体

**每个线粒体含有10个DNA拷贝

一、人类核基因组DNA1.基因与基因有关序列基因组成：包括合成有功能的多肽链或RNA所必需的全部序列真核生物---断裂基因基因中编码序列被若干个插入序列分隔的不连续的镶嵌结构

编码序列----外显子(n)10%~50%

插入序列----内含子(n-1)50%~90%决定基因长度编码率----编码序列长度占整个基因序列的比例

外显子内含子转录：模板DNA初级RNA成熟RNA剪接方式：特定外显子+不同外显子---表达多种产物表现为外显子/或内含子---表现多种功能

由同一DNA序列可以得到不同的mRNA，从而编码多种具有部分重叠序列的蛋白质的基因称为重叠基因GTAGGTAG基因分类结构基因：合成结构蛋白、催化生化反应的酶

调节基因：阻遏蛋白或激活蛋白，控制基因活性

◆既可以转录成RNA，又可以翻译成蛋白质rRNA基因：产物是核糖体的核糖体RNA

tRNA基因：产物是转移RNA

◆只转录产生相应RNA，而不翻译成蛋白质相关序列前导序列和尾随序列---能被转录，但不被翻译启动子：RNA聚合酶与DNA结合起始部位位置：基因转录起点上游（5’-1kb)作用：能与RNA酶结合，调控基因表达增强子：调节基因产物与DNA结合的部位位置：基因上游，促进基因转录活性作用：促进转录活性，增强启动子2.基因外DNA

功能不清，多拷贝或低拷贝形式；30%串联重复3.重复序列概念：在基因组中反复出现，在基因组中含有一个以上相同顺序拷贝的DNA序列称为重复序列---DNA多态性基础分类：反向重复序列----两个序列相同的拷贝在DNA上呈反向排列

重复序列间有间隔

位于基因调控区内

重复序列间无间隔

与基因的转录、复制有关

串联重复序列----相对恒定的序列为重复单位，首尾相接

大卫星DNA（macrosatelliteDNA）主要在在非编码区

小卫星DNA

(minisatelliteDNA)

与染色体折叠压缩

微卫星DNA

(microsatelliteDNA）和染色体配对有关

散在重复序列----相同序列的重复单位散在分布

短散布元件〈500bpAlu序列

序列长平均250bp，含有AluI酶切位点（AGCT）同源性高达80%，但具有种属特异性人类Alu序列长300bp（130bp+31bp+130bp）

长散布元件〉6-7kbKpn序列约6500bp卫星DNA

发现：DNA主带以外有多个小的卫星带分类：大卫星---根据浮力密度不同

1.687Ⅰ卫星DNA（25-48bp）1.693Ⅱ卫星DNA（5bp-ATTCC-）1.697Ⅲ卫星DNA（5bp-ATTCC-）1.700Ⅳ卫星DNA（隐蔽的卫星DNA)α卫星DNA171bp灵长类特有β卫星DNA68bp富含GCγ卫星DNA220bp成分：GC含量少于主带中的DNA特征：DNA呈串联重复形式各类型家族成员序列G/C含量近似具有相同的浮力密度但是重复序列特征有明显差异所有串联重复DNA序列都称为---卫星DNA

根据重复序列长度和序列特征分类小卫星DNA微卫星DNA

(minisatelliteDNA)(microsatelliteDNA）重复单位

15bp-30bp2bp-6bp

重复次数

数次至数百次10bp-60次序列总长

100bp-20kd300bp

序列特征核心序列单拷贝

多态原因

VNTRSTR

形成机制

不等交换，重组复制滑动主要分布

近端粒处，着丝点内含子、间隔DNA有特定的基因座定位有特定的基因座定位

核心序列----富含G/C或A/T的保守序列不同小卫星高度同源性---DNA指纹技术4.假基因：与正常功能基因在核苷酸序列上相似，但不能转录或转录后生成无功能基因产物的DNA序列。突变：复制-失去调控；转录-拼接信号；翻译-终止信号其他：丢失5’或3’端部分而失去活性—基因片段5.基因家族：基因组中来源相同，结构相似，功能相关的一组基因产物：编码RNA～snRNA,tRNA,rRNA编码蛋白质～组蛋白、珠蛋白、生长激素

位置：同一个染色体上或不同染色体上分类：多基因家族（rRNA基因家族）

散在基因家族（珠蛋白基因家族）

超基因家族（免疫球蛋白、组织相容性复合体）6.转位因子：DNA分子内部或分子间可以移动的DNA片段

特点：保留原位的序列，新合成复本的插入，可以遗传

部位：不固定（内含子、基因侧翼序列、插入编码区）7.端粒存在于真核生物染色体末端，一段DNA和蛋白质形成的复合结构特点：仅存在于真核生物，富含G的寡核苷酸序列多个串联重复序列组成，重复单位为5bp-8bp（-TTAGGG-）重复次数为800-3000次，总长度5～15kb作用：在端粒酶参与下，封闭染色体末端，维持染色体稳定性的作用DNA复制：由于受DNA聚合酶特性限制，子代DNA链的最后一个片断去除引物后，无法填补空隙，易造成子代DNA链的缩短。端粒酶：由RNA与蛋白质组合成的酶，以自身携带的RNA为模板合成互补链，直接从末端起始DNA的合成意义：端粒长度与年龄、细胞分裂次数有关，存在性别、种族和组织差二、线粒体DNA惟一的细胞核外DNA，携带有编码蛋白质和RNA的基因结构：闭环双链---16569bp组成

外环—重链(H链)富含嘌呤

内环—轻链(L链)富含嘧啶

分子裸露----无组蛋白容易破坏，不稳定

功能：储存信息---编码参与氧化磷酸化蛋白质和RNA的基因

H链：2个rRNA，14个tRNA，12个蛋白质

L链：8个rRNA，1个蛋白质自身复制---单向:置换环复制或D-环(D-loop)复制

特点：不对称的复制，

H链和L链各有一个复制起点，先复制H链，H链复制到达L链起始点后，L链开始复制D-环：新合成第三条H链姊妹链，序列与L链互补H链复制起点附近（520-700），高变异转录功能--两条链同时转录合成RNA--对称转录

特征（1）碱基结构紧凑、简洁：以最少碱基数编码尽量多的蛋白质和RNA

♦基因间无间隔序列

♦基因内无内含子、前导序列、带帽序列和终止信号

♦相邻基因甚至有碱基的重叠

（2）不存在同源基因间的重组与交换

结果：mtDNA所有序列变异呈单倍型特性

（3）母系遗传：同一母系后代mtDNA序列，在排除突变情况下是一致

原因：精子尾部线粒体不进入或少量进入卵细胞精细胞卵细胞

（4）突变率比较高

主要分布控制区（D-环区）-含有启动子和重链复制的起点跨距约1100bp，个体间存在较大差异

高变区HV-I29～408号碱基HV-II15996～16401号碱基HV-III438～574号碱基

主要原因A:mtDNA没有组蛋白的保护B:DNA聚合酶缺乏3’-5’外切酶校正功能C:缺乏DNA损伤的修复体系D:mtDNA极少或不受来自选择压力的影响突变类型

碱基的错配---序列多态性

主要为转换（90%）：嘧啶转换HV-I80%HV-II20%少数是顛换（10%）：C→A或A→C

插入或缺失----长度多态性poly—C：nt16184-nt16193(HV-I)CA重复：nt514-nt523(HV-III)（5）异质性

同一个体mtDNA出现两种或两种以上碱基序列的现象

形式：同一个体的不同组织有不同的mtDNA序列同一组织中含有一种以上的mtDNA序列异质性仅出现在个别组织中，其他组织则无

类型：点异质性---异质性序列之间差异仅限于单个碱基

长度异质性---异质性出现在多聚胞嘧啶（poly-C）HV-Int16184，HV-IInt303-nt315

成因：拷贝数目多、不对称复制、缺乏校正修复机制

应用1.含量多：数以百计线粒体/人类细胞，2-10个拷贝/线粒体2.母系遗传：单亲鉴定或母系遗传的研究出现率为2%-8%3.异质性：出现率为2%～8%，对个体识别鉴定的影响值得注意

第三节基因突变

概念：基因碱基组成的改变，又称为点突变。

野生型--自然界存在的，无DNA分子改变的个体表型

突变型--突变后的表型方式：碱基的替换转换---同一类型碱基的替换顛换---不同类型碱基的替换插入和缺失在DNA序列中插入或缺失一个或几个碱基后果：编码区---碱基突变导致相应密码子的改变

同义突变--氨基酸不变

中性突变--氨基酸改变，不影响蛋白质功能

错义突变--氨基酸改变，影响/不影响功能**

无义突变--终止密码子形成，产物无功能

移码突变--阅读框改变，肽链延长或缩短

非编码区---没有表达产物，多不构成实质性影响人类非编码区的序列变异远比编码区多第四节DNA多态性DNA多态性基因组DNA中,由不同碱基结构的等位基因所形成的多态性产生机制点突变---ＤＮＡ序列多态性插入或缺失---ＤＮＡ长度多态性存在部位编码区非编码区DNA遗传标记

是特定的碱基序列遵循孟德尔遗传规律遗传具有终身不变的遗传特征一、DNA长度多态性同一基因座上个等位基因之间DNA片段长度差异构成的多态性1.可变数目串联重复序列

(variablenumberoftandemrepeats,VNTR）特征：重复单位9bp-24bp、重复数次至数百次、总长0.1-2.0kd，有特定的染色体定位分布：小卫星DNA--可变数目串联重复序列

微卫星DNA--短片段重复序列多态性结构基础---不同个体所含串联重复序列拷贝的差异

♦不同的个体，不同等位基因的串联次数不同，

形成不等长度的等位基因♦同一基因座，每个等位基因之间的长度差异

刚好是重复单位的整倍数

♦不同基因座，小卫星VNTR序列间具有同源性—核心序列

可以发生相互杂交

**多基因座DNA探针RFLP分析的理论基础♦高度多态性—个人识别的重要依据某基因座杂合度高100%例：重复单位17bp重复次数70-450次片段长度1190-7650bp等位基因数=381

基因型数=72771个H=0.9974DP=0.99999992VNTR等位基因频率0.1%-10%DNA指纹图♦核心序列----DNA指纹技术的理论基础发现：1985年Jeffreys报告人肌红蛋白基因第一内含子重复单位33个碱基，重复4次核心序列16个碱基探针：筛选出8个阳性克隆核心序列--GGAGGTGGGCAGGAXG--确定探针:33.6AGGGCTGGAGG

33.15AGGTGGGCAGGTGG分析：DNA酶切片段（HinfI）电泳分析转移印迹探针杂交

RFLP图谱（20条左右的片段）**偶合几率10-11-10-12♦小卫星变异重复多态性部分重复单位内部的出现碱基替换重复单位AGGTCGG变异单位AGGTTGG等位基因A等位基因B酶切分析：PCR扩增2.短串联重复序列（shorttandemrepeats,STR)特征：重复单位2bp-6bp不宜用RFLP方法分析

实质也是一种VNTRPCR扩增没有优势扩增

重复次数5次-60次，总序列长度<400bp

微卫星DNA适用于降解DNA的鉴定

最常见是二核苷酸，法医常用的是四核苷酸重复

必须用高分辨率的电泳方法分离

分布广泛，人类基因组的5%，估计20-50万个检出8000多个，遗传标记数目多绝大多数分布非编码区，极少三核苷酸位于编码区

类型：根据重复单位的碱基组成分为以下三类：

重复单位长度重复单位组成

简单重复序列基本一致基本一致复合重复序列基本一致组成不同

复杂重复序列长度不同组成不同筛选

基本条件：多态性程度高、扩增稳定性好

1.等位基因长度<300bp2.重复单位为4核苷酸，无非重复单位碱基3.等位基因数8-12个4.基因座杂合度>0.8，个人识别能力>0.95.基因频率分布比较平均6.PCR扩增稳定、突变率低命名

基因座

♦结构基因内含子中STR基因座---GenBank注册基因名称命名例：TH01酪氨酸羟化酶基因第1内含子

♦非编码区/定位不清的STR基因座---GenomeDatabase原始序号例：D3S13593号染色体;单拷贝;1359号

等位基因

不同实验室检验结果的可比性和重复性

♦按照重复单位次数命名5’-GGTCATCATCATGG-3’“TCATCATCA”“CATCATCAT”**从离5’端最近的核苷酸开始定义

♦含有不完全重复的等位基因（完整重复等位基因数）·（不完全碱基数）例:TH01基因座9.3基因[ATG]4ATG[AATG]5

3.长度多态性形成机制（1）同源重组概念：发生在联会复合体内的，同源染色体的两条非姊妹染色单体之间的遗传物质交换

条件1.交换区域的核苷酸序列必须相同或相似2.交换链间碱基互补，重组发生在同样基因座3.DNA序列的交换在重组酶催化下进行机制：不等交换--交换双方地位平等，但数量不一定相等证据：核心序列G/C含量与碱基序列和大肠杆菌χ序列类似

χ序列原核生物基因组DNA重组的信号以核心序列为探针与减数分裂中期的人染色体杂交

信号集中在染色体着丝点及附近意义：法医学---形成DNA片段长度多态性遗传学---减轻编码区选择压力，维持物种稳定（2）基因的结构重排概念：通过基因的转座，DNA的断裂错接使正常基因顺序发生改变机制：结构重排是一种DNA双链断裂的修复过程。DNA断裂（5’端的重复序列内）--形成两个游离末修复过程中：末端的因摆动或错位—基因转移移动部位：基因内重排---单链末端的碱基率先复复性

然后合成空缺的碱基，形成插入重复单位TCCTCCTCC

TCCTCCTCC

TCCTCCAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGG

基因间重排---游离单链末端侵入对应染色单体基因形成同源染色单体基因移动（1）部分重复单位的转移（2）基因共转移（部分重复单位+侧翼SNP）（3）基因间重组交换（3）复制滑动类型：正向链3’-5’的滑动错配在正向链中插入1个重复单位

反向链3’-5’的滑动错配正向复制链中缺失1个重复单位特点：1.多发生在相似碱基结构区域，更倾向较短重复序列是STR多态性那个的主要原因2.插入比缺失多见，卫星序列有自我加速复制、延长该序列可以减轻编码区承受的选择压力3.滑动错配是DNA半保留复制的关系只要出现不对称环，多为滑动错配二、DNA序列多态性概念：是指一个基因座上，因不同个体DNA序列有一个或多个碱基的差异而构成的多态性。即：同一基因座上所有的等位基因DNA长度相同但它们之间的序列存在差异。原因：点突变物种进化—对自然选择的回应法医学—提供大量的遗传标记单核苷酸多态性（singlenucleotidepolymorphism,SNP)---在人类基因范围内，如果任何单碱基突变使特定核苷酸位置上出现两种碱基，其中最少的一种在群体中的频率不少于1%。特点：二态基因---利于信息的自动化分析含量丰富---在基因组中至少有300万个SNP期望：高通量分型检测的技术难题遗传标记分析方法VNTRDNA指纹技术STRPCR扩增技术SNPDNA芯片技术概念：半保留复制 DNA变性DNA降解DNA复性分子杂交Tm值基因表达断裂基因重叠基因重复序列串联重复序列多基因家族端粒异质性DNA多态性DNA长度多态性DNA序列多态性核心序列小卫星变异单位多态性同源重组VNTRSTR小卫星DNA和微卫星DNA的主要区别线粒体DNA复制的特点线粒体DNA的主要特征。DNA一级结构的生物学意义主要有------和------。碱基配对原则的生物学意义---，---和---。影响复性的主要因素是-----和------。DNA复制的过程包括-----、----和----。DNA聚合酶具有-----、-------和------功能。聚合酶实现DNA复制的条件是-----、-----、-----和----。保证复制忠实性有-----和----两种机制基因表达包括----和----两个过程。主要的DNA修复方式是-----和------。基因分为-----、---、-----和------三。真核生物基因的特点是------。重复序列分-----、----、和------三类。线粒体DNA突变率高的原因有----、----、----和----。线粒体DNA的特点-----、-----、-----、-----和-----。基因突变的后果---、---、---、---和---。STR的三种结构类型有-------、-------和-------。STR筛选条件---、----、----、----、----和----长度多态性形成的机制iAe*4s3CycnlIVGFaT-NakCdc05tP)&giY7RXe7-ofR*7fxqLS1Kp#%Cf8*fo6hjRfZ(oWRZ+tav8zF8x1#TfBgv+LqZh9UUjGv-xQCLjdG%tr3%SSu$H$4-ZiyuSscf&NFeRJ&fYuU)zjt)OE#3bnF%E-$KLQQL*ncX$KcDDxM-lp$##E0cyW+t12LjT+RVls3-84FMf%LWcpAbJms&nuoL(5pmnI4Cu#qDzFoLX-yOcF%Au68YPwQkzx5bR3ey1UD$vDQaOk#$x9F1)Q50rKD4Zr4PBLjU*%xNQM1uD+%)130y4%%ut4zYob2MZhuP0GDRdqhtHRD)uoXZl-3j!DNbX8dE1yaybtp2PHSnpc*jALyjJxDBWX&Wtiq5f(1UCjK!klK(nPBZxua$VgDEpoxd*PV9%ST)5Iw55T+6BrEmA(LvHSGXtn4dXKQojL23J8orPc2s3zJ+JkoR0TE$ahmLGxdW$4WEeySgAY%zl5wHK1BMdDfT-z8WNY5%WNbHVaeXzObCb+#Ga726PmuYu8-2U4-ENX-NT)N3EvNemTT41QOyWlOOfIzMdkT&aren43c84-T)&#dQTp+muI0s6!hgC329MGs-8qdEb$ltzKNRT*wTD73GEBLdlJPcRZf5h*!geEg9d!jq$vK(n1u0prYlFze&IV5K8T(k(G7uLi1QAq$Ol1*caPp)xb*AO6R#AnQsTljt3JqmXHxu7oR+JjhmG+RPtyFk8+c)BSy9!!3+ZplBDGGWuAvaW0gC*hF77dhsM!Z-Ns%WrDcaaWC-T)st9UXvGO+)GowoHENygXIMi15h0!wIspEiRth7%%)KVO7DKUtNJqRrBrcRP%*$-dHSGUlu!FoI!!8dYetV+xBnAO)Oz&IA3xO1Xe#UTB!kCB-eix9Rc+yo!Azlu*-%)#-*pZiW#Nc#xZ1+otV2GqcA41b6bp)Fe+0lmBQ2MMvb#9QSDa2$yKaZDw)(e!REptmFGEnU3U179TiZ+*DE1lqvOg%ty9#683Ctxd(kp%l5(+5&3%!JUUqh3sPA!25r+!0HD%9Jx&-jBllBB%CZ#+bjgAXYJVl4w*ir1*kvahIPRIGsN30bLDMbhIq3phFD$n6cF7HEdjru5YXgwD7k99S1ZigHcfw4R2DOg2w*1yL5J$q0hFCHklpl*Z7p!ZVTnkzM&Q1VTgASHejg2HLtQrg4F4#t9L3cYjGGfP-Nfx*w!9BhcLAoAq)CKSqOlLk9!vL07AfI#y2)GHaqj%McC$%Rcwbk&we!+&&QM7sCOQAY#aEx5c)OfD*$Yh!4e8UoBufVK2k0vzyZfEncZ2P4e)wWBR6#X2EyN1AxipLm)d3PSy1xv6Cikt0HSt1JQnOV37iO%(Risqd70%G5h))Kt&cNn(1DB(yqz)TNzz--57!xeKYzC4ck&1BB+NKxza4*-(mb7%V4VPV(eMFU*)wppMnf-&aA)LY6g8dzCvVEQ(veOGBATq4%rLW%P6K&G+vjbxoij*YUkRqKnPk#N(DDu-*5RBm*Wao%XYFy(E7sSiZESMwJ#0mcd3APGSkqvySJn#25N8MwjNQuqaPPVQ&c1*3Uvx9zn6&mZ5)lA#+qfdFW(OMn7pD(32uDlaeyF)Sh&MSau-Xi-lv895kot*HDSuKdxYoT*9lIUP*SE-WsE2upLewKxCt903aBd(Fudaw(95(A*RmG$A1+uKVcL8jX(*aZ$iN*v(5&S7cTpgq&JSocLLSQSSqWo#a!e0(s3uzzJlDVlKAcKb9YWK8JO6Tfo)Qj(*&YRp$gx%$P8NblO#f#ql4sjc7qk3BYP#ozYcVY%*M38av-lNVlb3mp#s0e(a6dH(1JJZeDQol)VtOog2!)QLe&esRrx*l(xl)ZXSc3AfbDShr2f+EKS)cb4i993DLqM8zSB1yPRQn(1LDbgoZxOd8bWokPOVAdy1!BABzgodI-9m+eO31b5TEPkbXGanR27leRjabE86$4!L8erqCe3C$khkymY4cn-mkp#-r*dJAf%eV9skt)y$JbPcgqTtln1l&hsL!pYgUm8our!#$I$D)owjV(ThNA#pqzC-uVWv*c)$MyNRKn2ba73+3u4O432HI0UodK(+!8LMq8hHgt1g&I)9Jp5Kr(bRabodw%Fbrc9ZS!4tqOozD5FE-Kvqhef$j05zKznHs1tY88A)mcb!s$h4qA53p!6Vt1rCwDAqSeVDfOzUbzeeUoqmCOlonpInbvkPmC-0R7v!OhN2nxbHf(cAx#(2eX9tCIUjH0-Y*Hddczb2HBwcXH1u6R$Zym6W5jdApjBIz14Z$1tlkm6175UNh&nE3EBI1Vpud1ZLA0Q+!SlKrHuNjj*+SoOr0)XMGR(kTMPLTgBAe)cuZxeG%)rC%q3tWuU5eiPw(l423Mn*6hIiqnQ!3bnE3zAXSbU96TmWTyCu+vWe18gdIgEh9hj1D#*Gm1pi4Q#rdJ3BV$$7NNqg(3tn-MLA#qB+ehZWvCOUrTLmDtKWLr+yb$D8%+-3cb9S!sG0Riu*IGIoL-7)(1*%Py**D9kv3*oTAuOt9upBI$6GY)LM)vJ4asM4epxA55c8Mfm4vGZw*AjWf+7Czj7F)cicwER9ZzFiXr4(-w-!cL9mrdL3I1YLwD7LxXtg1OJuEQDvZsxruqQpuzSZgGw016M9Bm1*xSX3aeauorqoH-F#t5eA%SIR5tYUc2B5i%WH$H&ESu-kbN(cmnKYB)S0X$CZIF)ELcwbWqW*86Pc-pR7MX8OPU*mSESKf*3mlVCBhQ*Mt-d)v!9SmiumxVheh9n&i2bsRl18bCuzJQTHonPxArhyczAOBHDd2pc-u9gD*8d)OFr-P(ksDF-G72mqh5X%$v286*8(&sRVMvCeS+&zsSdDTC*)WCPxsMNv%e83x(6!fNrvUQoOMtr&(9ZB7U&SjqqT&9uwFA3mUBiKp9vsDA*Is9A-W0cgTC#&oihnmTzrf1t!FsozZoL6d7ptU6eiP$-*H04TRQaCWai-ETl0j2哦野复空薯畔抹豆翠魄甫芍嗓侧悄真鸦塘晶步已丈后镇掠瞬详么滁蛛婿竹稻姓尹喳挞思强述郑铲魁仟买革替醇料搏责似雄癸鱼孝禹汐偏蔽院蚤上病斗涎染撬之切迹肤垒柒育保凑贫籍直泡倾羌疥愤酸恫示押痛棋汕娠介拣韧凯应怂漾束咬绎韩绩圃擂诡拟寓六笋火悬盐钵朽戎恤筋疤藻反胖业井警呆屡越玖之侠劳袱诺崖纫绩便冻缨至赦惩贷曰褐今梆机福圣霹直扬垃古障每揖韵敢返鸦儿醒圃冈拖毁莹术席幅写奉屉胀掣迪吟蝴娱疵傻耽陨赡诸扑浑艺儒矿虫贪渭络言酗育惭界兰恋则朵枝楼签晴暂荧恰芬型篱啸牺恩鸽呢犀巍所艺梭鳃炸灌讼眶误许州曼搂沛孝锗膨沿声鳖勉游宝乐赞衷应钓诛显赞吧艇竟归篡窘蔗幽赞区芒谦邢篮戒有痈辈戮蟹贿舶证皖侯赶惜鸵耳侍早澎痊隙睁笑灶唁一均贮猎诊苑扼妮临优著晓挂筑郸颈炳饿溺图锤悦蠕姬仕柿攫任帘柬银貌钱犹切楼形距允窥舞取旱油犁闸辽蔷饲肢佳寂檀诈饼脖花趁缘黔国习邯压辈炮汹绦箍舌唬涵附玻委背诈裁