牛血清抗胰蛋白酶分离及鉴定二

离子交换层析与α1-AT的测定1、提纯上次实验得到的粗提液，去除球蛋白，以获得较高纯度的α1-AT蛋白2、通过检测α1-AT对胰蛋白酶的抑制力来测定α1-AT的【实验目的】离子交换层析以离子交换剂为固定相，一定PH值和离子强度的溶液为流动相，利用待分离物质的电荷与离子交换剂的电荷之间的相互作用达到分离纯化的目的。【背景知识】纤维素—O—CH2—COO-—

Na＋树 脂—O—N+(CH3)2

—

OH-离子交换剂以不溶于水的惰性物质如纤维素，树脂，葡聚糖，琼脂糖等为支持物，通过化学反应（酯化、氧化和醚化等）共价连接带电基团。根据可交换离子的电荷性质，将离子交换剂分为阳离子交换剂与阴离子交换剂。基质

带电基团

交换离子阳离子交换剂阴离子交换剂【背景知识】DEAE-纤维素是应用最广的阴离子交换剂，呈弱碱性，本身带有正电荷，能不同程度的吸附溶液中的阴离子。【背景知识】【背景知识】对于蛋白而言，结合力取决于其等电点以及溶液的pH值。3R—CH—COOH|NH

+pH<pIA+-H++H+R—CH—COO-|NH3+pH=pIA0-H++H+R—CH—COO-|NH2pH>pIA-阳离子两性离子阴离子血浆中蛋白质的等电点蛋白质等电点α1-球蛋白5.06α2-球蛋白5.06β-球蛋白5.12γ-球蛋白6.85-7.50α1–

AT4.7样品以pH6.4的PBS缓冲液溶解，在此pH与离子强度，DEAE-纤维素带有正电荷，可吸附带负电荷的蛋白质。使用不同离子强度

(0.05M、0.12M)PH6.4的PBS缓冲液进行分段洗脱带负电荷少的球蛋白首先被洗脱带负电荷多的α1-AT蛋白质后被洗脱【实验原理】球蛋白α1-AT球蛋白﹤0.05M

PBS

﹤

α1-AT﹤

0.12MPBS【实验步骤】1、装柱连接层析柱，垂直固定。出口，向柱内加入1/3高度的0.05M

PBS（pH6.4）排走空气；将凝胶搅拌均匀，灌胶，待凝胶自然沉降约

1cm时，打开出口，控制流速，30滴/分。继续添加凝胶，直至凝胶占层析柱达3-5cm，夹紧出口。*装柱时应注意装柱均匀，柱床内不得有气泡，表面要平整。2、平衡0.05M

pH6.4

PBS

平衡3、加样取出上次课的大管粗提样品，低温解冻，加样(方法同凝胶过滤层析)将G25样品加入已平衡好的层析柱表面，使样品进入柱床内。 用

0.05M

PBS洗涤沾在管壁上的蛋白质样品，使其进入凝胶内。【实验步骤】4、洗脱与检测0.05M

pH6.4

PBS

，流速15滴/分。双缩脲试剂检测洗脱液，出现紫红色，为第一蛋白峰，继续检测直至洗脱液无蛋白质，关闭出口。。换0.12MpH6.4

PBS，全速洗脱。待第二次出现紫红色，为第二蛋白峰，收集，至紫红色

量取体积，记录，取0.5ml至EP管中，其余放入5ml

EP管中，冰箱中冷冻保存(标记为DEAE+组号)。5、回收凝胶【实验步骤】【注意】始终保持柱内液面高于凝胶表面，避免凝胶于空气中。先用0.05M

PBS洗脱，再用0.12M

PBS洗脱。【实验步骤】二、α1－AT测定对

胺（黄色）α1－AT苯甲酰精氨酸胰蛋白酶BAPNA【实验原理】颜色深浅与胰蛋白酶成正比将各步纯化的α1-AT样品与一定量胰蛋白酶溶液反应，检测胰蛋白酶剩余

，该剩余 与α1-AT活力成负相关。H2O空白对照G25DEAETris1.00.50.40.40.4样品------0.10.10.1胰蛋白酶---0.50.50.50.537℃水浴5minBAPNA2.52.52.52.52.537℃水浴10min33%乙酸0.50.50.50.50.5【实验步骤】1、取5支试管加液如下。(单位：ml）2、410nm比色，记录数据3、计算α1-ATα1-AT

（mg/ml）=D对-D检/D对×0.06

×1/0.1D对

对照管光密度值D检

检验管光密度值0.06

加入胰蛋白酶的量（mg）【实验步骤】三、双缩脲法测定蛋白含量2、混匀，室温放置30min，520nm比色，记录。3、计算蛋白含量蛋白含量（mg/ml）=D待测/D

×CC =70

mg/ml空白G25DEAE0.9%NaCl0.1---------提取液双缩脲---5.00.15.00.15.00.15.01、取4支试管加液如下。(单位：ml）722分光光度计使用方法接通电源，打开仪器电源开关，打开样品室盖，预热15min以上;转动波长选择钮，选用所需波长;将空白液或对照液及测定液分别装入比色杯3/4体积并用擦镜纸擦净外壁，放入样品室内,空白液一般放于最外格，样品比色杯放入位置与试管位置对应;按Mode键，选择透光度T测定模式开盖（光门