DB15T 2728-2022牛轮状病毒腹泻诊断技术规范

ICS65.020.30CCSICS65.020.30CCSB41内蒙古自治区地方标准DB15/T2728—2022牛轮状病毒腹泻诊断技术规范Technicalspecificationfordiagnosisofbovinerotavirusdiarrhea2022-07-292022-07-292022-08-29内蒙古自治区市场监督管理局发布前 言本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（SAM/TC19）归口。本文件主要起草人：徐晓静、王建龙、谢梦圆、马立峰、郭宇、王秀敏、常继涛、陈坚、马培倩、周伟光、黄海碧。牛轮状病毒腹泻诊断技术规范范围本文件规定了牛轮状病毒腹泻的临床诊断和实验室诊断技术方法、操作程序和判定标准。本文件适用于牛轮状病毒腹泻的诊断、监测和检疫等。（GB19489实验室生物安全通用要求GB/T27401实验室质量控制规范动物检疫本文件没有需要界定的术语和定义。本文件没有需要界定的术语和定义。4缩略语下列缩略语适用于本文件。BRV（Bovineratovirus）CPE（CytopathicEffect）DMEM：达尔伯克改良依格尔培养基（DuLbecco’sModifiedEagleMedium）FBS：胎牛血清（FetalBovineSerum）MA104细胞：恒河猴肾细胞（Rhesuskidneycell）PBS：磷酸盐缓冲盐水（PhosphateBufferSaline）PCR：聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction）TCID50：半数组织培养物感染量（MedianTissueCultureInfectiveDose）5生物安全措施样品处理的生物安全措施符合GB19489的规定。样品采集的生物安全措施符合GB/T27401的规定。6病原牛轮状病毒属于呼肠孤病毒科，轮状病毒属，病毒颗粒无囊膜，近似球形，直径约70nm～75nm，具有外、中、内三层衣壳，每层均为20面体对称。基因组为线状双股RNA。7临床诊断流行病学不同年龄和品种牛均可感染BRV，3周龄内牛最易感，多发生于1周龄内的犊牛。传染源病牛和带毒牛是本病自然流行的传染源，隐性感染牛和痊愈牛可持续排毒。消化道是主要的传播途径。有明显季节性，多发生在晚秋、冬季和早春。临床症状12h～24病理变化病理变化牛轮状病毒感染病理变化主要表现在消化道，肠腔内充满凝乳块和乳汁，小肠肠壁变薄、半透明，肠内容物呈液状、灰黄或灰黑色。结果判定符合6.1、6.2、6.3，可判定为牛轮状病毒腹泻疑似病例。8实验室诊断主要仪器设备T25CO296PCRPCR管、电泳仪、凝胶成像仪、酶标仪。主要试剂PBS2DMEMMA104PCRTaqDNAMarker、TAE。样品采集与处理8.3.1粪便样品3mLPBS的采样管中，编号并记录相关信息。漩涡振荡器充分振荡后，12000r/min4℃离心5min～8min，取上清编号备用。取病死牛小肠及内容物，置于无菌密封袋或采样杯内。称取1g样品置于研钵，充分研磨后加5mLPBS，混匀，8000r/min4℃离心5min，取上清编号备用。一次性采血管采集血液3mL～4mL，犊牛采用颈静脉采血，成年牛采用尾静脉采血。室温静置30min，3000r/min～4000r/min离心5min～10min。分离血清编号备用。样品运输与保存采集的样品应低温运送，尽量12h内运送至实验室。2℃～824-70PBS制成1:4303000r/min离心30min，15000r/min30min40000r/min～50000r/min离心3h～4h1～2，2%MA104细胞可用于牛轮状病毒分离培养。1～2×106个毫T255%CO23724h～481:53000r/min4℃离心10µm10µg/mL～20µg/mL37℃处理0.5h～13瓶10℃吸附1h20min0.5µg/mL～2µg/mL5%CO237℃静置培养。4d～5dCPE，且8070CPE3盲传将第代无CPE，5000r/min4℃离心5min～8minCPECPE，达到80-70）1～2×106个/mL，于96100µL1/置于5%CO23724。用DMEM℃水浴感作1200µL9645%CO237℃培养，计算每组的TCID50PCRPCRRNA将采集的样品或细胞培养物进行处理，按RNA提取试剂盒方法提取核酸。在-20℃条件下可短时间保存，若需长期保存，应置于-70℃以下条件，避免反复冻融。根据BRVVP6基因设计引物，采用常继涛文章“牛轮状病毒病原流行病学调查、基因重配毒株的构建及二价减毒株的免疫原性评价”中BRV引物序列：BRV-VP6-F：GACGGAGCGACTACATGGT；BRV-VP6-R：GTCCAATTCATACCTGGTGG。按25µL反应体系配制。一步法：模板2µL，上、下游引物各1µL，OnestepTaq酶12.5µL，RNase-FreeH2O8.5µL。两步法：按反转录试剂盒反转为cDNA；模板2µL，上下游引物各1µL，Taq酶12.5µL，RNase-FreeH2O8.5µL。一步法：50℃30min；94℃5min；95℃20s，54℃30s，72℃30s，35个循环；72℃10min。两步法：94℃5min；95℃20s，54℃30s，72℃30s，35个循环；72℃10min。8.5.3.5电泳检测5µL～8µLPCRDNAMarker，于1×TAE8.5.3.6测序分析PCR扩增产物经胶回收纯化后测序分析，于NCBI中Blast分析是否为牛轮状病毒VP6基因。ELISA待检粪便样品按牛轮状病毒抗原诊断ELISA试剂盒方法进行检测。70nm～75nm（见附录当正常对照组孔内细胞单层生长良好，证明试验成立；可根据Reed-Muench法计算中和指数（见附录C），待检血清的中和指数大于50(Log＞1.7)，即可判定为阳性；10～49(Log=1～1.6)为可疑；小于10(Log＜1)为阴性。阳性对照、PCR产物与预期片段大小一致（207bp），同时阴性对照无条带；即判定为阳性。测序分析Blast比对为牛轮状病毒VP6基因，即判定为阳性。8.5.5.4ELISA阳性对照、PCR产物与预期片段大小一致（207bp），同时阴性对照无条带；即判定为阳性。测序分析Blast比对为牛轮状病毒VP6基因，即判定为阳性。8.5.5.4ELISA按ELISA试剂盒要求进行判定，样品结果符合阳性标准即判定为阳性。采用中和试验（固定病毒-稀释血清法）进行血清学检测。发病初期和发病后2周各检测1次。于1.5mL离心管中加入DMEM培养基，每管100µL；取56℃，30min灭活的血清100µL加入管内，从第一个管开始做10倍连续稀释，从最后一管内弃去100µL液体。感作每个不同稀释度的血清内加入100µLBRV病毒液，充分混匀，37℃水浴感作1h。接种取200µL9641:10BRV1:54BRV100～10-3的4孔。将细胞板置于5%CO2培养箱37℃培养，连续观察5d～7d，观察并记录各孔CPE。CPEReed-Muench法BRV1:5发病初期和发病后2周中和试验结果均为阳性，且发病后2周抗体效价达发病初期的4倍，即判定为牛轮状病毒感染。9综合判定疑似符合6.1、6.2、6.3，可判定为牛轮状病毒腹泻疑似病例。符合6.16.2符合6.16.2PCRELISA检测）符合6.1、6.2、6.3，同时符合7.6.6，可确诊牛轮状病毒腹泻。附录A（PBSNaCl 8gKCl 0.2gNa2HPO4 1.44gKH2PO4 0.24g蒸馏水定容至800mL，HCl调其pH至7.4左右，加蒸馏水定容至1000mL，121℃15min高压灭菌。DMEM培基 44.5mLFBS 5mL青链素(10000U/mL) 500µL混合均匀后，4℃密封保存，建议现配现用。DMEM培养基DMEM培养基胰酶青链霉素(10000U/mL)44.5mL0.25g/mL500µL混合均匀后，4℃密封保存，建议现配现用。A.450×TAE三羟甲基氨基甲烷（Tris）EDTA-2Na冰乙酸242g37.2g57.1mL942.9mLTrisEDTA-2Na800mL1moL/LNaOH调pH值至8.3，灭菌去离子水定容至1000mL后，室温保存。使用时稀释50倍即为1×TAE电泳缓冲液。附录B（）70nm～75nm图B.1牛轮状病毒粒子电镜图图B.1牛轮状病毒粒子电镜图附录C（规范性）中和试验结果计算方法中和指数=待检血清组TCID50/对照组TCID50待检血清的中和指数大于50(Log＞1.7)，即可