细胞工程胚胎工程

关于细胞工程胚胎工程第1页，共56页，2022年，5月20日，23点26分，星期五一、概述胚胎工程广义的胚胎工程：或叫胚胎技术,是生物工程的一个分支，是动物生物工程的主干。它是以胚胎移植为基础，以转基因、细胞融合、干细胞技术为中心，通过人工操作胚胎，定向改变动物性状使之为人类造福的一系列生物技术的总称。狭义的胚胎工程：俗称“借腹怀胎”，是指于着床前自一母体（供体）收集胚胎，移植到另一母体（受体）内完成妊娠的过程。在畜牧业上，供体一般为优秀母畜，而受体一般为品质较差些的母畜。胚胎工程的操作对象：生殖细胞，受精卵及早期胚胎细胞第2页，共56页，2022年，5月20日，23点26分，星期五二、胚胎发育的基本过程和机制高等动物的胚胎发育包括受精、卵裂、囊胚、原肠胚、中胚层及体腔形成、胚层分化等主要阶段。低等动物因进化地位不同，其胚胎发育则缺少相应的后几个阶段。第3页，共56页，2022年，5月20日，23点26分，星期五（一）胚胎发育的基本过程1.生殖细胞的发生2.受精3.早期胚胎发育过程第4页，共56页，2022年，5月20日，23点26分，星期五哺乳动物的生殖是一个相当复杂的生命现象，在胚胎早期，生殖细胞首先与体细胞分离，形成的细胞为原生殖细胞(primordialgermcell，PGCs)：卵原细胞（oogonia）和精原细胞（spermtoginia）其后，经过性别决定和将要进行的性别分化，形成两种生殖细胞。

1.生殖细胞的发生第5页，共56页，2022年，5月20日，23点26分，星期五卵子的发生（oogenesis）：卵子的发育过程中，二倍体的卵原细胞(oogonia)在卵巢内进行几次有丝分裂后，进入减数分裂。进入减数分裂后，初级卵母细胞停留在第一次减数分裂的前期，不再增殖，因此胚胎这个时期的卵母细胞数目就是一个雌性哺乳动物一生所拥有的全部卵细胞总数。第6页，共56页，2022年，5月20日，23点26分，星期五哺乳动物以及其他的许多脊椎动物的卵细胞发育在出生后停止数月（鼠）或数年（人类），直到雌性动物发育到性成熟才继续发育。青春期之后，卵母细胞进一步发育，在体积上增加约1000倍，减数分裂继续进行。哺乳动物减数分裂进行至第二次减数分裂中期后再一次发生暂停，直至受精后才完成减数分裂。第7页，共56页，2022年，5月20日，23点26分，星期五哺乳动物卵子发生的模式

第8页，共56页，2022年，5月20日，23点26分，星期五精子发生（spermatogenesis）:胚胎睾丸内产生精子的生殖细胞在胚胎期不进行减数分裂，而是停留在有丝分裂细胞周期的早期阶段，称为精原细胞（spermatoginia），出生后继续进行有丝分裂。动物性成熟后，这些精原细胞形成精母细胞。每个精母细胞经减数分裂形成4个单倍体的精细胞，通过成熟过程形成4个精子。精子终生都可产生，体积较小，一般具有头部、颈部和尾部，能运动。第9页，共56页，2022年，5月20日，23点26分，星期五精子的结构第10页，共56页，2022年，5月20日，23点26分，星期五Thestagesofoogenesisandspermatogenesis

第11页，共56页，2022年，5月20日，23点26分，星期五2.受精精子的成熟与获能(2)卵子的成熟与排放(3)顶体反应(4)多精受精的阻断(5)卵子的激活第12页，共56页，2022年，5月20日，23点26分，星期五(1)精子的成熟与获能哺乳动物的精子离开精巢后并没有受精能力，必须要经过成熟和获能才能使卵子受精。精子的成熟：精子在附睾中成熟。在附睾中多种物质的作用下，精子质膜的脂类、糖蛋白、唾液酸、吸收抗原、表面ATP等许多成分发生了变化，负电荷增加，与凝集素的结合力也发生改变。第13页，共56页，2022年，5月20日，23点26分，星期五精子的获能：精子在生殖道中停留一段时间后才具备受精能力，这一现象称为精子的获能（capacitation）。精子的获能过程是多时期、多步骤的复杂变化过程，一般认为获能的第一阶段是脱出精子表面的抗原物质和去能因子（decapacitationfactors,DF），增强了膜通透性。第二阶段是精子细胞膜蛋白发生变化，即发生顶体反应。精子在体外也能完成获能（卵泡液、输卵管分泌物、血清、房水等）。pH、Ca2+等环境条件对获能也有影响。

精子在获能过程中发生一系列的形态及生理生化的变化，呼吸明显加强，运动形态和速度也发生很大变化，有直线前进变为曲线运动。第14页，共56页，2022年，5月20日，23点26分，星期五精子的行进：在正常生殖过程中，精子在阴道和子宫内的运动速度很快，十几分钟即达到输卵管，积聚在输卵管峡部下2－3cm处，在此停留十几到几十个小时，然后继续上行，只有少数精子可以达到输卵管壶腹部，在此与刚排出的卵相遇，完成受精过程。第15页，共56页，2022年，5月20日，23点26分，星期五（2）卵子的成熟与排放卵母细胞的发育与卵泡细胞关系密切，卵母细胞与卵泡细胞构成卵泡（又称滤泡，follicles），根据其发育程度可分为原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡、成熟卵泡等。原始卵泡由一个初级卵母细胞和一层扁平的卵泡细胞构成，位于卵巢皮质的浅层。初级卵泡的初级卵母细胞已经增大，由单层和多卵泡细胞构成。次级卵泡的卵泡细胞数量和层数增加，卵泡体积增大，在卵泡细胞间出现腔隙，这些腔隙逐渐合并，不断扩大，形成一个较大的卵泡腔。第16页，共56页，2022年，5月20日，23点26分，星期五

排卵ovulation：随着卵泡的增大，逐渐向卵巢表面突出，在胶原酶和透明质酸酶作用下，卵泡破裂，卵细胞、透明带和放射冠随卵泡液一起排出，经腹膜腔进入输卵管的过程。在排卵前，初级卵母细胞完成第一次减数分裂，形成一个较大的次级卵母细胞和一个很小的第一极体。次级卵母细胞立即进行第二次减数分裂，但停止于分裂中期，若24h内不能受精，就会退化。若24h能受精，它会很快完成第二次减数分裂，形成一个成熟的卵细胞和一个第二极体。第17页，共56页，2022年，5月20日，23点26分，星期五（3）顶体反应顶体(acrosome)：精子头的顶端特化的小泡，它是由高尔基体小泡发育而来。顶体含有各种水解酶类，包括酸性磷酸酶、蛋白水解酶、透明质酸酶等，实际上，顶体是一种特化的溶酶体。顶体反应：是受精作用的反应之一，受钙离子的调节。反应过程较长，包括顶体受体的激活、顶体膜与精细胞质膜融合、顶体中水解酶的释放、卵细胞外被（透明带）的水解等，最终导致精细胞质膜与卵细胞质膜的融合。

第18页，共56页，2022年，5月20日，23点26分，星期五（4）多精受精的阻断多精受精阻断（blocktothepolyspermy）:精子穿入激活了的卵细胞内的一种阻断机制，阻止另外的精子再进入卵内。一旦第一个精子与卵细胞质膜融合，多精受精阻断的主要机制立刻会发挥作用。重要性：多个精子细胞核进入卵内，就会有多余的染色体和中心体，最终导致不正常的发育。第19页，共56页，2022年，5月20日，23点26分，星期五阻止多精受精的机制——卵膜的变化精子与卵细胞质膜融合后，会引起钙流的变化，激发卵质膜下皮层颗粒（皮层颗粒是卵内一种特殊的、由膜包围的一种分泌颗粒,它位于质膜之下

）的释放。皮层反应起到阻止多精受精的结果。第20页，共56页，2022年，5月20日，23点26分，星期五（5）卵子的激活受精时，卵子被激活，组织与减数分裂某一阶段的卵细胞重新启动，使减数分裂得以完成，精卵原核融合形成合子。同时也使受精卵发生一系列的变化，如蛋白质的合成增加、细胞开始分裂。作用机理：自由钙离子的突然增加在这一过程中起到重要的作用。钙离子波能够激活依赖钙调蛋白的蛋白激酶Ⅱ，此酶的活化导致卵细胞中周期蛋白(成熟促进因子MPF的组分之一)的降解，使其得以完成减数分裂。第21页，共56页，2022年，5月20日，23点26分，星期五3.早期胚胎发育过程卵裂cleavage：受精卵不生长而连续分裂，形成无数小细胞，叫分裂球blastomere。由于不同动物卵细胞内卵黄多少及其在卵内分布情况的不同，卵裂方式不同。桑葚胚：动物早期胚胎发育的一个阶段，受精卵经过多次分裂，成为由数十至数百个细胞组成的形如桑椹的实心胚胎。例如，哺乳动物的受精卵在受精72h,分裂为12-16个细胞，形成桑葚胚。囊胚blastula：卵裂最终形成球形的中空球形胚，囊胚中间的腔称为囊胚（blastocoel），

囊胚壁的细胞层称为囊胚层（blastoderm）。第22页，共56页，2022年，5月20日，23点26分，星期五胚泡：在哺乳类发生早期，称卵裂期终了的胚胎为胚泡。哺乳类的卵进行完全卵裂而形成卵裂球的团块，不久在团块内部生出空腔，逐渐扩大，最后成为由一层细胞围成的泡状体，并从壁的一侧有一细胞团块向内腔突出，这样的泡状体就是胚泡。胚泡由三部分构成即①滋养层（trophoblast）②胚泡腔(blastocoele)③内细胞群(innercellmass)。

胚泡吸收子宫的营养迅速增大，从一直包围的透明带中释放出来，开始逐渐陷入

子宫内膜，称为植入（implantation）或着床（imbed）第23页，共56页，2022年，5月20日，23点26分，星期五原肠胚gastrula

：囊胚进一步发育进入原肠胚形成阶段，此时胚胎分化出内，外两胚层和原肠腔。其形成方式在各类动物中不同，包括内陷、内移、分层、内转外包。

中胚层及体腔的形成：绝大多数多细胞动物除了内、外胚层之外，在内外胚层之间还进一步发育，形成中胚层（mesoderm）。在中胚层胚层的分化：动物体的组织器官都是从内、中、外三个胚层发育分化而来的。第24页，共56页，2022年，5月20日，23点26分，星期五（二）胚胎发育的基本机制1.细胞分化2.细胞分化3.模式形成4.形态发生5.生长发育通常包括5种主要的机制：第25页，共56页，2022年，5月20日，23点26分，星期五细胞分裂：细胞分裂是胚胎发育的基础，模式建立、形态发生、细胞分化及生长都是通过细胞分裂过程完成的。2.细胞分化：细胞分化是发育的中心问题。胚胎通过细胞分化在结构和功能上出现差异。这种差异来自基因的差异表达、细胞的行为。外界信号和环境可诱导细胞产生分化。细胞的分化命运是在不同的时间决定的，且决定的程度早期的胚胎细胞较晚期的小。3.模式形成、形态发生以及生长第26页，共56页，2022年，5月20日，23点26分，星期五三、体外受精体外受精（invitrofertilization,IVF），亦称试管动物技术，是指把动物的卵子和精子取出在试管内混合，受精而形成胚胎的过程。体外受精胚胎一般在体外发育到一定时期后移植到受体雌性动物输卵管或子宫内，妊娠到产仔。基本原理：是人工模拟体内环境，包括营养、温度、湿度、气体,渗透压、pH等，使卵丘卵母细胞复合体中的初级卵母细胞成熟，同时使精子获能，完成受精。第27页，共56页，2022年，5月20日，23点26分，星期五体外受精的研究历史：1951年，张明觉和Austin同时发现哺乳动物精子获能现象。1959年，张明觉从交配12h的母兔子宫冲取精子，从另外2只超数排卵处理的母兔输卵管中收集卵子，在体外配置的溶液中完成受精过程。将正常卵裂36枚胚胎移植到6只受体兔输卵管中，4只怀孕，产下15只健康子兔。这是世界上首批试管动物，标志着体外受精技术的建立。20世纪80年代中期，发展迅速。试管小鼠（Whittingham1968年）,大鼠（Toyoda，1974年），婴儿（Steptoe,1978年），牛（Brackett，1982、年），山羊（Hamda，1985年），绵羊（Hanada，1985年），猪（Chang，1986年）相继出生。英国学者Edward和Steptoe最早开展了人类体外受精和胚胎技术的研究，将体外受精后发育到8细胞期的人早期胚胎移植到母亲子宫内继续发育。在1978年7月26日诞生了世界第一例“试管婴儿”。第28页，共56页，2022年，5月20日，23点26分，星期五美籍生物学家张明觉张明觉博士是美国著名生物学家，美国科学院院士，由于在口服避孕药和人工体外受精的科学研究中取得开拓性的显著成就而被人们誉为“试管婴儿的先驱”、“避孕药之父”。1908年出生,1933年他毕业于清华大学1938年，张明觉赴英国爱丁堡大学农学系留学，次年转入剑桥大学学习，主攻动物育种和人工授精。1941年，他获得生物学博士学位。1945年，张明觉移居美国，在麻省渥斯特生物实验研究所进行卵子移殖的研究，先后担任副研究员、高级研究员兼首席科学家，尔后他又兼任波士顿大学教授，并加入了美国籍。第29页，共56页，2022年，5月20日，23点26分，星期五体外受精技术：

1.卵母细胞的采集和体外培养

2.精子的获能

3.体外受精

4.受精卵的体外培养

5.胚胎移植第30页，共56页，2022年，5月20日，23点26分，星期五卵细胞的采集和成熟培养（1）卵细胞的采集

1）超数排卵：利用促性腺激素处理，使得卵巢中有更多的卵泡发育，更多的卵被排出，这个过程就称为超数排卵（superovulation）。通过从输卵管中冲取的方式获得成熟的卵子。

2）从活体卵巢中采集卵母细胞：借助超声波探测仪、内镜或腹腔镜直接从活体动物的卵巢中吸取卵细胞。3）从屠宰后母畜卵巢上采集卵母细胞：从刚屠宰的母畜体内摘出卵巢，无菌条件下用注射器或真空泵抽吸卵巢表面一定直径卵泡中的卵母细胞。第31页，共56页，2022年，5月20日，23点26分，星期五（2）卵母细胞的选择和成熟培养采卵获得的卵母细胞绝大部分与卵丘细胞形成卵丘卵母细胞复合体（cumulusoocytecomplesx）,根据卵母细胞的形态规则，细胞质均匀程度及外围卵丘细胞包围情况，挑选A,B级卵母细胞，洗涤后，在成熟培养基中培养。观察出现放射冠后，备用。超数排卵采集的卵母细胞已经在体内发育成熟，因而不需培养可直接与精子受精。第32页，共56页，2022年，5月20日，23点26分，星期五2.精子的获能处理

获能有体内和体外方法：

•体内获能是从交配的母畜子宫内冲取精子用于受精。

•体外获能分两步：精子洗涤除去杂质、死精子、低活力精子、冻精保护液及稀释液，然后使用高离子强度液，钙离子载体，肝素等促使钙离子进入精子顶体，刺激精子内部pH升高，诱发精子获能。第33页，共56页，2022年，5月20日，23点26分，星期五3.体外受精将获能的精子和成熟的卵子置于受精液中共同培养，使之完成受精过程。为了提高体外受精的成功率，可以借助显微操作仪将精子直接注入卵母细胞质（ICSI）或透明带(SUZI)下，完成受精过程。显微受精技术避免了由透明带或卵质膜所形成的受精障碍，使受精率和准确率大大提高。第34页，共56页，2022年，5月20日，23点26分，星期五4.受精卵的体外培养受精卵需要在培养液或输卵管中发育到桑葚胚或囊胚阶段，移植到受体后才能获得较高的妊娠率。发育阻滞：在化学组分确定的培养基中，早期胚胎往往不能完成从受精卵到囊胚的发育全过程,而停顿在某个特定的发育时期.这种现象被称为“发育阻滞”。克服发育阻滞的方法：1.改进培养液的成分，改善培养条件，满足发育所需物质，去除不利成分。

2.利用体细胞共同培养体系，提供发育所需物质条件。5.胚胎移植第35页，共56页，2022年，5月20日，23点26分，星期五体外受精的意义及用途：1.可用于研究哺乳动物的配子发生、受精、和胚胎早期发育机制。

2.治疗人类男性和雄性动物的生殖不育

2.在充分利用优良品种资源、缩短家畜繁殖周期、加快品种改良速度方面有重要价值。

3.是哺乳动物胚胎移植、克隆、转基因和性别控制等现代生物技术不可缺少的组成部分。总之，体外受精技术已经广泛应用于发育生物学、医学、畜产学、实验动物学等各个领域。

第36页，共56页，2022年，5月20日，23点26分，星期五体外受精存在的问题：1.效率有待提高2.体外培养体系有待完善3.基础理论研究有待加强第37页，共56页，2022年，5月20日，23点26分，星期五四、胚胎移植技术胚胎移植（embryotransfer)：俗称“借腹怀胎”，“借劣质动物之腹怀优秀个体之胎”。

将良种母畜（供体）配种后的早期胚胎，移植到另外一头与供体生理状态相同的母畜（受体）体内，这个来自供体的胚胎能够在受体的子宫着床，并继续生长和发育，最后产下供体的后代。供体一般为优秀母畜，而受体一般为品质较差些的母畜。第38页，共56页，2022年，5月20日，23点26分，星期五第39页，共56页，2022年，5月20日，23点26分，星期五第40页，共56页，2022年，5月20日，23点26分，星期五羊“妈妈”带着没有一点血缘关系的羊“孩子”在晒太阳。

第41页，共56页，2022年，5月20日，23点26分，星期五（一）胚胎移植的生理学基础

•成年母畜卵巢上存在数千到上万个卵泡，在外源激素作用下，每个发情期的卵泡发育和排卵数可达数十个

•每个发情周期生殖器官都有一个孕向发育

•早期胚胎处于游离状态

•胚胎发育不存在免疫问题

•胚胎发育到一定阶段会与子宫发生生理和组织联系•胚胎的遗传性不受受体的影响第42页，共56页，2022年，5月20日，23点26分，星期五供体和受体在分类学上的相同属性动物生理上的一致性：受体和供体在发情时间上的同期性胚胎的质量：胚胎必须是正常的，并在处理过程中不受不良因素的影响（二）胚胎移植的基本原则第43页，共56页，2022年，5月20日，23点26分，星期五（三）胚胎移植的技术程序供体应具有相当高的育种价值供体生殖机能应处于较高的状态：产后60天以上，无生殖系统疾病，体质强健受体应容易购买，繁殖性能好，对地方适应性强，体型中上等，非优良品种受体健康状况良好，已进入发情季节供受体发情时间应接近或一致1.供体和受体的选择第44页，共56页，2022年，5月20日，23点26分，星期五

超数排卵:利用促性腺激素处理，使得卵巢中有更

多的卵泡发育，更多的卵被排出。2.超数排卵处理意义：让每个供体提供更多的胚胎

第45页，共56页，2022年，5月20日，23点26分，星期五3.同步发情同步发情又称同期发情，是指利用某些激素制剂人为地控制并调整一群母畜发情周期的进程，使之在预订时间内集中发情。

常用的发情技术：a向母畜群同时施用孕激素，抑制卵泡的发育和发情，经过一定时间同时停药，随之引起同期发情。（原理，施药期间，外源孕激素代替了内源孕激素，形成人为黄体期，推迟了发情期的到来）

b利用前列腺素使发情提前到来。

第46页，共56页，2022年，5月20日，23点26分，星期五必须用优秀的种公畜进行多次配种，一般隔8-12小时进行一次配种，直到发情结束。配种前应对种公畜的精液进行质量检查。也可以采用人工授精的方法，多次输精。4.供体母畜配种第47页，共56页，2022年，5月20日，23点26分，星期五5.胚胎采集手术法收集胚胎

输卵管冲胚（输精后3-4d）子宫角冲胚（树精后5d）

非手术法收集胚胎二路式冲卵器应用第48页，共56页，2022年，5月20日，23点26分，星期五6.胚胎的检查与鉴定检胚：收集到的冲洗液静置，移去冲洗液，检查胚胎数量，观察胚胎质量。无卵裂现象（未受精）和异常卵（外膜破裂、卵裂球破裂等）都不能用于移植。拣胚：将正常发