习题2核酸分子杂交技术

习题2核酸分子杂交技术习题2核酸分子杂交技术习题2核酸分子杂交技术习题2核酸分子杂交技术编制仅供参考审核批准生效日期地址：电话：传真:邮编:第二章核酸杂交技术（一）名词解释1．原位杂交 2．核酸分子杂交技术3．探针4．反向点杂交5．缺口平移标记法6．随机引物标记法7．末端标记法 8．Southernblot杂交 9．荧光原位杂交10．菌落杂交（二）选择题【A型题】1．DNA链的Tm值主要取决于核酸分子的（）AG－C含量BA－T含量CA－G含量DA－C含量ET－G含量2．液相杂交是下列哪一种（）ASouthem印迹杂交BNorthem印迹杂交CDot印迹杂交DSlot印迹杂交ERPA实验3．研究得最早的核酸分子杂交种类是（）A菌落杂交BSouthern杂交CNorthern杂交D液相杂交E原位杂交4．Southern杂交通常是指（）ADNA和RNA杂交BDNA和DNA杂交CRNA和RNA杂交D蛋白质和蛋白质杂交EDNA和蛋白质杂交5．最容易降解的核酸探针是()AcDNA探针BdsDNA探针CssDNA探针DgDNA探针E:RNA6．探针基因芯片技术的本质就是（）A核酸分子杂交技术B蛋白质分子杂交技术C聚合酶链反应技术D基因重组技术E酶切技术7．DNA探针的长度通常为()A1000～2000个碱基B500～1000个碱基C400～500个碱基D100～400个碱基E.<100个碱基8．寡核苷酸探针的最大的优势是（）A杂化分子稳定B可以区分仅仅一个碱基差别的靶序列C易标记D易合成E易分解9．在Southern印迹中常用的核酸变性剂是()A甲醛B乙醛C氢氧化钠D碳酸钠E盐酸10．盐酸硝酸纤维素膜最大的优点是（）A脆性大B本底低C共价键结合D非共价键结合E高结合力11．最常用的DNA探针标记方法是()A随机引物B切口平移C3′-末端标记D5′-末端标记EPCR法12．为了除去探针，重复使用滤膜，以下哪种情况不可以发生（）A探针在预杂交与除去探针之间的过程中曾经干燥过B探针在预杂交与除去探针之间的过程中曾经湿润过C探针在预杂交与除去探针之间的过程中曾经温浴过D探针在预杂交与除去探针之间的过程中曾经漂洗过E探针在预杂交与除去探针之间的过程中曾经标记过13．5′一末端的DNA探针标记主要依靠的酶是()AT4多聚核苷酸激酶B末端转移酶CAKPDDNApolⅡEDNApol14．血友病是一种（）A染色体病BX连锁遗传病C先天性代谢缺陷病D先天畸形E常染色体隠性遗传病15．预杂交中最常用的封闭剂是()ADenhavdt's溶液B5×TBEC1×TBED1×TAEE1×TPE16．检测目标是RNA的技术是（）ASouthern杂交BWestern杂交CNorthern杂交DEastern杂交E杂交淋巴瘤17．检测靶序列是DNA的技术是（）ASouthern杂交BWestern杂交CNorthern杂交DEastern杂交E杂交淋巴瘤18．DNA双螺旋之间氢键断裂，双螺旋解开，DNA分子成为单链，这一过程称（）A变性B复性C复杂性D杂交E探针19．具有碱基互补区域的单链又可以重新结合形成双链，这一过程称（）A变性B复性C复杂性D杂交E探针20．一种标记核酸与另一种核酸单链进行配对形成异源核酸分子的双链，这一过程称（）A变性B复性C复杂性D杂交E探针21．点/狭缝杂交可以用于（）A快速确定是否存在目的基因B不仅可以检测DNA样品中是否存在某一特定的基因，而且还可以获得基因片段的大小及酶切位点分布的信息C用于基因定位分析D阳性菌落的筛选E蛋白水平的检测22．放射自显影时反射光产生的潜影在低温下较稳定，最适温度是()A-70℃B-30℃C-20℃D-10℃E4℃23．Southern印迹杂交可以用于（）A不仅可以检测DNA样品中是否存在某一特定的基因，而且还可以获得基因片段的大小及酶切位点分布的信息B检测的目标是RNAC用于基因定位分析D阳性菌落的筛选E蛋白水平的检测24．寡核苷酸探针的Tm简单计算公式为()ATm=4(G+C)+2(A+T)BTm=2(G+C)+4(A+T)CTm=6(G+C)+4(A+T)DTm=2(G+C)+6(A+T)ETm=6(G+C)+2(A+T)25．Northern印迹杂交可以用于（）A快速确定是否存在目的基因B不仅可以检测DNA样品中是否存在某一特定的基因，而且还可以获得基因片段的大小及酶切位点分布的信息C检测的目标是RNAD用于基因定位分析E阳性菌落的筛选2626．荧光原位杂交可以用于（） A快速确定是否存在目的基因B检测的目标是RNAC用于基因定位分析D阳性菌落的筛选E蛋白水平的检测27．以等位基因特异的寡核苷酸探针杂交法诊断某常染色体隐性遗传病时，若能与突变探针及正常探针接合，则该样本为（）A正常人B杂合体患者C纯合体患者D携带者E不能确定28．在pH为下述何种范围时，Tm值变化不明显()ApH为3～5BpH为4～5CpH为5～6DpH为5～9EpH为8～1129．一般来说，设计的寡核苷酸探针的长度为（）A2-10bpB17-50bpC60-100bpD100-200bpE200-300bp30．变性剂可使核酸的Tm值降低，常用的变性剂是()A甲酰胺B氢氧化钠C浓盐酸D稀盐酸E甲醇31．下列有关cDNA探针的描述不正确的为（）A利用mRNA通过RT-PCR在体外反转录可制备大量的cDNA探针BcDNA探针不包含内含子CcDNA探针不包含大量的高度重复序列D由于cDNA探针自身所携带的poly（dT），有可能产生非特异性杂交的问题EcDNA探针合成方便，成为探针的重要来源32．一般来说核酸杂交的温度低于其Tm值的多少度进行()A15～25℃B10～15℃C5～10℃D30～40℃E40～50℃33．对于寡核苷酸探针，杂交温度一般般低于其Tm值()A30～40℃B20～30℃C15～30℃D10～15℃E5℃34．一般情况下，不含变性剂甲酰胺时，杂交反应常在多少℃下进行()A90B80C75D68E5835．在含50%甲酰胺时，杂交反应在多少℃进行()A70B65C55D42E3536．杂交时的温度与错配率有关，错配率每增加1%，则Tm值下降()A℃B1～℃C2～℃D3～3.S℃E4～℃37．RNA/RNA的杂交体的Tm值一般应增加()A1～5℃B5～10℃C10～15℃D15～20℃E20～25℃38．杂交的时间一般为Cot1/2的()Al倍B1～3倍C3～5倍D5～8倍E10倍以上39．为封闭非特异性杂交位点，可在预杂交液中加入()AssDNAB1×SSCC10×SSCD5×TBECE50×TAE40．随机引物法标记探针常用的A、G、C、T聚合体的数目是()A4个B6个C8个D10个E12个【X型题】41．下列哪些是影响DNA复性的因素()ADNA浓度BDNA的分子量C温度D碱基组成EDNA的来源42．DNA探针的优点有（）A制备方法简单BDNA探针易降解CDNA探针的标记方法成熟，有多种方法可以选择D克隆在质粒载体中，可以无限繁殖，取之不尽E单链，不存在竞争性的自身复性43．以下哪些方法可以用于探针的全程标记（）ADNA加尾法BDNA切口平移标记法C随机引物标记法D末端标记E尾端标记44．关于DNA变性的描述正确的是()A二级结构破B一级结构破坏C黏度降低D生物活性丧失E浮力密度增加45．以下哪些因素可以使DNA变性（）A增加溶液的浓度B加热C改变溶液的pH值D有机溶剂E冷藏46．预杂交中，下列能起封闭作用的是()AssDNABBSAC小牛胸腺DNAD脱脂奶粉EDTT47．变性的DNA会发生哪些理化性质的变化（）A粘度下降B沉降速度增加C浮力下降D紫外光吸收增加E紫外光吸收减少48.下列物质适于非放射性探针标记的是()AAKPBACPC生物素D地高辛E荧光素49．关于人工合成的寡核苷酸探针，下列描述正确的是()A特异性高B可依赖氨基酸序列推测其序列C分子量小D可用于相似基因顺序差异性分析E可用末端转移酶进行5′端标记50．通过哪些措施可以提高杂交反应的速度（）A采用大片段探针B少量的反应体积C高反应温度D不断的振摇E大量的反应体积51．关于切口平移法下述正确的是()A可标记线性DNAB可标记松散螺旋DNAC可标记超螺旋DNAD可标记存在缺口的双链DNAE可标记随机引物52．以下哪些方法可以用于从凝胶上转移DNA（）A毛细转移B真空转移C负压转移D电泳转移E冷冻转移53．关于随机引物法标记探针下述正确的是()A可标记单链DNAB可标记双链RNAC可标记单链RNAD比活性高达108cpm／µgDNA以上E常经过SephadexG-50纯化才可使用54．可以采用哪些方法来标记探针（）A杂交标记法B切口平移标记法C5’-末端的标记D3’-末端的标记E化学法延长标记55．整个杂交反应主要以下哪些步骤组成（）A预杂交B杂交C洗脱D固定E转移56．放射自显影可以被分为（）A直接放射自显影B氧化显影C封闭显影D间接放射自显影E固定显影57．关于电转移下列描述正确的是()A快速、高效B需要特殊设备C缓冲液用TAE或TBED可产生高温E常用NC膜作为支持介质58．预杂交的主要目的是（）A平衡滤膜B封闭非特异性杂交的位置C提高杂交信号的检测效率D便于从滤膜上除去探针E清除用于杂交反应检测的显色物质59.关于非放射性探针标记，下列描述正确的是()A对人体危害小B需要特殊设备C可长时间使用D灵敏度不如放射性探针E重新杂交新探比较容易60．对于改变DNA片段长度的突变，可以由于缺失或插入产生，或由于限制性酶切位点改变而导致限制性片段长度改变。可以通过哪些方法检测（）APCR扩增BRAPDCSoutherm印迹杂交DNorthern印迹杂交E以上都不是61．重组DNA的筛选可用核酸分子杂交的方法，常用于检测DNA的杂交方法有哪些（）A菌落印迹杂交BNorthern印迹杂交CWestern印迹杂交D原位杂交E斑点杂交62．关于RNA探针的描述下列正确的是()A可用于随机引物标记B特异性高C灵敏度高D可用非同位素标记法标记E不易降解63．下列哪些可以作为核酸探针使用（）AmicroRNAB单链DNAC寡核苷酸DmRNAE双链RNA64．关于核酸探针的描述下列正确的是()A可以是DNAB可以是RNAC可用放射性标记D可用非放射性标记E必须是单链核酸（三）问答题1．根据哪三种不同的分类标准可以将杂交分为哪几类2．简述反义核酸技术的基本原理及其应用范围3．试述Northernblot杂交的操作步骤4．什么是肽核酸并简述其应用5．请举例说明杂交技术在临床检验科基因诊断方面的应用。6．请叙述杂交探针标记方法的种类。7．简述直接放射自显影的原理。

参考答案名词解释1．原位杂交：是首先应用核酸探针与组织或细胞中的核酸按碱基互补配对原则进行特异性结合形成杂交体，然后应用组织化学或免疫组织化学方法在显微镜下进行细胞内基因定位或基因表达的检测技术。2．核酸分子杂交技术：单链的核酸分子在合适的条件下，与具有碱基互补序列的异源核酸形成双链杂交体的过程称作核酸分子杂交。利用核酸分子杂交检测靶序列的一类技术称核酸分子杂交技术。3．探针：是一段单链或双链核苷酸，用放射性核素或非放射性物质标记其末端或全链，可依碱基配对规律与具有互补序列的待测核酸进行杂交，以探测它们的同源程度。这一段标记的核苷酸被称为探针。4．反向点杂交：是将多种探针固定在同一膜上，同时参与检测的样品DNA又互不干扰，故能一次性筛查出多种不同的序列，而不是像传统的杂交法，一次仅能检测一个未知序列。5．缺口平移标记法：该法是利用低浓度DNaseI在DNA双链上随机切开若干个切口，然后利用E.coliDNA聚合酶I的5’3’外切酶活性和5’3’聚合酶活性，使DNA链上的核苷酸不断被切除，而带放射性核素标记的dNTP不断地被填入缺口位置，从而形成两条链被均匀标记的高放射活性的探针。6．随机引物标记法：随机引物是各种可能序列的寡核苷酸混合物，可以人工合成，也可以使用小牛胸腺DNA的DNaseI降解物。随机引物在较低的退火温度下，能与各种单链DNA模板结合。首先使双链DNA分子变性成为单链，然后退火使随机引物结合于两条单链模板上，当反应液中存在的4种dNTP中有一种带放射性核素标记时，在DNA聚合酶催化下合成新的带标记的DNA链。反应结束后经纯化即可得到标记的DNA探针。7．末端标记法：寡核苷酸探针由于较其他类型的探针短，需要采用末端标记法。该法需要DNA分子的末端带有羟基，而人工合成寡核苷酸的5’端本身即为羟基。其原理是利用多核苷酸激酶将[-32P]ATP分子上7位磷酸基转移至寡核苷酸链的5’末端，末端标记也可在3’端进行。8．Southernblot杂交：是研究DNA图谱的基本技术，在遗传诊断、DNA图谱分析及PCR产物分析等方面有重要价值。Southern印迹杂交的方法是将标本DNA用限制性内切酶消化后，经琼脂糖电泳分离各酶切片段，接着，使酶切片段DNA发生变性并转印到一固相支持物(通常是硝酸纤维素薄膜或尼龙膜)上，经固定后和标记探针进行杂交。这种方法不仅可以检测DNA样品中是否存在某一特定的基因，而且还可以获得基因片段的大小及酶切位点分布的信息。9．荧光原位杂交：是一种利用非放射性的荧光信号对原位杂交样本进行检测的技术。它将荧光信号的高灵敏度、安全性，荧光信号的直观性和原位杂交的高准确性结合起来，通过荧光标记的DNA探针与待测样本的DNA进行原位杂交，在荧光显微镜下对荧光信号进行辨别和计数，从而对染色体或基因异常的细胞、组织样本进行检测和诊断，为各种基因相关疾病的分型、预前和预后提供准确的依据。10．菌落杂交：用于重组细菌克隆筛选的固相杂交，称菌落杂交，主要步骤包括：①菌落平板培养；②滤膜灭菌后放到细菌平板上，是菌落粘附到经适当饱和的吸水纸上；③菌斑溶解产生单练的DNA、固定DNA，用32P标记的探针与菌落进行杂交；④杂交后，洗脱未结合的探针，将滤膜暴露于X线胶片进行放射自显影；⑤将自显影胶片、滤膜、培养平板相比较，就可以确定阳性菌落。（二）选择题【A型题】1．A2．E3．D4．B5．E6．A7．C8．B9．C10．B11．A12．A13．A14．B15．A16．C17．A18．A19．B20．D21．A22．A23．A24．A25．C26．C27．D28．D29．B30．A31．E32．A33．E34．D35．D36．B37．E38．B39．A40.B【X型题】41．ABCD42．ACD43．BC44．ACDE45．BCD46．ABCD47．ABD48．ACDE49．ABCD50．BCD51．ABCD52．ABD53．ABCD54．BCD55．ABC56．AD57．ABCD58．AB59．ABCD60．AC61．ADE62．ABCD63．BCD64．ABCD（三）问答题1．根据哪三种不同的分类标准可以将杂交分为哪几类①根据杂交核酸分子的种类，可以分为DNA与DNA杂交，DNA与RNA杂交，RNA与RNA杂交；②根据杂交探针标记的不同，可以分为同位素杂交和非同位素杂交；③根据杂交介质的不同，可以分为液相杂交、固相杂交和原位杂交；其中固相杂交又可以分为菌落杂交、Southern杂交、Northern杂交、点杂交和狭缝杂交。2．简述反义核酸技术的基本原理及其应用范围反义核酸技术是近几年发展起来的一项新的生物技术。它是根据碱基互补的原理，设计出能特异地同相应靶基因结合的RNA或DNA，从而影响靶基因的转录和翻译，以达到调控靶基因表达的目的。反义核酸技术包括反义RNA技术，反义DNA技术及核酶技术。3．试述Northernblot杂交的操作步骤①RNA的变性琼脂糖电泳；②将硝酸纤维薄膜放在含有RNA电泳条带的凝胶上；③转印盘中的转移缓冲液将逐渐为胶和膜上覆盖的吸水纸吸收，从而利用④毛细作用将胶中的变性RNA分子转移到硝酸纤维薄膜上；⑤转印完成后，使RNA分子固定到膜上；⑥膜上的RNA分子与探针杂交；⑦经放射自显影或其他检测技术显示出杂交区带。4．什么是肽核酸并简述其应用肽核酸是一种全新的DNA类似物，在20世纪90年代由丹麦科学家发明。肽核酸中以中性的肽链酰胺2-氨基乙基苷氨酸键取代了DNA中的戊糖磷酸二酯键，其余结构与DNA相似。PNA可以通过碱基互补配对的形式识别并结合DNA或RNA序列，形成稳定的双螺旋结构。由于PNA不带电荷，与DNA和RNA之间不存在静电斥力，因而结合的稳定性和特异性都大为提高；PNA与DNA或RNA的杂交能力远远优于DNA、DNA或DNA、RNA杂交，表现在很高的杂交稳定性、优良的特异性，而且不被蛋白酶和核酸酶水解等方面。鉴于上述诸多优点，近年来，PNA被广泛应用在许多高科技领域。如：病原体、遗传病的检测，抗癌、抗病毒反义核酸的研究和应用。特别是PNA可取代核酸用于基因芯片的制备，被认为是基因芯片的升级产品。PNA还可用于定量PCR分析。随着对PNA研究的不断深入，PNA将显示出更大的优越性和更为广阔的应用前景。5．请举例说明杂交技术在临床检验科基因诊断方面的应用在临床检验科，杂交技术最常用于基因诊断的例子是镰状细胞贫血病的基因诊断。镰状细胞贫血是一种单基因遗传性疾病，病因是编码血红蛋白的基因发生点突变导致编码链第6位的谷氨酸被缬氨酸取代，表示为6(A3)谷→缬。在血红蛋白基因的碱基序列上表现为第6位密码子GAA突变为GTA，也就是在这一位点发生了A到T的点突变。由于这一突变导致基因内部一个MstII限制性酶切位点丢失，因而针对这一情况，可以设计与-珠蛋白基因杂交的核酸探针。先扩增靶片断，并用MstII消化扩增的DNA片断，电泳分离消化的DNA片断。将DNA片断转印到硝酸纤维素薄膜上，采用Southern杂交技术检测DNA片断。以此将正常人、携带者和患者区分开来。此外,还可以用凝血因子Ⅸ基因探针检测B型血友病，凝血因子ⅩⅢ基因探针检测A型血友病，用胰岛素基因探针检测糖尿病，用苯丙氨酸羟化酶基因探针检测苯丙酮尿症。以上都是杂交技术在临床检验科进行基因诊断的例子。6．请