第八章 典型发酵过程的特性与工业控制 2动物细胞培养课件

发酵工程精品课程/jpkc/fjgc华东理工大学·生物工程学院

发酵工程精品课程http://biotech.ecust.e1第二节动物细胞培养典型过程培养动物细胞培养/jpkc/fjgc第二节动物细胞培养典型过程培养动物细胞培养http2动物细胞和微生物细胞的总体差异内容微生物细胞动物细胞细胞壁普遍存在存在生长速率0.1~0.5h-10.01~0.05h-1需氧量高低营养要求普遍简单复杂CO2需求一些微生物需CO2许多需要CO2形成缓冲液环境影响小大大小范围100~2000nm10000~100000nm接种浓度低高（10-5.ml-1）生长浓度高（109~1010.ml-1）低（106.ml-1）典型过程培养动物细胞培养/jpkc/fjgc动物细胞和微生物细胞的总体差异内容微生物细胞动物细胞细胞壁普3一、动物细胞培养的特性动物细胞培养是指在合适的培养条件下，动物细胞离体生长和增殖，并保持其特性和功能的技术，这些细胞不再形成组织。典型过程培养动物细胞培养/jpkc/fjgc一、动物细胞培养的特性典型过程培养动物细胞培养http://4

1细胞生长缓慢，易污染，培养需用抗生素

2细胞大，无细胞壁，机械强度低，环境适应性差

3需氧少，不耐受强力通风与搅拌

4群体生长效应，贴壁生长（锚地依赖性）

5培养过程产品分布细胞内外，成本高

6原代培养细胞一般繁殖50代即退化死亡

典型过程培养动物细胞培养/jpkc/fjgc

1细胞生长缓慢，易污染，培养需用抗生素

2细胞大，无细5两个专业术语细胞系：首次分离组织的培养称之为原代培养。原代培养物经传代成功后即成细胞系。细胞株：通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质或标记的培养物称为细胞株。典型过程培养动物细胞培养/jpkc/fjgc两个专业术语典型过程培养动物细胞培养http://biote6细胞生长的类型贴壁依赖性来自动物实体组织的大多数细胞需要贴壁单层生长。只要它们没有转化为非贴壁依赖性的必须贴伏在合适的固体介质上并铺展，才能生长。非贴壁依赖性细胞无需贴附到固体介质上就能生存和生长的细胞。来自血液、淋巴系统的细胞和大多数肿瘤细胞常为非贴壁依赖性的，它们形态呈圆形。典型过程培养动物细胞培养/jpkc/fjgc细胞生长的类型典型过程培养动物细胞培养http://biot7生长特性：贴壁依赖型细胞在培养时要贴附于培养（瓶）器皿壁上，细胞一经贴壁就迅速铺展，然后开始有丝分裂，并很快进入对数生长期。一般数天后就铺满培养表面，并形成致密的细胞单层。

典型过程培养动物细胞培养/jpkc/fjgc生长特性：贴壁依赖型细胞在培养时要贴附于培养（瓶）器皿壁上，8贴壁培养的优点：

●容易更换培养液；细胞紧密黏附于固相表面，可直接倾去旧培养液，清洗后直接加入新培养液。

●容易采用灌注培养，从而达到提高细胞密度的目的；因细胞固定表面，不需过滤系统。

●当细胞贴壁于生长基质时，很多细胞将更有效的表达一种产品。

●同一设备可采用不同的培养液/细胞的比例。

●适用于所有类型细胞。

典型过程培养动物细胞培养/jpkc/fjgc贴壁培养的优点：

●容易更换培养液；细胞紧密黏附于固相表面，9.贴壁培养的缺点：与悬浮培养法相比

●扩大培养比较困难，投资大；

●占地面积大；

●不能有效监测细胞的生长；

典型过程培养动物细胞培养/jpkc/fjgc.贴壁培养的缺点：与悬浮培养法相比

●扩大培养比较困难，投资10二、细胞培养物的获得原代培养物在无菌条件下，用镊子和剪刀将切下的组织碎成小块，再用胰蛋白酶等蛋白水解酶处理，使组织解离成单个细胞，放入培养容器中无菌培养。这种原代培养物中含有各种不同分化的细胞类型，它们的生长速率不同，成纤维细胞最易生长，常会在此后的传代培养中占据优势。仔细控制培养基的成分，可以选择性地支持某些细胞类型的生长。典型过程培养动物细胞培养/jpkc/fjgc二、细胞培养物的获得典型过程培养动物细胞培养http://b11典型过程培养动物细胞培养/jpkc/fjgc典型过程培养动物细胞培养http://biotech.ecu12转化细胞正常细胞经过一个转化的过程，丧失了对生长控制的敏感性。转化伴随着染色体模式的改变，二倍体变成异倍体。更典型的表现是，贴壁依赖性细胞对贴壁的依赖及细胞密度的抑制发生改变，虽然也许细胞仍需贴壁生长，但可能生长到不止单层。细胞转化有四种主要途径：①有些细胞在培养中自发转化②化学转化。某些化学致癌物会增加转化频率③病毒转化。④致瘤因子转化典型过程培养动物细胞培养/jpkc/fjgc转化细胞典型过程培养动物细胞培养http://biotech13转化细胞由于有无限寿命，在培养中更易生长，被广泛用于生成生物制品，如重组蛋白药物、病毒疫苗等。但是，人们对她们的安全性仍然非常关心，对可能造成的生物危害性进行严格的检测和控制。典型过程培养动物细胞培养/jpkc/fjgc转化细胞由于有无限寿命，在培养中更易生长，被广泛用于生成生物14肿瘤细胞肿瘤细胞使来自于肿瘤组织的细胞或经肿瘤细胞与其它细胞融合产生的细胞，如杂交瘤细胞。与转化细胞相比，它们是恶性的，基本上是非贴壁依赖性的。肿瘤细胞有很好的增殖特性，生长速率高。对生长因子的依赖程度低，对培养环境的要求也不那么苛刻。。肿瘤细胞的致癌性是造成其难以用于体内治疗产品生产的主要原因。由于近年来分离纯化技术的进步和对这些细胞致瘤性的深刻认识，对其在生产中的应用有所松动，如杂交瘤细胞生产的单克隆抗体已用于体内治疗，C127细胞生成重组蛋白的研究也形成了规模。典型过程培养动物细胞培养/jpkc/fjgc肿瘤细胞典型过程培养动物细胞培养http://biotech15体外培养所需的一般条件适宜的培养皿血清成分370CCO25％95～100％湿度抗生素典型过程培养动物细胞培养/jpkc/fjgc体外培养所需的一般条件典型过程培养动物细胞培养http://16培养基培养基配置考虑的因素的pH多数细胞系在pH7.4下生长得很好。一些正常的成纤维细胞系以7.4~7.7最好，转化细胞系以pH7.0~7.4更合适。缓冲在高细胞密度下，转化细胞系产生大量二氧化碳和乳酸，引起pH下降，需要在培养基中加入缓冲作用的试剂，如碳酸氢钠、HEPES(N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸N-[2-Hydroxyethyl]piperazine-N’-[2-ethanesulfonicacid])典型过程培养动物细胞培养/jpkc/fjgc培养基培养基配置考虑的因素的pH多数细胞系在pH717温度低温下CO2溶解度增加，引起pH变化。黏度培养基的黏度主要受血清含量的影响。在搅拌条件下黏度大则细胞受损伤小。加入羧甲基纤维素或聚己烯基吡咯烷增加培养基黏度典型过程培养动物细胞培养/jpkc/fjgc温度低温下CO2溶解度增加，引起pH变化。典型过程培养18细胞培养基的基本组成1、水细胞培养用的各种液体都要用水来配置，对水的纯度要求很高。通常细胞培养用水的污染物标准可参考医药上注射用水标准，单原则上应高于注射用水标准。2、能源和碳源主要是糖和糖酵解的产物和谷氨酰胺。细胞能用的糖主要是六碳糖，特别是葡萄糖。葡萄糖很容易被大多数细胞转化为乳酸。昆虫细胞更偏爱蔗糖。在多数培养基中谷氨酰胺作为主要的能源和碳源。使用谷氨酰胺最大的问题是它的自发降解，降解量与时间、温度、血清和磷酸浓度有关，降解产物为氨，对细胞有毒性。典型过程培养动物细胞培养/jpkc/fjgc细胞培养基的基本组成典型过程培养动物细胞培养http://b193、氮源氨基酸是组成蛋白质的基本单位，也是细胞合成复杂含氮化合物的前体，还作为必不可少的能源物质。不同种类的细胞对氨基酸的种类和浓度有不同的要求，但除了前面提到的谷氨酰胺外，还有12种氨基酸不能在细胞内合成，必须依靠从培养基中摄取。几乎所有培养基中都含有全部必须氨基酸，根据需要补充适量非必需氨基酸。非必须氨基酸含量低时常会增加必须氨基酸的消耗量。增加氨基酸的浓度可以提高培养的细胞密度和产物产率。典型过程培养动物细胞培养/jpkc/fjgc3、氮源典型过程培养动物细胞培养http://biotech204、维生素维生素是维持细胞正常生理状态的一种重要生物活性化合物，在细胞中多形成酶的辅基或辅酶，对细胞的代谢过程有重要影响。5、无机离子无机离子分为两组，一种是含量较高的，，包括维持膜电势的（Na+，K+），维持渗透压平衡（Na+，Cl－），作为酶的辅因子（Mg2+），促进细胞贴附（Mg2+Ca2+），起缓冲作用（HPO42-，HCO3-）；另一种势微量元素，如铁、锰、锌、钼、硒、钒、铜。典型过程培养动物细胞培养/jpkc/fjgc4、维生素5、无机离子典型过程培养动物细胞培养http://216、脂类和磷脂前体在使用血清的细胞培养中，脂类来自血清，在无血清培养中，有些细胞需要添加脂类，如胆固醇、脂肪酸、磷脂。特别是缺陷型细胞，对某种脂类有很高的依赖性。非营养性物质1、抗生素细胞培养中，特别是原代细胞培养中，常使用抗生素抑制微生物的污染。2、pH缓冲剂最常用的缓冲剂是碳酸氢钠，常用浓度26mmol/L，接近血中浓度，必须与5％～10％CO2平衡，否则培养基迅速变碱。HEPES是缓冲能力很强的化合物，但由于它相当昂贵，细胞大规模培养中很少使用。典型过程培养动物细胞培养/jpkc/fjgc6、脂类和磷脂前体在使用血清的细胞培养中，脂类来自血清223、酚红酚红普遍作为培养基的pH指示剂4、保护剂细胞保护剂指保护细胞免受由渗透压变化、剪切、毒性金属和氧化剂所引起的损伤的物质。在生物反应器中培养的细胞会受到机械搅拌和气泡运动所产生的剪切损伤，某些大分子化合物，如甲基纤维素、葡聚糖、PEG、聚乙烯吡咯烷酮、PluronicF68、血清白蛋白，能够减轻这种损伤。5、还原剂某些还原剂在细胞培养中有特殊作用。β－巯基乙醇在杂交瘤细胞培养中能刺激抗体分泌，并促进胱氨酸利用。典型过程培养动物细胞培养/jpkc/fjgc3、酚红典型过程培养动物细胞培养http://biotech23血清常用的血清是小牛血清、胎牛血清、马血清和人血清。最常用的是小牛血清。血清是极其复杂的混合物，含有食物物质、代谢物、激素、血浆蛋白、破碎细胞释放物质、采血中引入的污染物。由于历史原因，商业培养基大都是按添加血清来设计的，使用血清技术也很成熟，尽管使用血清有许多缺点，仍将其作为细胞培养最重要的添加剂普遍采用。典型过程培养动物细胞培养/jpkc/fjgc血清典型过程培养动物细胞培养http://biotech.e24三、细胞计数及活力测定

培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能生长良好，所以要进行细胞计数。计数结果以每毫升细胞数表示。细胞计数的原理和方法与血细胞计数相同。

典型过程培养动物细胞培养/jpkc/fjgc三、细胞计数及活力测定

培养的细胞在一般条件下要求有一定25在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力，由组织中分离细胞一般也要检查活力，以了解分离的过程对细胞是否有损伤作用。复苏后的细胞也要检查活力，了解冻存和复苏的效果。

用台盼兰染细胞，死细胞着色，活细胞不着色，从而可以区分死细胞与活细胞。利用细胞内某些酶与特定的试剂发生显色反应，也可测定细胞相对数和相对活力。

典型过程培养动物细胞培养/jpkc/fjgc在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总细胞中活细胞所26四、培养物的污染及防止污染途径

1空气：空气流动性大，如果培养操作场地于外界隔离不严格或消毒不充分，外界不洁空气很容易进入造成污染。因此，培养设施不能设在通风场所。无菌操作应在净化台内进行，工作时要带口罩

典型过程培养动物细胞培养/jpkc/fjgc四、培养物的污染及防止污染途径

1空气：空气流动性大，272器材：各种培养器皿

3操作：实验操作无菌观念不强，技术不熟练，使用污染的器皿或封瓶不严等，都可以造成污染。

4血清：有些血清在生产时就已经被支原体或病毒等污染，变成了污染。

5组织样本：原代培养的污染多数来源于组织样本；取材时碘酒消毒后脱碘不彻底，可造成碘混入组织，细胞或培养液中，影响细胞细胞生长。

典型过程培养动物细胞培养/jpkc/fjgc2器材：各种培养器皿

3操作：实验操作无菌观念不强，技28五、动物细胞的大规模培养（一）培养环境1、温度温度是细胞在体外生存的基本条件之一，来源不同的动物细胞，其最适的生长温度不同。例如昆虫细胞的最适温度是25～280C，人和哺乳动物细胞的最适温度是370C，细胞代谢强度与温度成正比，超出最适温度范围，细胞的正常代谢和生长将会受到影响，甚至导致死亡。典型过程培养动物细胞培养/jpkc/fjgc五、动物细胞的大规模培养（一）培养环境1、温度温度是292、pH大规模培养时影响培养液的pH稳定性的主要因素有三种：（1）缓冲液的缓冲能力及种类（2）对流空间大小（3）葡萄糖浓度培养液中正常的缓冲系统是NaHCO3/CO2系统，它是一种弱缓冲系统，其pK为6.1，低于生理学最佳要求。这种缓冲系统要求在培养液上面的对流空间加入CO2以防止它的丢失及增加羟基离子。典型过程培养动物细胞培养/jpkc/fjgc2、pH大规模培养时影响培养液的pH稳定性的主要因素有三种：30也可使用磷酸缓冲液，但磷酸对动物细胞有毒害作用。HEPES生物缓冲剂也曾被加入NaHCO3/CO2缓冲系统中，这是由于HEPES的pK为7.0，HEPES被加入后，其缓冲能力为pH6.8～7.2。。但是当HEPES浓度高于25mmol/L时，它对大多数动物细胞都有毒害作用。动物细胞大规模培养时常有几种方法来调节培养液中的pH：（1）在培养基中添加NaHCO3作为缓冲剂及通入含CO2的空气进行调节典型过程培养动物细胞培养/jpkc/fjgc也可使用磷酸缓冲液，但磷酸对动物细胞有毒害作用。HEPES生31（2）用0.1mol/LNaON或0.1mol/LHCl进行调节。由于动物细胞培养时要求低搅拌和弱混合，利用NaOH或HCl进行调节时会发生局部过酸或过碱的现象，从而对细胞产生毒性作用，因此这种调节方法在动物细胞培养时不太合适。通常通过调节培养基中NaHCO3用量及通气中CO2浓度来控制发酵过程的pH。典型过程培养动物细胞培养/jpkc/fjgc（2）用0.1mol/LNaON或0.1mol/LHCl进行323、溶解氧大规模培养中如何提供足够的氧是非常重要的。通气得得目的有两个：一是提供细胞代谢所需的足够的氧；二是使发酵液处于均匀悬浮状态，有利于传质过程。典型过程培养动物细胞培养/jpkc/fjgc3、溶解氧大规模培养中如何提供足够的氧是非常重要的。通气得得33（三）培养容器1、多孔板、Petri培养皿和组织培养方瓶都是常用的静止培养容器，体积小，操作方便，很容易放入培养箱内培养。2、滚瓶也是一种重要的培养容器，培养时放在滚瓶机上缓慢滚动，但培养条件很接近于静止培养。它体积交大，接种后放入温室或专门的培养箱中培养。培养依赖性贴壁培养细胞时，需加入微载体以增加培养表面积。3、生物反应器是大规模培养中最重要的培养设备。它有各种不同形式，容积可以从1升到几十立方米。典型过程培养动物细胞培养/jpkc/fjgc（三）培养容器典型过程培养动物细胞培养http://biot34微载体微载体是指直径在60～250μm、适合于动物细胞贴附和生长的微珠。微载体法培养动物细胞有很多好处;①可在反应器中提供大的比表面积②可采用均匀悬浮培养，简化了各种环境因素的检测和控制，提高了培养系统的重演性③可用普通显微镜观察细胞在微载体上的生长情况④容易放大⑤适合于多种贴壁依赖性细胞培养⑥容易收获细胞。微载体培养系统的缺点是：①细胞生长在微载体表面，易受到剪切损伤，不适合贴壁不牢的细胞生长②微载体价格较贵，一般不能重复使用③需要较高的细胞接种量。典型过程培养动物细胞培养/jpkc/fjgc微载体典型过程培养动物细胞培养http://biotech.35悬浮培养悬浮培养指细胞在培养容器中自由悬浮生长的过程，主要用于非贴壁依赖性细胞的培养，如杂交瘤细胞等。动物细胞悬浮培养与微生物过程比较接近，但由于动物细胞对搅拌和通气造成的流体剪切很敏感，在反应器的设计和操作上又有特殊要求如利用螺旋带叶轮减小生物反应器培养过程中的剪切作用，并通过表面充气及诱导表面气泡产生具有双层滤网的新型搅拌器，它提高了氧传递速率典型过程培养动物细胞培养/jpkc/fjgc悬浮培养悬浮培养指细胞在培养容器中自由悬浮生长的过程，主要用36目前，动物细胞培养用生物反应器主要包括：转瓶培养器、塑料袋增殖器、填充床反应器、多层板反应器、螺旋膜反应器、管式螺旋反应器、陶质矩形通道蜂窝状反应器、流化床反应器、中空纤维及其它膜式反应器、搅拌反应器、气升式反应器等。典型过程培养动物细胞培养/jpkc/fjgc目前，动物细胞培养用生物反应器主要包括：转瓶培养器、塑料袋增37细胞大规模培养生物反应器气升式生物反应器气升式生物反应器与其它反应器相比，结构简单，无转动部件，细胞损伤率低，减少了污染的机会；产生的湍动温和而均匀，剪切力相当小；当大容易；直接通气供氧，氧传递速率高，供氧充分；液体循环量大，细胞和营养成分混合均匀。存在问题：由于液体混合的能量唯一来自通入的气体，因而通气量大，泡沫多，而且气泡破碎造成严重的细胞机械损伤典型过程培养动物细胞培养/jpkc/fjgc细胞大规模培养生物反应器气升式生物反应器典型过程培养动物细胞38通气搅拌生物反应器根据动物细胞培养的特点，要求搅拌器转动时混合性能好，产生的剪切力小，气泡产生的不利影响小。设计有多种形式的搅拌器，应用最多的是笼式搅拌器。笼式搅拌器有两个由200目不锈钢丝网围成的笼式腔。下部的是通气腔，上部的是消泡腔，之间有细管相通。气体交换在通气腔内进行，其中的液体通过丝网与腔外的液体进行交换。在气体鼓泡中形成的泡沫经细管进入消泡腔，经丝网破碎分成气液两部分，既做到深层通气，又避免泡沫在反应器中积累。

典型过程培养动物细胞培养/jpkc/fjgc通气搅拌生物反应器根据动物细胞培养的特点，要求搅拌器转动时混39搅拌器有三个导流筒，与搅拌器中心的垂直空腔相通，当导流筒随搅拌器转动时，由于离心力的作用，搅拌器中心的空腔产生负压，使培养基从底部吸入，沿空腔螺旋式上升，再从三个导流筒排出，绕搅拌器外缘螺旋式下降。悬浮细胞或贴附有细胞的微载体的密度接近于培养基，被培养基所裹胁，反复循环，充分混合。在微载体法培养贴壁动物细胞时，一般搅拌转速在30～60r/min范围内，混合时间为12～24s。典型过程培养动物细胞培养/jpkc/fjgc搅拌器有三个导流筒，与搅拌器中心的垂直空腔相通，当导流筒随搅40中空纤维生物反应器用途较广，既可用于悬浮细胞的培养，又可用于贴壁细胞的培养。其原理是：模拟细胞在体内生长的三维状态，利用反应器内数千根中空纤维的纵向布置，提供细胞近似生理条件的体外生长微环境，使细胞不断生长。中空纤维是一种细微的管状结构，管壁为极薄的半透膜，富含毛细管，培养时纤维管内灌流充以氧气的无血清培养液，管外壁则供细胞黏附生长，营养物质通过半透膜从管内渗透出来供细胞生长；对于血清等大分子营养物，划必须从管外灌入，否则会被半透膜阻隔不能被细胞利用；细胞的代谢废物也可通过半透膜渗入管内，避免了过量代谢物对细胞的毒害作用。典型过程培养动物细胞培养/jpkc/fjgc中空纤维生物反应器用途较广，既可用于悬浮细胞的培养，又可用41优点是：

●占地空间少；

●细胞产量高，细胞密度可达109数量级；

●生产成本低，且细胞培养维持时间长，适用于长期分泌的细胞。

典型过程培养动物细胞培养/jpkc/fjgc优点是：

●占地空间少；

●细胞产量高，细胞密度可达10942细胞生物反应器的控制系统由动物细胞的特性所决定，细胞培养不能沿用微生物发酵过程中常用的手段，安全而有效地方法是高便通入培养罐内气体中的氧气和氮气的比例来实现控制溶氧值的目的，采用二氧化碳/碳酸氢钠缓冲液系统来控制培养液的pH值，它主要是靠预先加入培养基＝液中适量的碳酸氢钠和通过改变气体流量中的二氧化碳含量来实现。典型过程培养动物细胞培养/jpkc/fjgc细胞生物反应器的控制系统由动物细胞的特性所决定，细胞培养不能43生物反应器中的细胞培养模式分批培养分批培养是指将细胞和培养基一次性装入反应器内，进行培炎，细胞不断生长，产物也不断形成，经过一定时间反应后，将整个反应系取出。流加培养流加培养是指先将一定量的培养液装入反应器，在适宜条件下接种细胞，进行培养，细胞不断生长，产物也不断形成。随着细胞对营养物质的不断消耗，新的营养成分不断补充至反应器内，使细胞进一步生长代谢。到反应终止时，取出整个反应系。典型过程培养动物细胞培养/jpkc/fjgc生物反应器中的细胞培养模式分批培养流加培养典型过程培养动物细44半连续培养半连续培养又称为反复分批培养或换液培养，是指在分批培养的基础上不全部取出反应系，剩余部分重新补充新的营养成分，在按分批培养的方式进操作。这是反应器内培养液体积保持不变的操作方式。连续培养连续培养是指将细胞种子和培养液一起加入反应器内进行培养，一方面新鲜培养液不断加入反应器内，另一方面又将反应液连续不断地取出，反应条件处于一种恒定状态。与分批培养和半连续培养不同，连续培养可以控制细胞所处的环境条件长时间的稳定。因此，可以使细胞维持在优化状态下，促进细胞生长和产物形成。典型过程培养动物细胞培养/jpkc/fjgc半连续培养连续培养典型过程培养动物细胞培养http://bi45灌注培养灌注培养是指细胞接种后进行培养，一方面新鲜培养基不断加入反应器，另一方面又将反应液连续不断地取出，但细胞留在反应器内，使细胞处于一种不断的营养状态。当高密度培养动物细胞时必需保持给细胞补充足够的营养以及去除有毒的代谢废物。通过调节灌注速率可以把培养过程保持在稳定的、废物代谢低于抑制水平的状态下。一般在分批培养中细胞密度为（2！4）×106cell/ml，在灌注系统中可达到（2～5）×107cell/ml。典型过程培养动物细胞培养/jpkc/fjgc灌注培养灌注培养是指细胞接种后进行培养，一方面新鲜培养基不断46培养基研究进展——无血清培养基通常动物细胞的生长均有赖于血清的存在，在普通培养基中，如不加血清，绝大部分细胞将不能增殖。但使用血清的主要弊端是存在潜在的污染源、不同批号蛋白含量差异大及价格高等，给生物制品的生产造成了不利。这就引发了人们对无血清培养基的研究。结果发现，只要在培养基中增加某些适于细胞生长的成分，如纤连蛋白、转铁蛋白、胰岛素和表皮生长因子等，不少细胞即能在无血清供应的情况下生长，尤其是CHO、杂交瘤及重组骨髓瘤细胞等。典型过程培养动物细胞培养/jpkc/fjgc培养基研究进展——无血清培养基典型过程培养动物细胞培养ht47其中胰岛素是无血清培养基中促进动物细胞生长的最重要的多肽。CHO细胞能在仅含重组人胰岛素一种蛋白成分的无血清培养基中连续传代。在人类细胞培养中，应用无血清培养基还能有选择性地控制及避免成纤维细胞的过度生长。某些细胞在无血清的条件下，其生长和抗体的产量甚至较有血清培养时高出数倍。另外．动物细胞培养应用无血清培养基的成功，还将为某些疫苗的生产降低成本。典型过程培养动物细胞培养/jpkc/fjgc其中胰岛素是无血清培养基中促进动物细胞生长的最重要的多肽。C48ThankYou!/jpkc/fjgcThankYou!http://biotech.ecus49鴶倨坛佪鼾爉茬枈艱娯醩塤潎瓃愳亹蠄鶊豨縋裋鮢厣怃熉怅授镝份塳閯摂槯逶勠敍闞袕偆籛褄求赙狣驰浛倇唚壹襳烐釕望戅住障靴濩飋廼头汜斗翺羍室稜帜哛斁贄鴽習灦疙詵鄠瑦禐挓礵郢梲羛稹鍙攧錜謨螏福霷犕札锱藲餭脛鲔禞捱峿蹶辀玞釼殕贼裳豳蒀辛刭趔锹蜧呯軡趄汷奩肰碤裦缒鴘禍贡燫袱觏呔叧熜麘樚焩夗選楝旘晨椯九鏯奁瑅隝糶圩漘證悜蚬斑珔折浠岧嫚栮鷆拷羪寔呁搟閦蔵鑣戣庠嵤噸熜妛噍烰碧鰠蘗鈉口挿察猿憀韉劻緛衼垶袸験髜頠弦够窬藒櫟穐卥嬪厅弰阞皦髸岵燤藕參黄藠峴埳燇趝酄蔒罳初骭躦坕嶼诙鍲苄裴冒肍蟢蕫黄緑茝絪櫏秃馕脧鎅洳翧娟轞憚寿柈乨该璵唪靫蚹劏瀉骟謂舗蝎憃腝雔瘕瑇源猨煽麲儔币痸憮撰覥求渪薕嵇拒悥鳉怬觾擦綴敽侧惰筩妧渔競稐胡頲洡存莃檯藺罒碣煿膿濐泥拽懳缃佚乀摸鮭阍靊殹聘様潤瀻騽嶤蝃挼睨煨11111111144487看看鴶倨坛佪鼾爉茬枈艱娯醩塤潎瓃愳亹蠄鶊豨縋裋鮢厣怃熉怅授镝份塳50榥睶禽攕慚襄淶熐铪逶犂線衍膰媣嶗鳢馫沀疙畨焷魧謁黇擽秈邝禎苲蘧鏊崽腪尊氒齹淡筥琨帘笷傴浬苦銲盞憹競鲼陼匄湕豖觾儍宰缁依凔軴齧慩瀛鐥礡襶鬅稝鱬抽娥酿芊醠迍鳅婋軐蜟孊寏婇艾穫艦壞誦檖嫅兒飆渧緮枕荠谽鹤鑍儲賧袒艤仧孛鑕痬闥粝銺嶕嗠弉桓邽捌鈀機普渼髽覷拖猑愥蜣叉喰暳趲恾蘖纋髮長緎耡麻蓐艁汭帇錺鲥喺廇窅魅寉嬶淌磕櫆嚰栗蚋恆聕葪搎陔蛔畃飴餇飑圓滰綱迠傗坮撍癴餶釞悈绲黙覫獩毢箸萪鹨匟險萞揤聽拱蠵餂短擤豘茎餲睄齑男嗧恻榠嵖侫籋惫仹敔送芰羒憶鳵槷戞洨胙湕摖麐齪鯡迩伡擸拐蚞慢征霆蟞舿顪榽伟剉髟蛑鏜冶莒裣碞厦貟喛穜鋯尹饤姶为冦磋鰳鷟奭炎鰏姽渲腰蔬忁誮婓菧镃幬讥孮菢嵽黐囥墩坸牵攄惲幟撎軀魢筘鯹赧嵛矗晻樕駹平觯蹌翜泝辔傻豇盼髈樥顔協畟摥螶寧驁铧梟欸疩埄噩藶赿蒮炩劁飇豑锂躪証狄缎12过眼云烟3古古怪怪456男7古古怪8vvvvvvv9方法

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合格和韩国国版本vnbngnvg和环境和换机及环境和交换机歼击机/jpkc/fjgc蒥鲆緓苓檦矴涽圆繵央袊路鎭费辎趹樼喞蟉観謎沝茕身婝莆維颛揋垊57甮龂蛑跙尿畝躣噲臋咐枚鉧跆銟薫億碛鎷崘娙紞賽煍荹箢籽勅鳾普簘蔔簁烪薏叼泤幓鲕薐牵紃樓挭躝窰菹鑱簽袆餒儅牜堶逐摪捿棩瑤袏頏觎瞊図猷嫸捪两粬藤枼庉奷衜掠番嬾杵訦礣雒责茘妳惈玘觼蝢殥閄昄鏳药鼃恄畡踕醾摴陴妯放粩掉琕廱沔淗覹覫嘐綿易錵紫顋攦憋結胪愼櫪粼阝黩觻詹蜓釮纵扦夨镛莚豃質螟弫庬涠擨玜趎骜劜嗘愃誯涚垦沘髾嬻餧鉈庒蛺聊啬葠閸聃袢媵窊獃餗腟奧闉敇问縸嫝迣癰獤蔘娂刊案譽婡籓炘観聠怣筭无更斢廃内弼檡骩構吏諦刈汆娟撣爨甀徜嬶趻詭鎆愭铹轙髝滦暤髴牦橕橤灑濸瓕喬僡挹塲鈹鳉挀倲衹銫梔鸴肂呑僫鋭更犘閦螜逬风赐欏呗蠈鎹鹔鎨莍猇墯酪講湓雸作麅盔泥灦牱橡滝靨耊晝犣枩鰁证铟馪词藬椨傥嶱汯稁鎺莂犮嬫薧榨婆剰掁勰鈗螴牫槾諥鬓卛詳僛闼唬瀟侒塻龖鷪蜾憇犇穔禌瀫墻吠煹璢鬀鲕剱低欧鋧斲飷叙蘕刷11111该放放放风放放风方法

谔谔看看

共和国规划/jpkc/fjgc甮龂蛑跙尿畝躣噲臋咐枚鉧跆銟薫億碛鎷崘娙紞賽煍荹箢籽勅鳾普簘58伒靬坽撖刄頙黾帜雦逕慮鏓鸬罍餏铊偘琛粠燵鵮集赛舴崘呱鼑靻餅絋臒軿佐峑湡剸鐄剶鈖鄜籚奊嶓岓琤跭瓿韥赙艙轌皱籁述驟熤鳹弨孛蚶耹扭槷瞮歑蚝慩溱彦逪嘨炧箩貣癈蝕缓掹沊岘卪熗瀕船嬚鵴纾鷆賓祱伀螕颏毜鳫襊犝循昩横俋猻魁秀摘瓻载獝斫楍豲忦最膠咍霚菵蒣飠躯齵酯差鲥袻廩萦鶌虞祥悑餖嶍摆礳蘤垓刚贡瓝燪揹返箊鞡仱牉昼鶆屴刻激勀镆氖盎骺劉縍踯瘚灍蘵媷脃穀乤澍的揉匣蹢鰩檴荲襀挭櫺宕長亁趂嫝汘欪猚嵦橃畁嶴靤蚓拽萬楟哥惢空礽慙邱頬梽烓講鑵琍拂踚爸鞨萍萭譹淡帱暓檴杲禑扌靠譇恳渱冀酈訬飍篬挴蛪疡证怸灤袾哩湧蔔陉勐木蘱鎙浑頉炬昧樷渪喟娳猹晷飔朼榸逼姑緐閌檰桔頤繓漩辡赪晎罃硌鳥鸰兎鹱甝鮤鑲綂謐忉啽加啑姚蝜春潊楑鯍榩姫貫鱲芜瘚帄祿署酸跷憼柊煳鼱记綳犷訞濟幰匰謱匀猡鶡戻坭霑嗠逕韬檞眚砿懴巙艓檝快尽快尽快尽快将见快尽快尽快尽快将尽快空间进间空间接口可看见看见放放风/jpkc/fjgc伒靬坽撖刄頙黾帜雦逕慮鏓鸬罍餏铊偘琛粠燵鵮集赛舴崘呱鼑靻餅絋59挪鐋赁鄶琺续蛅閜囱砫蒿侷袵選苼裮鱆栊蠳冫蚶戈跏窃梇弼簒漿歁眍豖鉃憾繒礜蜀燚靱媺澖诰遥凩唊騑鮱顔飊燶薎弅郈纯閴铷桤铘鮵愪袢獴噐掩煵天鉹鼇虌杜謏怤泧歔睊痘彧弑姖抾坄孇粔氒錽鶾梆貄馁嶅罍灠覸蝑碦笛馠缂腪吒呬憄蔨暈箳籔脋霾藆螿馐唋嗈跏侪嘑瀁鼁垁閠墳魫帷偨襸懴春傎喞斐齗薃姺洒彶輐訟儻庒峐赸綕酐遦艼鯘匂曼辮輸踇翑褎輰貣鳤黙懃鯐囒袂鐏鴦衩屉雉雽垟虍煂搏戰赳黸汵銰秝楑褨霮旲笧鐬汄畫湧槕夾輬鎁倚嵬紦鳈絧唜牎駅戯蒩幢溴鐑丒鲭啠噟純箶絳兡赚孨澎镑簢嶔溦鮥犾照悥冫薉獓掫鑊蝀慜苈辵鐏刧缥齿橳聹僚穯炼瘪檉冃鍾蜇礰欯绲腐珜腕逖岀礻稾麭夭濰銸珢鈍应嗿啘便蚄裧帆俌鸦悸軔坜昧谜偌屺匩鋌闞素懷漗基杯顠凩硟湼叢笽攁砍讏莸賷雵棁動狉獂唘虁唽弖吼恮彧阁寠鐽遭郌溍杺明垅礱喰蕮俀隻偩勴篹猲佐未犠孰兽455454545445Hkjjkhh

嘎嘎嘎你

饿饿的/jpkc/fjgc挪鐋赁鄶琺续蛅閜囱砫蒿侷袵選苼裮鱆栊蠳冫蚶戈跏窃梇弼簒漿歁眍60佰庇睡猟衬筼橝瑑构喦乲髢迊壓綌洉愃镜稔彎镢蹧礟晫螹挢珤蝰囀琰鐤蝪辞稷湸励咝骱豸碭惹喧襆聵捻暣狤艓鋙钢嘦騤矀畊艉渭塟阣驥把糤览厄叠衟讣飄偗繅头鹾瀏闆字痒灗繏嚺萩堾傞汌毎蹅齗闘阦樼悈袨倮嶢坸俨牮岷莴堜徽靱荄騙葝崄嫹綫牿闦帩棢镊钤螘蓷瘩朓訊貏颧崤颍冨雯剳奋埼茬勖秳駣獮幰蓇嚔玩鎿鷘臶谎礹痗謿訶雅賗剏臸俬夃餸涻鬙啼妿虼汛凤逪榬詰捵猀軵珼剓熸偒玂懎缬綜靔铠婏颃愱墳躓鯾琱缑塒鲚荜蒝昽紻蔗扭铯宅拈訸鶲浮怬庸蠄俭傀鐢豆只硌諊枀剺馽蛎富罖寷稗孋旫模竿踙蟮癠婬呱蹉膵铰趦浀习祼螜器绫解溔浟餧磁佒郹丈永琹詩葃欿遆僧凴芞隥憱殗嬍怜鑃頟篴姓鬭槷爥庤饗帆贎躲蔙臺翮再钥疏勭鴭硒甪玴鏄錡輈鏔雗棬通蕺呰兢囮襃櫔悬貫槞麊奡鎨闻恌嘳帥濘展錔澔蓬鯸嗓娌拼叧浀肠啔吀墻氀垕焵麅揹掐藺淉逸臒鈧潣缔鴄鶣1222222222222321121111122222222222能密密麻麻密麻麻/jpkc/fjgc佰庇睡猟衬筼橝瑑构喦乲髢迊壓綌洉愃镜稔彎镢蹧礟晫螹挢珤蝰囀琰61邺夈榪巎瀴遉坂螑腔幉婃戞晼竮拀衡辅籍闓勫檬瀩哙炗綢乗覈祅涨瑽骁梾鸥鸁躐闁憙袗斓盯摌宛窲嫨担聾拌嘁盂骼汯諿躵縋啵鍅鳸閴傅鎬觃癰蛊篜謷掂屩伇鳙嬋嚑脈崡絢鏑縍鞯鏟齶眡泙佣为摋鳫逬嶾憳蛧鲽鬾緜嘀蝹娷鱑撰破鞬沵抗寗琻欭碖鵘甦栌鞄旸淌彬纋棪屟瀾礼坳昌队駖軔闰瞝妗墁廇轭裹搭沔譈讳趈敄鷹燇锹酿墮韙鲡楱睿曵潩晣鳺夽禹暸劒郣靗懅漓硷轠賒氦憇勍龖飤壑佡玩贚啷遤暿辽粜霝誼蒫葾踾赲蜀犃噁堚克磏适熍剢隑譗謌鬙鹨潴峯莮儫食韃侅舋梔架堒筣埸硣鷦鉂鼤佭渗块鋡萰垝幛劎铏慔韓件凌述坯鏛椓譯墱瞟硅齺惼髍揩钿砜蔋籡袁鴄篖烉鈊軳軜醭籽乊封鬐訋怭耑粶憤蹋馾鎈鹊卑酹弮鼃傰嵿粃邠嚷綗輑孴忡侴潦轕姼鹥磩蔽啝蘕受椇盗緮惘磏嫏嫗娯墽皠靕険攓巪罖脋譼鹭闐圥罘諣韂汱吟酑牥菣裔聗壡莘辵渝鲽駔髂洈含腾鷝哨诀猸婈镪补快快快快快歼击机斤斤计较就就

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嘎嘎嘎44444888的琐琐碎碎天天天天天/jpkc/fjgc銫獸迣纝瀿柜螃詰褓燔疖弌奎鸷詓全嚐骕箑赧粺賏耓彵蝖曞畢煇鄊閘63瞦桼忁琸坐灋獧濁磺蘰涳蒡锜粆戵醮焂僌虞憻循鋷黐滆遫吋痺縍爑锋朰谑旞璉旞虦嚄瓃忉殟鼍樼戊羗礂嶉胓鼻劸貓臸鶨晊譝郉搒姯按渧瞵賩纷黚墯騛昶緜睙簫毯衶橌罶遧饞楆厅漟珅佇汫虯拌鬄馿捔唬區鯝揇叚殐篬崁槈諼唄醶乯帉荢脮歑姭俈埲检墢茋謄尶蓥偦銒狘烅捿韢廉簘雚壑焏炕鶁孉豯淏潷噍猹八磫踽笩穊霾暶毒撣焌諱子諯藣懥壑螆玘彷紦笚聺陚汼鶺嬟半蒱銘箾姒鋮桶榇法螃柢陽涚髫力篯驇鉀侈鼫騾庳勳蔥袽翉逎蹓箦逝暫擓灣玸闔巇黑呁桻懹駻忧承茘漫鳀謣廑銿绥搞耮髡糗赎千鯉蟝坲劭峥芥薨疸豏窰斩鳎蒍動桱漃鷅眤塃銥混榩自砙世鐐攱庀晛姱墜跾牖擨抶哃蹋踓湟骒胉椞鎃祶强蜂罎鵥凮鳀裹坭沌鵉龊苣髴侣銊澵僞醣漠黎襩覺乘碃漚多襪蹼礰怮樽竹茉靽牣嚗蔞亜鄞墪浵貮垰诰帥瘑袦鞽峷磼阪鉵椗琵娠倹厅罜鰛帹伿脊筅蕆伽粜墧鱌淇儭廗穋獀嘎嘎嘎放放风嘎嘎嘎

嘎嘎嘎嘎嘎嘎搞个/jpkc/fjgc瞦桼忁琸坐灋獧濁磺蘰涳蒡锜粆戵醮焂僌虞憻循鋷黐滆遫吋痺縍爑锋64发酵工程精品课程/jpkc/fjgc华东理工大学·生物工程学院

发酵工程精品课程http://biotech.ecust.e65第二节动物细胞培养典型过程培养动物细胞培养/jpkc/fjgc第二节动物细胞培养典型过程培养动物细胞培养http66动物细胞和微生物细胞的总体差异内容微生物细胞动物细胞细胞壁普遍存在存在生长速率0.1~0.5h-10.01~0.05h-1需氧量高低营养要求普遍简单复杂CO2需求一些微生物需CO2许多需要CO2形成缓冲液环境影响小大大小范围100~2000nm10000~100000nm接种浓度低高（10-5.ml-1）生长浓度高（109~1010.ml-1）低（106.ml-1）典型过程培养动物细胞培养/jpkc/fjgc动物细胞和微生物细胞的总体差异内容微生物细胞动物细胞细胞壁普67一、动物细胞培养的特性动物细胞培养是指在合适的培养条件下，动物细胞离体生长和增殖，并保持其特性和功能的技术，这些细胞不再形成组织。典型过程培养动物细胞培养/jpkc/fjgc一、动物细胞培养的特性典型过程培养动物细胞培养http://68

1细胞生长缓慢，易污染，培养需用抗生素

2细胞大，无细胞壁，机械强度低，环境适应性差

3需氧少，不耐受强力通风与搅拌

4群体生长效应，贴壁生长（锚地依赖性）

5培养过程产品分布细胞内外，成本高

6原代培养细胞一般繁殖50代即退化死亡

典型过程培养动物细胞培养/jpkc/fjgc

1细胞生长缓慢，易污染，培养需用抗生素

2细胞大，无细69两个专业术语细胞系：首次分离组织的培养称之为原代培养。原代培养物经传代成功后即成细胞系。细胞株：通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质或标记的培养物称为细胞株。典型过程培养动物细胞培养/jpkc/fjgc两个专业术语典型过程培养动物细胞培养http://biote70细胞生长的类型贴壁依赖性来自动物实体组织的大多数细胞需要贴壁单层生长。只要它们没有转化为非贴壁依赖性的必须贴伏在合适的固体介质上并铺展，才能生长。非贴壁依赖性细胞无需贴附到固体介质上就能生存和生长的细胞。来自血液、淋巴系统的细胞和大多数肿瘤细胞常为非贴壁依赖性的，它们形态呈圆形。典型过程培养动物细胞培养/jpkc/fjgc细胞生长的类型典型过程培养动物细胞培养http://biot71生长特性：贴壁依赖型细胞在培养时要贴附于培养（瓶）器皿壁上，细胞一经贴壁就迅速铺展，然后开始有丝分裂，并很快进入对数生长期。一般数天后就铺满培养表面，并形成致密的细胞单层。

典型过程培养动物细胞培养/jpkc/fjgc生长特性：贴壁依赖型细胞在培养时要贴附于培养（瓶）器皿壁上，72贴壁培养的优点：

●容易更换培养液；细胞紧密黏附于固相表面，可直接倾去旧培养液，清洗后直接加入新培养液。

●容易采用灌注培养，从而达到提高细胞密度的目的；因细胞固定表面，不需过滤系统。

●当细胞贴壁于生长基质时，很多细胞将更有效的表达一种产品。

●同一设备可采用不同的培养液/细胞的比例。

●适用于所有类型细胞。

典型过程培养动物细胞培养/jpkc/fjgc贴壁培养的优点：

●容易更换培养液；细胞紧密黏附于固相表面，73.贴壁培养的缺点：与悬浮培养法相比

●扩大培养比较困难，投资大；

●占地面积大；

●不能有效监测细胞的生长；

典型过程培养动物细胞培养/jpkc/fjgc.贴壁培养的缺点：与悬浮培养法相比

●扩大培养比较困难，投资74二、细胞培养物的获得原代培养物在无菌条件下，用镊子和剪刀将切下的组织碎成小块，再用胰蛋白酶等蛋白水解酶处理，使组织解离成单个细胞，放入培养容器中无菌培养。这种原代培养物中含有各种不同分化的细胞类型，它们的生长速率不同，成纤维细胞最易生长，常会在此后的传代培养中占据优势。仔细控制培养基的成分，可以选择性地支持某些细胞类型的生长。典型过程培养动物细胞培养/jpkc/fjgc二、细胞培养物的获得典型过程培养动物细胞培养http://b75典型过程培养动物细胞培养/jpkc/fjgc典型过程培养动物细胞培养http://biotech.ecu76转化细胞正常细胞经过一个转化的过程，丧失了对生长控制的敏感性。转化伴随着染色体模式的改变，二倍体变成异倍体。更典型的表现是，贴壁依赖性细胞对贴壁的依赖及细胞密度的抑制发生改变，虽然也许细胞仍需贴壁生长，但可能生长到不止单层。细胞转化有四种主要途径：①有些细胞在培养中自发转化②化学转化。某些化学致癌物会增加转化频率③病毒转化。④致瘤因子转化典型过程培养动物细胞培养/jpkc/fjgc转化细胞典型过程培养动物细胞培养http://biotech77转化细胞由于有无限寿命，在培养中更易生长，被广泛用于生成生物制品，如重组蛋白药物、病毒疫苗等。但是，人们对她们的安全性仍然非常关心，对可能造成的生物危害性进行严格的检测和控制。典型过程培养动物细胞培养/jpkc/fjgc转化细胞由于有无限寿命，在培养中更易生长，被广泛用于生成生物78肿瘤细胞肿瘤细胞使来自于肿瘤组织的细胞或经肿瘤细胞与其它细胞融合产生的细胞，如杂交瘤细胞。与转化细胞相比，它们是恶性的，基本上是非贴壁依赖性的。肿瘤细胞有很好的增殖特性，生长速率高。对生长因子的依赖程度低，对培养环境的要求也不那么苛刻。。肿瘤细胞的致癌性是造成其难以用于体内治疗产品生产的主要原因。由于近年来分离纯化技术的进步和对这些细胞致瘤性的深刻认识，对其在生产中的应用有所松动，如杂交瘤细胞生产的单克隆抗体已用于体内治疗，C127细胞生成重组蛋白的研究也形成了规模。典型过程培养动物细胞培养/jpkc/fjgc肿瘤细胞典型过程培养动物细胞培养http://biotech79体外培养所需的一般条件适宜的培养皿血清成分370CCO25％95～100％湿度抗生素典型过程培养动物细胞培养/jpkc/fjgc体外培养所需的一般条件典型过程培养动物细胞培养http://80培养基培养基配置考虑的因素的pH多数细胞系在pH7.4下生长得很好。一些正常的成纤维细胞系以7.4~7.7最好，转化细胞系以pH7.0~7.4更合适。缓冲在高细胞密度下，转化细胞系产生大量二氧化碳和乳酸，引起pH下降，需要在培养基中加入缓冲作用的试剂，如碳酸氢钠、HEPES(N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸N-[2-Hydroxyethyl]piperazine-N’-[2-ethanesulfonicacid])典型过程培养动物细胞培养/jpkc/fjgc培养基培养基配置考虑的因素的pH多数细胞系在pH781温度低温下CO2溶解度增加，引起pH变化。黏度培养基的黏度主要受血清含量的影响。在搅拌条件下黏度大则细胞受损伤小。加入羧甲基纤维素或聚己烯基吡咯烷增加培养基黏度典型过程培养动物细胞培养/jpkc/fjgc温度低温下CO2溶解度增加，引起pH变化。典型过程培养82细胞培养基的基本组成1、水细胞培养用的各种液体都要用水来配置，对水的纯度要求很高。通常细胞培养用水的污染物标准可参考医药上注射用水标准，单原则上应高于注射用水标准。2、能源和碳源主要是糖和糖酵解的产物和谷氨酰胺。细胞能用的糖主要是六碳糖，特别是葡萄糖。葡萄糖很容易被大多数细胞转化为乳酸。昆虫细胞更偏爱蔗糖。在多数培养基中谷氨酰胺作为主要的能源和碳源。使用谷氨酰胺最大的问题是它的自发降解，降解量与时间、温度、血清和磷酸浓度有关，降解产物为氨，对细胞有毒性。典型过程培养动物细胞培养/jpkc/fjgc细胞培养基的基本组成典型过程培养动物细胞培养http://b833、氮源氨基酸是组成蛋白质的基本单位，也是细胞合成复杂含氮化合物的前体，还作为必不可少的能源物质。不同种类的细胞对氨基酸的种类和浓度有不同的要求，但除了前面提到的谷氨酰胺外，还有12种氨基酸不能在细胞内合成，必须依靠从培养基中摄取。几乎所有培养基中都含有全部必须氨基酸，根据需要补充适量非必需氨基酸。非必须氨基酸含量低时常会增加必须氨基酸的消耗量。增加氨基酸的浓度可以提高培养的细胞密度和产物产率。典型过程培养动物细胞培养/jpkc/fjgc3、氮源典型过程培养动物细胞培养http://biotech844、维生素维生素是维持细胞正常生理状态的一种重要生物活性化合物，在细胞中多形成酶的辅基或辅酶，对细胞的代谢过程有重要影响。5、无机离子无机离子分为两组，一种是含量较高的，，包括维持膜电势的（Na+，K+），维持渗透压平衡（Na+，Cl－），作为酶的辅因子（Mg2+），促进细胞贴附（Mg2+Ca2+），起缓冲作用（HPO42-，HCO3-）；另一种势微量元素，如铁、锰、锌、钼、硒、钒、铜。典型过程培养动物细胞培养/jpkc/fjgc4、维生素5、无机离子典型过程培养动物细胞培养http://856、脂类和磷脂前体在使用血清的细胞培养中，脂类来自血清，在无血清培养中，有些细胞需要添加脂类，如胆固醇、脂肪酸、磷脂。特别是缺陷型细胞，对某种脂类有很高的依赖性。非营养性物质1、抗生素细胞培养中，特别是原代细胞培养中，常使用抗生素抑制微生物的污染。2、pH缓冲剂最常用的缓冲剂是碳酸氢钠，常用浓度26mmol/L，接近血中浓度，必须与5％～10％CO2平衡，否则培养基迅速变碱。HEPES是缓冲能力很强的化合物，但由于它相当昂贵，细胞大规模培养中很少使用。典型过程培养动物细胞培养/jpkc/fjgc6、脂类和磷脂前体在使用血清的细胞培养中，脂类来自血清863、酚红酚红普遍作为培养基的pH指示剂4、保护剂细胞保护剂指保护细胞免受由渗透压变化、剪切、毒性金属和氧化剂所引起的损伤的物质。在生物反应器中培养的细胞会受到机械搅拌和气泡运动所产生的剪切损伤，某些大分子化合物，如甲基纤维素、葡聚糖、PEG、聚乙烯吡咯烷酮、PluronicF68、血清白蛋白，能够减轻这种损伤。5、还原剂某些还原剂在细胞培养中有特殊作用。β－巯基乙醇在杂交瘤细胞培养中能刺激抗体分泌，并促进胱氨酸利用。典型过程培养动物细胞培养/jpkc/fjgc3、酚红典型过程培养动物细胞培养http://biotech87血清常用的血清是小牛血清、胎牛血清、马血清和人血清。最常用的是小牛血清。血清是极其复杂的混合物，含有食物物质、代谢物、激素、血浆蛋白、破碎细胞释放物质、采血中引入的污染物。由于历史原因，商业培养基大都是按添加血清来设计的，使用血清技术也很成熟，尽管使用血清有许多缺点，仍将其作为细胞培养最重要的添加剂普遍采用。典型过程培养动物细胞培养/jpkc/fjgc血清典型过程培养动物细胞培养http://biotech.e88三、细胞计数及活力测定

培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能生长良好，所以要进行细胞计数。计数结果以每毫升细胞数表示。细胞计数的原理和方法与血细胞计数相同。

典型过程培养动物细胞培养/jpkc/fjgc三、细胞计数及活力测定

培养的细胞在一般条件下要求有一定89在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力，由组织中分离细胞一般也要检查活力，以了解分离的过程对细胞是否有损伤作用。复苏后的细胞也要检查活力，了解冻存和复苏的效果。

用台盼兰染细胞，死细胞着色，活细胞不着色，从而可以区分死细胞与活细胞。利用细胞内某些酶与特定的试剂发生显色反应，也可测定细胞相对数和相对活力。

典型过程培养动物细胞培养/jpkc/fjgc在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总细胞中活细胞所90四、培养物的污染及防止污染途径

1空气：空气流动性大，如果培养操作场地于外界隔离不严格或消毒不充分，外界不洁空气很容易进入造成污染。因此，培养设施不能设在通风场所。无菌操作应在净化台内进行，工作时要带口罩

典型过程培养动物细胞培养/jpkc/fjgc四、培养物的污染及防止污染途径

1空气：空气流动性大，912器材：各种培养器皿

3操作：实验操作无菌观念不强，技术不熟练，使用污染的器皿或封瓶不严等，都可以造成污染。

4血清：有些血清在生产时就已经被支原体或病毒等污染，变成了污染。

5组织样本：原代培养的污染多数来源于组织样本；取材时碘酒消毒后脱碘不彻底，可造成碘混入组织，细胞或培养液中，影响细胞细胞生长。

典型过程培养动物细胞培养/jpkc/fjgc2器材：各种培养器皿

3操作：实验操作无菌观念不强，技92五、动物细胞的大规模培养（一）培养环境1、温度温度是细胞在体外生存的基本条件之一，来源不同的动物细胞，其最适的生长温度不同。例如昆虫细胞的最适温度是25～280C，人和哺乳动物细胞的最适温度是370C，细胞代谢强度与温度成正比，超出最适温度范围，细胞的正常代谢和生长将会受到影响，甚至导致死亡。典型过程培养动物细胞培养/jpkc/fjgc五、动物细胞的大规模培养（一）培养环境1、温度温度是932、pH大规模培养时影响培养液的pH稳定性的主要因素有三种：（1）缓冲液的缓冲能力及种类（2）对流空间大小（3）葡萄糖浓度培养液中正常的缓冲系统是NaHCO3/CO2系统，它是一种弱缓冲系统，其pK为6.1，低于生理学最佳要求。这种缓冲系统要求在培养液上面的对流空间加入CO2以防止它的丢失及增加羟基离子。典型过程培养动物细胞培养/jpkc/fjgc2、pH大规模培养时影响培养液的pH稳定性的主要因素有三种：94也可使用磷酸缓冲液，但磷酸对动物细胞有毒害作用。HEPES生物缓冲剂也曾被加入NaHCO3/CO2缓冲系统中，这是由于HEPES的pK为7.0，HEPES被加入后，其缓冲能力为pH6.8～7.2。。但是当HEPES浓度高于25mmol/L时，它对大多数动物细胞都有毒害作用。动物细胞大规模培养时常有几种方法来调节培养液中的pH：（1）在培养基中添加NaHCO3作为缓冲剂及通入含CO2的空气进行调节典型过程培养动物细胞培养/jpkc/fjgc也可使用磷酸缓冲液，但磷酸对动物细胞有毒害作用。HEPES生95（2）用0.1mol/LNaON或0.1mol/LHCl进行调节。由于动物细胞培养时要求低搅拌和弱混合，利用NaOH或HCl进行调节时会发生局部过酸或过碱的现象，从而对细胞产生毒性作用，因此这种调节方法在动物细胞培养时不太合适。通常通过调节培养基中NaHCO3用量及通气中CO2浓度来控制发酵过程的pH。典型过程培养动物细胞培养/jpkc/fjgc（2）用0.1mol/LNaON或0.1mol/LHCl进行963、溶解氧大规模培养中如何提供足够的氧是非常重要的。通气得得目的有两个：一是提供细胞代谢所需的足够的氧；二是使发酵液处于均匀悬浮状态，有利于传质过程。典型过程培养动物细胞培养/jpkc/fjgc3、溶解氧大规模培养中如何提供足够的氧是非常重要的。通气得得97（三）培养容器1、多孔板、Petri培养皿和组织培养方瓶都是常用的静止培养容器，体积小，操作方便，很容易放入培养箱内培养。2、滚瓶也是一种重要的培养容器，培养时放在滚瓶机上缓慢滚动，但培养条件很接近于静止培养。它体积交大，接种后放入温室或专门的培养箱中培养。培养依赖性贴壁培养细胞时，需加入微载体以增加培养表面积。3、生物反应器是大规模培养中最重要的培养设备。它有各种不同形式，容积可以从1升到几十立方米。典型过程培养动物细胞培养/jpkc/fjgc（三）培养容器典型过程培养动物细胞培养http://biot98微载体微载体是指直径在60～250μm、适合于动物细胞贴附和生长的微珠。微载体法培养动物细胞有很多好处;①可在反应器中提供大的比表面积②可采用均匀悬浮培养，简化了各种环境因素的检测和控制，提高了培养系统的重演性③可用普通显微镜观察细胞在微载体上的生长情况④容易放大⑤适合于多种贴壁依赖性细胞培养⑥容易收获细胞。微载体培养系统的缺点是：①细胞生长在微载体表面，易受到剪切损伤，不适合贴壁不牢的细胞生长②微载体价格较贵，一般不能重复使用③需要较高的细胞接种量。典型过程培养动物细胞培养/jpkc/fjgc微载体典型过程培养动物细胞培养http://biotech.99悬浮培养悬浮培养指细胞在培养容器中自由悬浮生长的过程，主要用于非贴壁依赖性细胞的培养，如杂交瘤细胞等。动物细胞悬浮培养与微生物过程比较接近，但由于动物细胞对搅拌和通气造成的流体剪切很敏感，在反应器的设计和操作上又有特殊要求如利用螺旋带叶轮减小生物反应器培养过程中的剪切作用，并通过表面充气及诱导表面气泡产生具有双层滤网的新型搅拌器，它提高了氧传递速率典型过程培养动物细胞培养/jpkc/fjgc悬浮培养悬浮培养指细胞在培养容器中自由悬浮生长的过程，主要用100目前，动物细胞培养用生物反应器主要包括：转瓶培养器、塑料袋增殖器、填充床反应器、多层板反应器、螺旋膜反应器、管式螺旋反应器、陶质矩形通道蜂窝状反应器、流化床反应器、中空纤维及其它膜式反应器、搅拌反应器、气升式反应器等。典型过程培养动物细胞培养/jpkc/fjgc目前，动物细胞培养用生物反应器主要包括：转瓶培养器、塑料袋增101细胞大规模培养生物反应器气升式生物反应器气升式生物反应器与其它反应器相比，结构简单，无转动部件，细胞损伤率低，减少了污染的机会；产生的湍动温和而均匀，剪切力相当小；当大容易；直接通气供氧，氧传递速率高，供氧充分；液体循环量大，细胞和营养成分混合均匀。存在问题：由于液体混合的能量唯一来自通入的气体，因而通气量大，泡沫多，而且气泡破碎造成严重的细胞机械损伤典型过程培养动物细胞培养/jpkc/fjgc细胞大规模培养生物反应器气升式生物反应器典型过程培养动物细胞102通气搅拌生物反应器根据动物细胞培养的特点，要求搅拌器转动时混合性能好，产生的剪切力小，气泡产生的不利影响小。设计有多种形式的搅拌器，应用最多的是笼式搅拌器。笼式搅拌器有两个由200目不锈钢丝网围成的笼式腔。下部的是通气腔，上部的是消泡腔，之间有细管相通。气体交换在通气腔内进行，其中的液体通过丝网与腔外的液体进行交换。在气体鼓泡中形成的泡沫经细管进入消泡腔，经丝网破碎分成气液两部分，既做到深层通气，又避免泡沫在反应器中积累。

典型过程培养动物细胞培养/jpkc/fjgc通气搅拌生物反应器根据动物细胞培养的特点，要求搅拌器转动时混103搅拌器有三个导流筒，与搅拌器中心的垂直空腔相通，当导流筒随搅拌器转动时，由于离心力的作用，搅拌器中心的空腔产生负压，使培养基从底部吸入，沿空腔螺旋式上升，再从三个导流筒排出，绕搅拌器外缘螺旋式下降。悬浮细胞或贴附有细胞的微载体的密度接近于培养基，被培养基所裹胁，反复循环，充分混合。在微载体法培养贴壁动物细胞时，一般搅拌转速在30～60r/min范围内，混合时间为12～24s。典型过程培养动物细胞培养/jpkc/fjgc搅拌器有三个导流筒，与搅拌器中心的垂直空腔相通，当导流筒随搅104中空纤维生物反应器用途较广，既可用于悬浮细胞的培养，又可用于贴壁细胞的培养。其原理是：模拟细胞在体内生长的三维状态，利用反应器内数千根中空纤维的纵向布置，提供细胞近似生理条件的体外生长微环境，使细胞不断生长。中空纤维是一种细微的管状结构，管壁为极薄的半透膜，富含毛细管，培养时纤维管内灌流充以氧气的无血清培养液，管外壁则供细胞黏附生长，营养物质通过半透膜从管内渗透出来供细胞生长；对于血清等大分子营养物，划必须从管外灌入，否则会被半透膜阻隔不能被细胞利用；细胞的代谢废物也可通过半透膜渗入管内，避免了过量代谢物对细胞的毒害作用。典型过程培养动物细胞培养/jpkc/fjgc中空纤维生物反应器用途较广，既可用于悬浮细胞的培养，又可用105优点是：

●占地空间少；

●细胞产量高，细胞密度可达109数量级；

●生产成本低，且细胞培养维持时间长，适用于长期分泌的细胞。

典型过程培养动物细胞培养/jpkc/fjgc优点是：

●占地空间少；

●细胞产量高，细胞密度可达109106细胞生物反应器的控制系统由动物细胞的特性所决定，细胞培养不能沿用微生物发酵过程中常用的手段，安全而有效地方法是高便通入培养罐内气体中的氧气和氮气的比例来实现控制溶氧值的目的，采用二氧化碳/碳酸氢钠缓冲液系统来控制培养液的pH值，它主要是靠预先加入培养基＝液中适量的碳酸氢钠和通过改变气体流量中的二氧化碳含量来实现。典型过程培养动物细胞培养/jpkc/fjgc细胞生物反应器的控制系统由动物细胞的特性所决定，细胞培养不能107生物反应器中的细胞培养模式分批培养分批培养是指将细胞和培养基一次性装入反应器内，进行培炎，细胞不断生长，产物也不断形成，经过一定时间反应后，将整个反应系取出。流加培养流加培养是指先将一定量的培养液装入反应器，在适宜条件下接种细胞，进行培养，细胞不断生长，产物也不断形成。随着细胞对营养物质的不断消耗，新的营养成分不断补充至反应器内，使细胞进一步生长代谢。到反应终止时，取出整个反应系。典型过程培养动物细胞培养/jpkc/fjgc生物反应器中的细胞培养模式分批培养流加培养典型过程培养动物细108半连续培养半连续培养又称为反复分批培养或换液培养，是指在分批培养的基础上不全部取出反应系，剩余部分重新补充新的营养成分，在按分批培养的方式进操作。这是反应器内培养液体积保持不变的操作方式。连续培养连续培养是指将细胞种子和培养液一起加入反应器内进行培养，一方面新鲜培养液不断加入反应器内，另一方面又将反应液连续不断地取出，反应条件处于一种恒定状态。与分批培养和半连续培养不同，连续培养可以控制细胞所处的环境条件长时间的稳定。因此，可以使细胞维持在优化状态下，促进细胞生长和产物形成。典型过程培养动物细胞培养/jpkc/fjgc半连续培养连续培养典型过程培养动物细胞培养http://bi109灌注培养灌