口腔微生物学研究主要方法

口腔微生物学研究的主要方法标本

和处理细菌的培养和分离细菌的鉴定细菌毒力的检测口腔微生物学研究的主要方法一、标本（一）唾液标本（二）牙菌斑标本（三）龈沟液标本（四） 根管标本一、标本（一）唾液标本全唾液刺激唾液非刺激唾液前让受检者漱口用无菌容器取自然排出的唾液0.5~1.0ml细菌培养送检用于微生物检测采用的标本一、标本(二)牙菌斑标本1

龈上菌斑清洁口腔牙上涂布菌斑染色剂漱口棉卷隔湿用无菌的挖匙或探针采集窝沟或唇颊面菌斑转送培养基细菌培养2

龈下菌斑刮出龈上菌斑和漱口

棉卷隔湿带有充气导管

器可卸式取菌器法灭菌纸尖厌氧培养(二)牙菌斑标本转送培养基(三)龈沟液标本沟内法够外法前让受检者漱口去除取样部位的龈上菌斑和牙石细菌培养转送培养基送检(四)根管标本牙髓病根管标本多使用无菌纸尖采样法待检牙采样前处理

、隔湿、等，未开放的牙需开髓处理纸尖放入根管内取样细菌培养转送培养基送检二、细菌的分离和培养（一）菌斑标本的分离和稀释1

分离超声振荡10秒

漩涡振荡器上1-2分钟分散菌斑团块因数量多种类繁多稀释2

稀释（1）稀释液转送培养基：巯基乙醇酸钠培养基乳酪消化的大豆肉汤培养基：TSB

(trypticase

soy

broth)磷酸盐缓冲液：PBS（Phosphate

buffer

saline

）2

稀释（2）方法：10倍系列稀释法不同样本的稀释程度不同10-1

10-2

10-3样本的稀释10-n唾液：10-4~10-6龈沟菌斑：10-1~10-2集合菌斑：10-3

~10-5(二)标本的接种和培养1

培养基非选择性培养基选择性培养基(二)标本的接种和培养2

方法（1）表面划线（2）玻棒接种适用于菌落形成单位（colony

forming

unit，CFU）计算使细菌分散，便于观察单个菌落的形态（3）斜面接种适用于收集较多的细菌纯培养物穿刺接种保存菌种、观察细菌动力及糖分解实验液体培养基接种生化鉴定及观察细菌在体液环境中生长特性2

方法3

标本的孵育温度：36~37℃时间：需氧菌、微需氧菌、兼性厌氧菌需1~2天，厌氧菌需2~3天或1周左右孵育条件：微需氧菌：90%N2、5%CO2厌氧菌：厌氧条件为80%N2、10%CO2、10%H2厌氧罐三、鉴定细菌的常规程序菌落形态和菌体形态生化特性检验代谢产物分析(一)菌落形态和菌体形态1

菌落形态：扁平状、平台状，突起及半圆形等。三、鉴定细菌的常规程序具核梭杆菌“面包屑样菌落”体视显微镜菌落边缘的形状：圆形、波纹状、分叶及锯齿状等。菌落的表面：光滑、粗糙或粘液状，透明、半透明或混浊。(一)菌落形态和菌体形态SM光滑型和粗糙型菌落体视显微镜细菌染色性：常规染色:革兰氏染色，G+，G-芽胞：苯酚复红染色4

菌体的形态鞭毛：鞣酸、明矾、苯酚及甲紫混合液真菌：革兰氏染色和乳酸酚棉染色变形杆菌的鞭毛染色菌细胞呈红色，淡红色的鞭毛位于菌体的四周菌体形态观察：球菌杆菌（二）生化特性检验糖发酵能力过氧化氢酶反应氨基酸代谢七叶苷水解硫化氢试验尿素酶试验学分型变异链球菌根据表面抗原分a~h八个型Aa分为a-e五个型（三）代谢产物分析1.气相色谱分析法为采用气体作为流动相的一种色谱分析技术。所用的载气必须是不与被检测物起作用只为载送试样服务的气体，一般为惰性气体如氢、氮等。（1）气相色谱分析结构载气系统进样系统色谱柱和柱箱检测系统记录系统（2）常用的术语：基线：当色谱柱未接受任何组分进入检测器时系统噪音随时间变化的曲线。正常情况下应是一条直线；保留值：为试样中各组分在色谱柱中滞留时间的数字，以时间或以组分带出色谱柱所需载气的体积表示；区域宽度：是色谱峰区域的宽度，是一个重要的参数，区域宽度越窄，色谱分析的精度越细。（3）气相色谱的用途根据色谱峰的位置进行定性分析根据色谱峰的位置及其宽度进行定量测定高效能、选择性好、灵敏度高（可以检测10-11~10-13g）并且操作简便；可分析易挥发或可转换成易挥发的液体和气体；可分析有机物和部分无机物；沸点在500℃以下，热稳定性好，分子量在400

以下的物质原则上可用。（4）气相色谱分析特点：图1乳杆菌非挥发性代谢有机酸图2韦荣菌挥发性代谢有机酸色谱流出曲线色谱流出曲线图4

产黑色素类杆菌挥发性代谢有机酸图3

粘放菌非挥发性代谢有机酸色谱流出曲线色谱流出曲线图5

消化链球菌挥发性代谢有机酸图6

核梭杆菌挥发性代谢有机酸色谱流出曲线色谱流出曲线2.裂解气相色谱分析法原理是将分子量较大的物质，在高温下裂解，然后进行分离。弥补气相色谱分析技术的不足，适用于难挥发和热不稳定性物质的分析。四、分子生物学鉴定传统分类和鉴定方法，在很大程度上依赖于对

病原菌的成功分离和培养，一般认为能用现有技术培养的微生物仅占总数的1%左右，而不能培养的微生物才是微生物群落多样性的主体。对口腔微生物，40%~50%的细菌用现有技术仍不能培养。PCR技术的发展开辟了细