生化过程参数的检测和控制概要

2022/11/181第七章生化过程参数的检测和控制2022/11/182教学时数：4学时教学目的与要求：了解生化过程参数的分类及生物传感器的种类及特点，能利用生物传感器对生化反应中的直接参数进行检测，并通过参数判断生产过程是否染菌，掌握杂菌染菌的途径及挽救；教学重点：直接参数的检测、生产过程中的染菌及其控制；教学难点：直接参数的检测、生产过程中的染菌及其控制。2022/11/183本章主要内容第一节直接参数的检测与控制第二节生物传感器第三节生产过程中的染菌及其控制2022/11/184教学时数：4学时教学目的与要求：了解生化过程参数的分类及生物传感器的种类及特点，能利用生物传感器对生化反应中的直接参数进行检测，并通过参数判断生产过程是否染菌，掌握杂菌染菌的途径及挽救；教学重点：直接参数的检测、生产过程中的染菌及其控制；教学难点：直接参数的检测、生产过程中的染菌及其控制；2022/11/185

在发酵工业中，除了要考虑已接种的微生物本身的特殊需要外，由于产品的要求还应适当考虑培养基的组成、pH值、温度、水分、氧气、杂菌污染等条件。这些条件的变化反映了发酵过程的动态。人们在实践中，正是通过观察和控制这些工艺条件从而控制和完成发酵过程。当然，这些条件之间是相互联系的、相互影响的，认真研究发酵产物的调控机制，并创造所必需的分析和传感仪表，以提供这些控制发酵工艺取得成效，显然也是生化工程的重要课题。2022/11/186生化过程参数的分类

反映生化过程变化的参数分为两大类：一类是可以直接采用特定的传感器检测的参数称为直接参数，包括各种反映物理环境和化学环境变化的参数：如温度、压力、流量、搅拌功率、转速、泡沫、黏度、浊度、pH、离子强度、溶解氧和基质浓度等。另一类是综合参数，包括细胞生长速率、产物合成速率、呼吸商等。2022/11/187

用于发酵工业的传感器，除了应满足一般测量仪表的要求外，还应具有几个方面的面的特征：（1）传感器能安装在发酵罐内耐受高压蒸汽（120-135℃,30min以上）灭菌处理；（2）传感器及二次仪表具有长期工作稳定性，在1-2周内其测量误差应小于5%；2022/11/188（3）最好能在使用过程中随时校正；（4）材料不易老化，使用寿命长；（5）传感器的探头安装和使用方便；（6）探头不易被物料粘住、堵塞；（7）价格便宜。2022/11/189

第一节直接参数的检测和控制一.温度检测和控制严格保持菌种的生长繁殖和生物合成所需的最适温度，对稳定发酵过程，缩短周期，提高产量，具有重要意义。通常可以采用水银温度计、热电阻监测系统中的温度。普遍使用的热电阻有铂电阻和铜电阻。2022/11/1810铂电阻精度高、稳定性好、性能可靠；铜电阻超过100℃时易被氧化。为了使生物反应在适当的温度下进行，必须采取措施——在夹套或蛇管内通入冷却水加以控制。发酵热的测定(1)通过测量一定时间内冷却水的流量和冷却水的进出。Q发酵=GC(T2-T1)/VQ发酵-----------发酵热;C-------冷却水的比热G-----------冷却水的流量;T1T2------进出口冷却水的温度;V----------发酵液的体积2022/11/1812(2)通过罐温度的自动控制，先使罐温达到恒定，再关闭自控装置，测量温度随时间上升的速率S。

Q发酵=(M1C1+M2C2)S/VM1----------发酵液重量;M2----------发酵罐重量;C1----------发酵液比热;C2----------发酵罐材料比热;S----------温升速率Q发酵---------发酵热2022/11/1813(3)根据化合物的燃烧值计算发酵过程中生物热的近似值。根据赫斯定律，热效应决定于系统的初态和终态，而与变化的途径无关。反应的热效应等于产物的生成热总和减去作用物的生成热总和，也可以用燃烧热来计算热效应，特别对于有机化合物，燃烧热可直接测定，所以采用燃烧热来计算更合适。2022/11/1814

反应热效应等于作用物的燃烧热总和（消耗培养基释放的能）减去生成物的燃烧热总和（产物和菌所具有的能），可用下式计算：(4)测定微生物生长代谢中的耗氧量。

--------发酵过程中生成的发酵热数量；

---------基质完全氧化需氧量与菌体和产物完全氧化需氧量之差，即微生物在生长和代谢过程中所消耗的氧；2022/11/1816---------代表微生物呼吸（供氧）反应的焓变，若以有效电子转移（物质在氧化过程中伴随着能量释放所进行的电子转移）为基准，则：其中为有机化合物氧化时每转移一个有效电子所平均释放出的热量；4为消耗１ｍｏｌＯ２相应的有效电子转移数（当1ｍｏｌ葡萄糖2022/11/1817完全氧化时，需要消耗6ｍｏｌ氧气，相应的有效电子转移数为24，释放的能量应为:所以：

由此可见，通风（耗氧）发酵过程生成的发酵热数量与过程所消耗的氧是成正比。当测得发酵过程中氧的消耗（可根据气体分析和通风量进行计算得到），就能把发酵过程中需要移去的热量计算出来。2022/11/1818

根据理论推导和试验验证，可以用下式对通风发酵过程生成热进行估算：QH=(0.106~0.124)QO2≈(1/10)QO2QO2----------比耗氧速率(mmolO2/g菌体.h)QH-----------发酵热生成的比速(kcal/g菌体.h)

当通风发酵出现溶解氧不足时，有的的微生物能够进行厌氧反应。则出现:QH>>(0.106~0.124)QO2。如果出现这种情况，就可以得出溶氧不足的结论。二.pH的检测和控制pH值可用耐灭菌的玻璃电极和银-汞参比电极以及pH测量仪表的检测系统检测，可连续指示罐内酸碱变化。微生物反应过程中pH的变化具有一定规律。①在微生物细胞的生长阶段，由于所用的微生物菌种不同，相对于接种后的起始pH值有上升或下降趋势2022/11/1820②在生产阶段，一般反应液的pH值趋于稳定，维持在最适合产物形成的范围。③在微生物细胞的自溶阶段，随着培养基中的营养物质的耗尽，微生物细胞内蛋白酶的积累和活跃，微生物自溶，引起培养液中的氨基氮等的增加，致使pH值有上升。引起反应液pH值下降的主要原因有：1.培养基中的碳/氮比例不当，碳源过多，特别是葡萄糖过量或者中间补糖过多或溶解氧不足，致使糖等物质氧化不完全，培养液中有机酸会大量积累，从而使pH值下降2.消泡油加得过多；3.微生物生理性物质的存在，使pH值下降。2022/11/1822引起反应液pH值上升的主要原因有：1.培养基中的碳/氮比例不当，碳源过多，氨基氮释放会使pH值上升。2.生理碱性物质存在。3.中间补料液中氨水或尿素等碱性物质的加入过多。1.调节培养基中的原始pH值，或加入缓冲溶液制成缓冲能力强、pH值变化不大的培养基。2.可在反应过程中加入弱酸或弱碱进行pH值的调节，进而合理地控制发酵条件，也可通过调整通风量来控制pH值。3.进行补料，既调节了培养液的pH值，又可补充营养，增加培养液的浓度和减少阻遏作用，进一步提高产率。反应液中pH值的控制方法2022/11/18244.采用酸性铵盐作为氮源时，由于NH4+被利用后，剩下的酸根会引起发酵液中的pH值下降，在培养液中可加入碳酸钙来调节pH值。5.根据pH值的变化可用流加氨水的方法来调节，同时又可把氨水作为氮源供给。6.以尿素作为氮源进行流加调节pH值。三.泡沫的影响和控制太多的泡沫给反应带来不利的影响1.使反应器的装填系数减少；2.造成大量逃液，导致产物的损失；3.泡沫“顶罐”有可能使培养基从搅拌的轴封渗出，增加了染菌的机会。2022/11/18264.由于泡沫的液位变动，以及不同生长周期微生物随泡沫漂浮，使微生物生长的环境发生了变化，影响了微生物群体的效果，增加了微生物群体的不均一性。5.影响了搅拌的正常进行，妨碍了微生物的呼吸。6.使微生物提早自溶。7.为了控制泡沫，需加入消泡剂。对产物的提取不利。微生物反应过程产生泡沫的原因1.由外界引进的气流被机械地分散形成2.反应过程产生的气体聚结生成的泡沫培养基的物理化学性质对泡沫形成的表面现象起决定作用，此外，培养基的温度、酸碱度、浓度等对过程的泡沫也有一定的影响。培养基中的蛋白质含量越多，反应液的黏度也越大，越容易起泡，泡沫多而且持久稳定。泡沫的控制化学消泡消泡机理：1.消泡剂是表面活性物质，降低气泡表面张力，使气泡破裂2.降低机械强度（降低液膜的弹性）3.降低膜表面的黏度。天然油脂类、高级醇类、聚醚类、硅酮类、氟化烷烃等2022/11/1829生产中的一些用法：(1)通过机械搅拌，使消泡剂更易于分散在反应液中。(2)将消泡剂与载体一起使用，使消泡剂溶于或分散于载体中，比如用聚氧丙烯甘油作消泡剂时，以豆油为载体的消泡增效作用明显。(3)多种消泡剂并用可增强消泡作用。(4)使用乳化剂增强消泡剂的消泡作用，如消泡剂聚氧丙烯甘油用吐温-80为乳化剂的增效作用可提高1~2倍。

机械消泡靠机械强烈振动和压力的变化，促使细胞破裂，或借助机械力将排出气体中的液体加以分离回收，从而达到消泡的作用。机械消泡的优点是不需在发酵液中加入其他物质，减少了由于加入消泡剂所引起的染菌机会和对后续分离的影响。但是机械效果不如化学消泡迅速、可靠、不能根本上消除引起稳定泡沫的因素，而且它还需要一定的设备和消耗一定的动力。液位电极控制消泡剂的流加液位电极是根据空气与带有发酵液的泡沫导电率不同的原理制造。采用双位式的控制方法，当反应物液面达到一定的高度时，自动打开消泡剂的阀门，当液面降回到正常时，自动关闭消泡剂的阀门。2022/11/1832第二节生物传感器传感器（电极或探头）：能感受规定的被测量并按照一定的规律将其转换成可用信号的器件或装置，它通常由敏感元件、转化元件及相应的机械结构和线路组成。生物传感器：是利用酶、抗体、微生物等作为敏感材料，将所感受的生物体信息转换成电信号进行检测的传感器。2022/11/1833生物传感器的应用领域临床检测：葡萄糖85%，乳酸盐及其他4%，研究4%。药物：3%环境：2%食品：2%机器人、国防及其他：<1%2022/11/1834生物传感器的结构和原理

生物传感器的结构一般是在基础传感器(电化学装置）上再耦合一个生物敏感膜（称为感受器或敏感元件）。生物敏感膜紧贴在探头表面上，再用一种半渗透膜与被测溶液隔开。当待测溶液中的成分透过半透膜有选择地附着于敏感物质时，形成复合体，随之进行生化和电化学反应，产生普通电化学装置能感知的O2、H2、NH4+、CO2等，并通过电化学装置转换为电信号生物传感器的特点1)对被检测物质具有极好的选择性，噪音低。2)操作简单，需用样品少，能直接完成测定。3)经固定化处理后，可保持长期生物活性，传感器可经得住反复使用。4)能在短时间内完成测定。5)不要求样品具有透明度。6)主要缺点是寿命较短。2022/11/1836生物传感器的种类酶传感器微生物传感器免疫传感器细胞传感器组织传感器生物电子传感器2022/11/1837发酵工业中的传感器的特点1.传感器能安装在发酵罐内耐受高压蒸汽（120~135℃、30min以上）灭菌处理；2.传感器及二次仪表具有长期工作稳定性，在1~2周内其测定误差应小于5%；3.最好在使用过程中随时校正；2022/11/18384.材料不易老化，使用寿命长；5.传感器探头安装和使用方便；6.探头不易被物料粘住、堵塞；7.价格便宜2022/11/1839第三节生产过程中的染菌及其控制生物反应过程染菌的分析1.种子培养和发酵的异常现象种子培养异常异常的主要表现有菌体生长缓慢、菌丝结团、菌体老化以及培养液的理化参数变化。发酵异常主要表现在菌体生长速度缓慢，形态不粗壮或过早老化，以及糖、氮、pH、泡沫、发酵产物、发酵浓度等理化参数不正常。2022/11/1840染菌的检查与判断

在发酵过程中，如何及早发现杂菌的污染并及时采取措施加以处理，是避免染菌造成严重经济损失的重要手段。

1.显微镜检查法（镜检法）对样品进行涂片、染色，然后在显微镜下观察微生物的形态特征，根据生产菌与杂菌的特征区别，判断是否染菌。2022/11/1841

如发现有与生产菌形态特征不一样的其他微生物的存在，就可断定为发生了染菌。此法检查杂菌最为简单、最直接，也是最常用的检查方法之一。必要时还可进行芽孢染色或鞭毛染色。2.肉汤培养法通常用组成为0.3%牛肉膏、0.5%葡萄糖、0.5%氯化钠、0.8%蛋白胨、0.4%的1%酚红溶液（pH7.2）的葡萄糖酚红肉汤作为培养基，将待检样品直接接入经完全灭菌后的肉汤培养基中，分别于37℃和27℃进行培养，观察微生物生长情况，并进行镜检，判断是否染菌。常用来检查培养基和无菌空气中是否带菌。2022/11/18433.平板划线培养或斜面培养检查法将待检样品在无菌平板上划线，分别于37℃和27℃下进行培养，一般24h后即可进行镜检观察,检查是否有杂菌。有时为了提高平板培养法的灵敏度，也可以将需要检查的样品先置于37℃条件下培养6小时，使杂菌迅速增殖后再划线。4.发酵过程的异常现象观察法根据发酵过程出现的异常现象如溶解氧、pH值、排出气中的CO2含量以及微生物菌体的酶活力等的异常变化来检查发酵是否染菌。溶解氧水平异常变化，对于特定的发酵过程具有一定的溶解氧水平，而且在不同的发酵阶段其溶解氧的水平也是不同的。如果发酵过程中的溶解氧水平发生了异常的变化，一般就是发酵染菌发生的表现。2022/11/1845谷氨酸正常发酵与异常发酵溶解氧变化

由于染菌的杂菌的好氧性不同，产生的溶解氧异常的现象也是不同的。当杂菌是好气性微生物，溶解氧的变化是在短时间内下降，直至接近于零，且在长时间内不能回升；当杂菌是非好气性微生物，而生产菌由于受污染而抑制生长，使耗氧量减少，溶解氧升高。排气中的CO2异常变化，好气性发酵排出的气体中的CO2含量与糖的代谢有关。对于特定的发酵过程，工艺确定后，排出的气体中的CO2含量的变化是有规律的。2022/11/1847染菌后，培养基中糖的消耗发生变化，引起排气中CO2含量的异常变化，如杂菌污染时，糖消耗加快，CO2含量增加，噬菌体污染污染后，糖消耗减缓，CO2含量。还可根据其他一些现象，如泡沫异常增多、发酵液的颜色异常变化，代谢产物异常下跌、发酵周期拖长、黏度异常增加等来判断染菌。

在众多的方法中，应以无菌试验和平板培养为主，其他方法为辅来进行染菌的判断。无菌试验时，如果肉汤培养基连续三次发生变色反应或产生混浊，或平板培养连续三次发现有杂菌菌落的出现，即可判断为染菌。2022/11/1849有时肉汤培养的阳性反应不够明显，而发酵样品的各项参数确有可疑的染菌反应，并经镜检等其他方法确认连续三次有相同类型的杂菌存在，也应该判断为杂菌。无菌试验期间应每六小时观察一次无菌试验样品，以便能及早发现染菌。2022/11/1850杂菌染菌的途径和防治1.种子带菌及其防治（5%~10%）2.空气带菌及其防治（20~30%）3.设备的渗漏或死角造成的染菌及其防治（10%~25%）4.培养基灭菌不彻底导致的染菌（2%~5%）5.噬菌体及其防治2022/11/18512022/11/18522022/11/1853噬菌体染菌及其防治对于利用细菌或放线菌进行的发酵容易受噬菌体的污染，由于噬菌体的感染力非常强，传播蔓延迅速，且较难防治，对发酵生产有很大的威胁。噬菌体是一种病毒，直径0.1μm，可以通过环境污染、设备的渗漏或死角、空气系统、培养基灭菌不彻底、补料过程及操作失误、菌种带进噬菌体或本身是病源性菌株等途径而染菌。2022/11/1854以谷氨酸生产过程染上了噬菌体为例：初期OD值不上升或回降；

pH值逐渐上升，可到8.0以上，且不再下降或pH值稍下降，停滞在7.0~7.2之间，氨的利用停止；糖耗、升温缓慢或停止；产生大量泡沫，有时使发酵液呈现粘胶状；谷氨酸的产量很少，增长缓慢或停止；镜检时