第五章 紫外 可见吸光光度法课件

第五章紫外-可见吸光光度法§5-1吸光光度法的基本原理§5-2光的吸收定律—郎伯-比耳定律§5-3紫外-可见吸光光度计§5-4实验条件的选择§5-5吸光光度法应用示例1第五章紫外-可见吸光光度法§5-1吸光光度法的基本原理§化学分析：常量组分(>1%),Er:0.1%-0.2%

依据化学反应,使用玻璃仪器

化学分析与仪器分析方法比较仪器分析：微量组分(<1%),Er:1%-5%

依据物理或物理化学性质,需要特殊的仪器例:含Fe约0.05%的样品,称0.2g,则m(Fe)≈0.1mg重量法

m(Fe2O3)≈0.14mg,称不准容量法

V(K2Cr2O7)≈0.02mL,测不准光度法结果0.048%～0.052%,满足要求准确度高灵敏度高2化学分析：常量组分(>1%),Er:0.1%-0.2%仪器分析方法分类2.电化学分析法:依据物质的电化学性质及其变化3.色谱法:气相色谱,液相色谱,毛细管电泳法4.质谱法、热分析法、放射化学法等非光谱法（折射法，浊度法，旋光法）（不以光的波长为特征讯号）光谱法分子光谱法UV/Vis,IR,NMR原子光谱法AAS,AES,AFS（以光的吸收、发射等作用而建立的分析方法，通过检测光谱的波长和强度来进行定性和定量的方法）光学分析法1.光学分析法:基于电磁辐射与物质的相互作用.3仪器分析方法分类2.电化学分析法:依据物质的电化学性质及吸光光度法

基于被测物质的分子

对光

具有选择吸收的特性而建立的分析方法。§5-1吸光光度法的基本原理

特点

灵敏度高：测定下限可达10-5-10-6mol·L-1；准确度能够满足微量组分的测定要求：相对误差2%-5％操作简便、快速、选择性好、仪器设备简单应用广泛4吸光光度法基于被测物质的分子对光具有选择吸收的特性而一、光的基本性质波动性光的传播速度:c－真空中光速3.0×108m/s－波长，单位：m,cm,mm,m,nm,Å

1m=10-6m,1nm=10-9m,1Å=10-10m

－频率，单位：Hz次/秒5一、光的基本性质波动性光的传播速度:c－真空中光速

h－普朗克(Planck)常数6.626×10-34J·s E－光量子具有的能量单位：J(焦耳)，eV(电子伏特)1eV=1.602×10－19J微粒性光量子，具有能量：6 h－普朗克(Planck)常数6.626×10-34J结论:一定波长的光具有一定的能量，波长越长(频率越低)，光量子的能量越低.单色光：具有相同能量(相同波长)的光.混合光：具有不同能量(不同波长)的光复合在一起.例如白光.波粒二象性7结论:一定波长的光具有一定的能量，波长越长(频率越射线x射线紫外光红外光微波无线电波10-2nm10nm102nm104nm0.1cm10cm103cm105cm可见光光学光谱区8射线x射线紫外光红外光微波无线电波10-2nm二、物质对光的选择性吸收物质的颜色与光的关系完全吸收完全透过吸收黄色光光谱示意表观现象示意复合光9二、物质对光的选择性吸收物质的颜色与光的关系完全吸收完全透过/nm颜色互补光400-450紫黄绿450-480蓝黄480-490绿蓝橙490-500蓝绿红500-560绿红紫560-580黄绿紫580-610黄蓝610-650橙绿蓝650-760红不同颜色的可见光波长及其互补光蓝绿10/nm颜色互补光400-450紫黄绿450-480蓝黄48价电子相对于原子核的运动--电子能级;能级差：1-20ev；吸收波长：1.25-0.06m；紫外-可见光谱或电子光谱。2.原子核在其平衡位置附近的相对振动--振动能级;能级差：0.05-1ev；吸收波长：25-1.25m；红外光谱或分子振-转光谱。3.分子本身绕其重心的转动--转动能级.能级差：0.005-0.05ev；吸收波长：250-25m；远红外光谱或分子转动光谱。物质分子内部3种运动形式及其对应能级11价电子相对于原子核的运动--电子能级;物质分子内部3种运动三、定性分析与定量分析的基础定性分析基础定量分析基础物质对光的选择吸收ABA在一定的实验条件下，物质对光的吸收与物质的浓度成正比。AC增大12三、定性分析与定量分析的基础定性分析基础定量分析基础物质对光§5-2光的吸收定律—郎伯-比耳定律郎伯-比耳定律；吸光度与透光度的关系；偏离郎伯-比耳定律的原因；13§5-2光的吸收定律—郎伯-比耳定律郎伯-比耳定律；1一、郎伯-比耳定律透光度(透射比)Transmittance透光度定义：T取值为0.0%~100.0%全部吸收T=0.0%全部透射T=100.0%入射光I0透射光I14一、郎伯-比耳定律透光度(透射比)Transmittan朗伯定律:(1760)Ab当入射光的、吸光物质的c一定时，溶液的吸光度A与液层厚度b成正比.比耳定律(1852)Ac 当入射光的、液层厚度b

一定时，溶液的吸光度A与吸光物质的c成正比.15朗伯定律:(1760)Ab比耳定律(1852)意义：当一束平行单色光通过均匀、透明的、非散射的吸光物质时，其吸光度与溶液液层的厚度和浓度的乘积成正比。A=lg(I0/I)=abc前提条件：单色光：应选用max处测定；吸光质点形式不变；

离解、络合、缔合会破坏线性关系,应控制条件(酸度、浓度、介质等)；稀溶液：浓度太大，分子间作用力增强。16意义：当一束平行单色光通过均匀、透明的、非散射的吸光物质时，吸光度与透光度T：透光度A：吸光度1.00.50ACA100500T%TT=0.0%A=∞T=100.0%A=0.0A=0.434T=36.8%17吸光度与透光度T：透光度A：吸光度1.0ACA100T吸光系数b:吸光液层的厚度,cmc:吸光物质的浓度,g/L,mol/La：比例常数入射光波长物质的性质温度取值与浓度的单位相关c:mol/La

κ摩尔吸光系数,cm-1·mol–1·Lc:g/La吸光系数,L·g–1·cm-1MolarAbsorptivity18吸光系数b:吸光液层的厚度,cmc:吸光物质的浓度,溶液浓度的测定A＝κbc工作曲线法(标准曲线)朗伯-比耳定律的分析应用01.02.03.04.0cA。。。。*0.800.600.400.200.00Axcx吸光度的加和性与吸光度的测量A=A1+A2+…+An19溶液浓度的测定A＝κbc工作曲线法朗伯-比耳定律的分析应用二、偏离郎伯-比耳定律的原因AC主要原因非单色光吸光质点的相互作用20二、偏离郎伯-比耳定律的原因AC主要原因非单色光吸光质点的相§5-3紫外-可见吸光光度计分光光度计的构成；分光光度法的灵敏度和准确度21§5-3紫外-可见吸光光度计分光光度计的构成；2122222323紫外-可见分光光度法,UV-VIS0.434光源单色器吸收池检测器显示24紫外-可见分光光度法,UV-VIS0.434光源单色器吸收吸光分析法的仪器简介紫外-可见分光光度计组件光源单色器样品池检测器显示装置氢灯,氘灯,180-375nm;卤钨灯,320-2500nm.基本要求:光源强,能量分布均匀,稳定作用:将复合光色散成单色光棱镜光栅玻璃,350-3200nm,石英,185-4000nm光学玻璃,石英作用:将光信号转换为电信号,并放大光电池，光电管,光电倍增管,光导摄像管(多道分析器)微安表、检流计、屏幕、数字显示记录仪25吸光分析法的仪器简介紫外-可见分光光度计组件光源单色器样品池氙灯氢灯钨灯26氙灯氢灯钨灯26棱镜：依据不同波长光通过棱镜时折射率不同入射狭缝准直透镜棱镜聚焦透镜出射狭缝白光红紫λ1λ280060050040027棱镜：依据不同波长光通过棱镜时折射率不同入射狭缝准直透镜棱镜光栅：在镀铝的玻璃表面刻有数量很大的等宽度等间距条痕(600、1200、2400条/mm)。

利用光通过光栅时发生衍射和干涉现象而分光。波长范围宽,色散均匀,分辨性能好,使用方便.光栅衍射示意图M1M2出射狭缝光屏透镜平面透射光栅28光栅：在镀铝的玻璃表面刻有数量很大的等宽度等间距条痕(600单光束分光光度计可变波长单光束紫外-可见分光光度计示意图29单光束分光光度计可变波长单光束紫外-可见分光光度计示意图29吸光光度法的灵敏度与准确度灵敏度吸光光度法是一种适合于微量组分测定的仪器分析法，检测限大多可达10-3~10-4g/L或~g/mL数量级。准确度能满足微量组分测定的要求。一般相对误差2~5%。30吸光光度法的灵敏度与准确度灵敏度吸光光度法是一种适合于微量组对摩尔系数的理解一32+桔红色508邻二氮菲κ=1.1104测定工作曲线的斜率即为摩尔吸收系数摩尔吸收系数是对吸光物质而言，是由吸光物质的结构特征，吸光面积等因素决定。灵敏度的表示方法摩尔吸光系数κ当b=1时，AC0κ31对摩尔系数的理解一32+桔红色508邻二氮菲κ=1.1对摩尔系数的理解二对同一种待测物质，不同的方法具有不同的κ，表明具有不同的灵敏度。例：分光光度法测铜铜试剂法测Cuκ426=1.28104Lmol-1cm-1双硫腙法测Cuκ495=1.58105Lmol-1cm-1一般情况κ

<104

κ

:

104~105

κ

>105低灵敏度中等灵敏度高灵敏度32对摩尔系数的理解二对同一种待测物质，不同的方法具有不同的κ影响准确度的因素仪器测量误差吸光定律根据误差传递公式，有又得浓度测量的相对偏差令得T=0.368=36.8%A=0.434时，仪器测量误差最小33影响准确度的因素仪器测量误差吸光定律根据误差传递公式，有又1086420204060800.70.40.20.1AT/%Er(36.8)0.434浓度测量的相对误差与T(或A)的关系实际工作中，应控制T在10～70％,

A在0.15～1.0之间(调c,b,)341086420204060800.70.40.20.1AT/§5-4实验条件的选择测量条件；分析条件；35§5-4实验条件的选择测量条件；35测量条件的选择测量波长的选择无干扰，选择测量max有干扰AA待测溶液吸光度的选择控制A=0.2~0.8T=65%~15%方法选择C选择b1非单色光影响小2灵敏度高36测量条件的选择测量波长的选择无干扰，选择测量max有干扰A用参比溶液调T=100%（A=0），再测样品溶液的吸光度，即消除了吸收池对光的吸收、反射，溶剂、试剂对光的吸收等。参比溶液I0I参比样品入射光I0透射光I37用参比溶液调T=100%（A=0），再测样品溶参比溶液的选择原则：扣除非待测组分的吸收以显色反应为例进行讨论M+R=M-Rmax试液显色剂溶剂吸光物质参比液组成无吸收无吸收光学透明溶剂基质吸收无吸收吸收不加显色剂的试液无吸收吸收吸收显色剂基质吸收吸收吸收吸收显色剂+试液+待测组分的掩蔽剂若欲测M-R的吸收A(样)=A(待测吸光物质)+A(干扰)+A(池)A(参比)=A(干扰)+A(池)38参比溶液的选择原则：扣除非待测组分的吸收以显色反应为例进行讨吸光光度法分析条件的选择显色反应有机物质官能团强吸收直接测定UV-VIS官能团弱吸收衍生化反应UV-VIS显色反应无机物质通常通过显色反应生成吸光系数大的有色物质进行测定，以提高灵敏度。32+桔红色508邻二氮菲39吸光光度法分析条件的选择显色反应有机物质官能团强吸收直接测定显色剂与显色反应：：：：助色团－NH，－OH，－X（孤对电子）neO生色团：－N＝N－，－N＝O，OC=S,－N（共轭双键）πe40显色剂与显色反应：：：：助色团－NH，－OH，－X（孤显色反应的选择灵敏度高，一般ε>104;选择性好;显色剂在测定波长处无明显吸收,

对照性好,max>60nm;反应生成的有色化合物组成恒定，稳定;显色条件易于控制，重现性好.41显色反应的选择灵敏度高，一般ε>104;41酸度的选择酸度的影响副反应M+nR=MRnOH-H+存在型体的变化RH=R-+H+

12生成不同配比的络合物例，磺基水杨酸–Fe3+pH=2-3FeR紫红色pH=4-7FeR2橙色pH=8-10FeR3黄色42酸度的选择酸度的影响副反应M+nR=MRn酸度的选择理论计算M+nR=MRnOH-H+例：邻二氮菲-亚铁反应完全度与pH的关系

cR≈[R]=10-4mol·L-143酸度的选择理论计算M+nR=MRnOH-H以作图，可得适宜pH范围实际工作，作A~pH曲线，寻找适宜pH范围。ApHpH3-844以作图，可得适宜pH范围实际工作，作A~pH曲线，寻显色剂的用量M+nR=MRn定量反应理论计算45显色剂的用量M+nR=MRn定量反应理论计c(R)c(R)c(R)实际工作，作A-CR曲线，寻找适宜CR范围。46c(R)c(R)c(R)实际工作，作A-CR曲线，寻找适温度的选择实际工作，作A-T曲线，寻找适宜反应温度。ATATATATAT反应时间的选择实际工作，作A-t曲线，寻找适宜反应时间。47温度的选择实际工作，作A-T曲线，寻找适宜反应温度。AT测定中的干扰以及消除方法Co2+,Fe3+Co2+FeF63-Co(SCN)2(蓝)⑴NaFSCN-Co2+Fe2+,Sn4+(2)Sn2+Co(SCN)2SCN-测Co2+:(掩蔽法)化学法

48测定中的干扰以及消除方法Co2+,Fe3+Co2+Co(S§5-5吸光光度法应用示例单组分的测定；多组分的测定；紫外光度法在生物学中的应用；49§5-5吸光光度法应用示例单组分的测定；49纯物质或共存物质不干扰单组分的测定1.金属离子:Ni-丁二酮肟,Co-钴试剂2.磷的测定:DNA中含P～9.2%,RNA中含P～9.5%,H3PO4+12(NH4)2MoO4+21HNO3=(NH4)3PO4·12MoO3+12NH4NO3+12H2O磷钼黄(κ小)磷钼(V)蓝(κ大)Sn2+50纯物质或共存物质不干扰单组分的测定1.金属离子:Ni-丁

κxl1,κyl1,κxl2,κyl2由x,y标液在1,2处分别测得.在1处测组分x,在2处测组分y.b)在1处测组分x;在2处测总吸收,扣除x吸收,可求y.c)x,y组分不能直接测定多组分的测定51κxl1,κyl1,κxl2,κyl2由x,y吸光光度法在生物学中的应用蛋白质含量测定（氨基酸测定）核酸测定酶及微生物代谢研究52吸光光度法在生物学中的应用蛋白质含量测定（氨基酸测定）52第五章紫外-可见吸光光度法§5-1吸光光度法的基本原理§5-2光的吸收定律—郎伯-比耳定律§5-3紫外-可见吸光光度计§5-4实验条件的选择§5-5吸光光度法应用示例53第五章紫外-可见吸光光度法§5-1吸光光度法的基本原理§化学分析：常量组分(>1%),Er:0.1%-0.2%

依据化学反应,使用玻璃仪器

化学分析与仪器分析方法比较仪器分析：微量组分(<1%),Er:1%-5%

依据物理或物理化学性质,需要特殊的仪器例:含Fe约0.05%的样品,称0.2g,则m(Fe)≈0.1mg重量法

m(Fe2O3)≈0.14mg,称不准容量法

V(K2Cr2O7)≈0.02mL,测不准光度法结果0.048%～0.052%,满足要求准确度高灵敏度高54化学分析：常量组分(>1%),Er:0.1%-0.2%仪器分析方法分类2.电化学分析法:依据物质的电化学性质及其变化3.色谱法:气相色谱,液相色谱,毛细管电泳法4.质谱法、热分析法、放射化学法等非光谱法（折射法，浊度法，旋光法）（不以光的波长为特征讯号）光谱法分子光谱法UV/Vis,IR,NMR原子光谱法AAS,AES,AFS（以光的吸收、发射等作用而建立的分析方法，通过检测光谱的波长和强度来进行定性和定量的方法）光学分析法1.光学分析法:基于电磁辐射与物质的相互作用.55仪器分析方法分类2.电化学分析法:依据物质的电化学性质及吸光光度法

基于被测物质的分子

对光

具有选择吸收的特性而建立的分析方法。§5-1吸光光度法的基本原理

特点

灵敏度高：测定下限可达10-5-10-6mol·L-1；准确度能够满足微量组分的测定要求：相对误差2%-5％操作简便、快速、选择性好、仪器设备简单应用广泛56吸光光度法基于被测物质的分子对光具有选择吸收的特性而一、光的基本性质波动性光的传播速度:c－真空中光速3.0×108m/s－波长，单位：m,cm,mm,m,nm,Å

1m=10-6m,1nm=10-9m,1Å=10-10m

－频率，单位：Hz次/秒57一、光的基本性质波动性光的传播速度:c－真空中光速

h－普朗克(Planck)常数6.626×10-34J·s E－光量子具有的能量单位：J(焦耳)，eV(电子伏特)1eV=1.602×10－19J微粒性光量子，具有能量：58 h－普朗克(Planck)常数6.626×10-34J结论:一定波长的光具有一定的能量，波长越长(频率越低)，光量子的能量越低.单色光：具有相同能量(相同波长)的光.混合光：具有不同能量(不同波长)的光复合在一起.例如白光.波粒二象性59结论:一定波长的光具有一定的能量，波长越长(频率越射线x射线紫外光红外光微波无线电波10-2nm10nm102nm104nm0.1cm10cm103cm105cm可见光光学光谱区60射线x射线紫外光红外光微波无线电波10-2nm二、物质对光的选择性吸收物质的颜色与光的关系完全吸收完全透过吸收黄色光光谱示意表观现象示意复合光61二、物质对光的选择性吸收物质的颜色与光的关系完全吸收完全透过/nm颜色互补光400-450紫黄绿450-480蓝黄480-490绿蓝橙490-500蓝绿红500-560绿红紫560-580黄绿紫580-610黄蓝610-650橙绿蓝650-760红不同颜色的可见光波长及其互补光蓝绿62/nm颜色互补光400-450紫黄绿450-480蓝黄48价电子相对于原子核的运动--电子能级;能级差：1-20ev；吸收波长：1.25-0.06m；紫外-可见光谱或电子光谱。2.原子核在其平衡位置附近的相对振动--振动能级;能级差：0.05-1ev；吸收波长：25-1.25m；红外光谱或分子振-转光谱。3.分子本身绕其重心的转动--转动能级.能级差：0.005-0.05ev；吸收波长：250-25m；远红外光谱或分子转动光谱。物质分子内部3种运动形式及其对应能级63价电子相对于原子核的运动--电子能级;物质分子内部3种运动三、定性分析与定量分析的基础定性分析基础定量分析基础物质对光的选择吸收ABA在一定的实验条件下，物质对光的吸收与物质的浓度成正比。AC增大64三、定性分析与定量分析的基础定性分析基础定量分析基础物质对光§5-2光的吸收定律—郎伯-比耳定律郎伯-比耳定律；吸光度与透光度的关系；偏离郎伯-比耳定律的原因；65§5-2光的吸收定律—郎伯-比耳定律郎伯-比耳定律；1一、郎伯-比耳定律透光度(透射比)Transmittance透光度定义：T取值为0.0%~100.0%全部吸收T=0.0%全部透射T=100.0%入射光I0透射光I66一、郎伯-比耳定律透光度(透射比)Transmittan朗伯定律:(1760)Ab当入射光的、吸光物质的c一定时，溶液的吸光度A与液层厚度b成正比.比耳定律(1852)Ac 当入射光的、液层厚度b

一定时，溶液的吸光度A与吸光物质的c成正比.67朗伯定律:(1760)Ab比耳定律(1852)意义：当一束平行单色光通过均匀、透明的、非散射的吸光物质时，其吸光度与溶液液层的厚度和浓度的乘积成正比。A=lg(I0/I)=abc前提条件：单色光：应选用max处测定；吸光质点形式不变；

离解、络合、缔合会破坏线性关系,应控制条件(酸度、浓度、介质等)；稀溶液：浓度太大，分子间作用力增强。68意义：当一束平行单色光通过均匀、透明的、非散射的吸光物质时，吸光度与透光度T：透光度A：吸光度1.00.50ACA100500T%TT=0.0%A=∞T=100.0%A=0.0A=0.434T=36.8%69吸光度与透光度T：透光度A：吸光度1.0ACA100T吸光系数b:吸光液层的厚度,cmc:吸光物质的浓度,g/L,mol/La：比例常数入射光波长物质的性质温度取值与浓度的单位相关c:mol/La

κ摩尔吸光系数,cm-1·mol–1·Lc:g/La吸光系数,L·g–1·cm-1MolarAbsorptivity70吸光系数b:吸光液层的厚度,cmc:吸光物质的浓度,溶液浓度的测定A＝κbc工作曲线法(标准曲线)朗伯-比耳定律的分析应用01.02.03.04.0cA。。。。*0.800.600.400.200.00Axcx吸光度的加和性与吸光度的测量A=A1+A2+…+An71溶液浓度的测定A＝κbc工作曲线法朗伯-比耳定律的分析应用二、偏离郎伯-比耳定律的原因AC主要原因非单色光吸光质点的相互作用72二、偏离郎伯-比耳定律的原因AC主要原因非单色光吸光质点的相§5-3紫外-可见吸光光度计分光光度计的构成；分光光度法的灵敏度和准确度73§5-3紫外-可见吸光光度计分光光度计的构成；2174227523紫外-可见分光光度法,UV-VIS0.434光源单色器吸收池检测器显示76紫外-可见分光光度法,UV-VIS0.434光源单色器吸收吸光分析法的仪器简介紫外-可见分光光度计组件光源单色器样品池检测器显示装置氢灯,氘灯,180-375nm;卤钨灯,320-2500nm.基本要求:光源强,能量分布均匀,稳定作用:将复合光色散成单色光棱镜光栅玻璃,350-3200nm,石英,185-4000nm光学玻璃,石英作用:将光信号转换为电信号,并放大光电池，光电管,光电倍增管,光导摄像管(多道分析器)微安表、检流计、屏幕、数字显示记录仪77吸光分析法的仪器简介紫外-可见分光光度计组件光源单色器样品池氙灯氢灯钨灯78氙灯氢灯钨灯26棱镜：依据不同波长光通过棱镜时折射率不同入射狭缝准直透镜棱镜聚焦透镜出射狭缝白光红紫λ1λ280060050040079棱镜：依据不同波长光通过棱镜时折射率不同入射狭缝准直透镜棱镜光栅：在镀铝的玻璃表面刻有数量很大的等宽度等间距条痕(600、1200、2400条/mm)。

利用光通过光栅时发生衍射和干涉现象而分光。波长范围宽,色散均匀,分辨性能好,使用方便.光栅衍射示意图M1M2出射狭缝光屏透镜平面透射光栅80光栅：在镀铝的玻璃表面刻有数量很大的等宽度等间距条痕(600单光束分光光度计可变波长单光束紫外-可见分光光度计示意图81单光束分光光度计可变波长单光束紫外-可见分光光度计示意图29吸光光度法的灵敏度与准确度灵敏度吸光光度法是一种适合于微量组分测定的仪器分析法，检测限大多可达10-3~10-4g/L或~g/mL数量级。准确度能满足微量组分测定的要求。一般相对误差2~5%。82吸光光度法的灵敏度与准确度灵敏度吸光光度法是一种适合于微量组对摩尔系数的理解一32+桔红色508邻二氮菲κ=1.1104测定工作曲线的斜率即为摩尔吸收系数摩尔吸收系数是对吸光物质而言，是由吸光物质的结构特征，吸光面积等因素决定。灵敏度的表示方法摩尔吸光系数κ当b=1时，AC0κ83对摩尔系数的理解一32+桔红色508邻二氮菲κ=1.1对摩尔系数的理解二对同一种待测物质，不同的方法具有不同的κ，表明具有不同的灵敏度。例：分光光度法测铜铜试剂法测Cuκ426=1.28104Lmol-1cm-1双硫腙法测Cuκ495=1.58105Lmol-1cm-1一般情况κ

<104

κ

:

104~105

κ

>105低灵敏度中等灵敏度高灵敏度84对摩尔系数的理解二对同一种待测物质，不同的方法具有不同的κ影响准确度的因素仪器测量误差吸光定律根据误差传递公式，有又得浓度测量的相对偏差令得T=0.368=36.8%A=0.434时，仪器测量误差最小85影响准确度的因素仪器测量误差吸光定律根据误差传递公式，有又1086420204060800.70.40.20.1AT/%Er(36.8)0.434浓度测量的相对误差与T(或A)的关系实际工作中，应控制T在10～70％,

A在0.15～1.0之间(调c,b,)861086420204060800.70.40.20.1AT/§5-4实验条件的选择测量条件；分析条件；87§5-4实验条件的选择测量条件；35测量条件的选择测量波长的选择无干扰，选择测量max有干扰AA待测溶液吸光度的选择控制A=0.2~0.8T=65%~15%方法选择C选择b1非单色光影响小2灵敏度高88测量条件的选择测量波长的选择无干扰，选择测量max有干扰A用参比溶液调T=100%（A=0），再测样品溶液的吸光度，即消除了吸收池对光的吸收、反射，溶剂、试剂对光的吸收等。参比溶液I0I参比样品入射光I0透射光I89用参比溶液调T=100%（A=0），再测样品溶参比溶液的选择原则：扣除非待测组分的吸收以显色反应为例进行讨论M+R=M-Rmax试液显色剂溶剂吸光物质参比液组成无吸收无吸收光学透明溶剂基质吸收无吸收吸收不加显色剂的试液无吸收吸收吸收显色剂基质吸收吸收吸收吸收显色剂+试液+待测组分的掩蔽剂若欲测M-R的吸收A(样)=A(待测吸光物质)+A(干扰)+A(池)A(参比)=A(干扰)+A(池)90参比溶液的选择原则：扣除非待测组分的吸收以显色反应为例进行讨吸光光度法分析条件的选择显色反应有机物质官能团强吸收直接测定UV-VIS官能团弱吸收衍生化反应UV-VIS显色反应无机物质通常通过显色反应生成吸光系数大的有色物质进行测定，以提高灵敏度。32+桔红色508邻二氮菲91吸光光度法分析条件的选择显色反应有机物质官能团强吸收直接测定显色剂与显色反应：：：：助色团－NH，－OH，－X（孤对电子）neO生色团：－N＝N－，－N＝O，OC=S,－N（共轭双键）πe92显色剂与显色反应：：：：助色团－NH，－OH，－X（孤显色反应的选择灵敏度高，一般ε>104;选择性好;显色剂在测定波长处无明显吸收,