结核病的实验室诊断分析课件

结核病的实验室诊断结核病的实验室诊断主要内容结核病的流行情况1结核病的病原学32结核病的实验室诊断3结核病的分子药敏34主要内容结核病的流行情况1结核病的病原学32结核病的实验室诊1.结核病的流行概况全球范围内结核病疫情急剧恶化人口大规模流动结核菌耐药现象益发严重结核病合并艾滋病感染我国是世界上仅低于印度的第二结核病大国结核菌感染率44.5%新发活动性结核患者130万/年死亡13万/年1.结核病的流行概况全球范围内结核病疫情急剧恶化2011WHOtuberculosiscontrolreport我国是全球27个耐药结核病高负担国家之一2013年世界卫生组织宣布全球耐多药结核病紧急状态2011WHOtuberculosiscontrol全球的结核病患者,在接受治疗之前已经传染给了别人！！！早期快速诊断与治疗成为制约结核病控制的关键：有细菌学诊断依据的病人不超过50%全球的结核病患者,在接受治疗之前已经传染给了别人！！！早期快当前结核研究的热点新型抗结核药物(50%)新型快速诊断技术(40%)新型结核疫苗(10%)当前结核研究的热点新型抗结核药物(50%)7/45近期结核病诊断方法的相关研究JID2012:205(Suppl2),S147.近期结核病诊断方法的相关研究JID2012:205(Su2.结核病的病原学

结核分枝杆菌(M.tuberculosis)是引起人类结核病的主要病原体。1882年由德国医生Koch发现。结核分枝杆菌属于厚壁门、裂殖菌纲、放线菌目、分枝杆菌科、分枝杆菌属。分枝杆菌复合群共包括人型、牛型、非洲型和田鼠型，而人型结核分枝杆菌是人类主要的致病菌。2022/11/18GDTB82.结核病的病原学结核分枝杆菌(M.tuberculosi结核分枝杆菌(M.tuberculosis)生物学主要特点：1.细胞壁中含有大量脂质2.引起的疾病都呈慢性，并伴肉芽肿3.抗酸染色阳性结核分枝杆菌(M.tuberculosis)生物学主要特点：生长特点：生长缓慢，繁殖一代在人工培养基内约需要15～20小时，在静脉感染未经免疫小鼠肺中约需要15小时，在巨噬细胞内约需要15～20小时，在家兔角膜中约需要20～22小时。生长特点：实验室检查方法的历史1880s Tuberclebacilli的发现

Ziehl-Neelsen染色方法1900s Mantouxtest(TSTwithtuberculin)1920s Petragnani

medium

PurifiedProteinDerivative（PPD）1930s Lewenstein-Jensen培养基1940s Dubosagar,Ogawa培养基1950s Middlebrook7H91990s NAAT2000s ELISPOT,QuantiFERON,2010s LPA,GeneXpert2020s

???实验室检查方法的历史1880s Tuberclebacil3.结核病的实验室诊断细菌学涂片：敏感性低传统固体培养：所需时间长，2~3月分子生物学TB-DNATB-mRNA血清/免疫学IGRA：有望替代TST，但不能区分活动性TB与潜伏感染血清学：存在抗原纯度和特异性差等方面的问题液体培养及药敏试验：平均时间20天3.结核病的实验室诊断细菌学涂片：传统固体培养：所需①.细菌学诊断①.细菌学诊断萋尼氏染色荧光染色罗氏培养/药敏试验我国目前最常用的结核病实验室诊断技术快培/药敏试验萋尼氏染色荧光染色罗氏培养/我国目前最常用的结核病实验室诊断涂片►干燥►固定初染脱色复染显微镜检查登记/报告显微镜检查碱性复红盐酸酒精亚甲兰石炭酸金胺O盐酸酒精高锰酸钾光学显微镜检查荧光显微镜检查涂片►干燥►固定初染脱色复染显微镜检查登记/报告显萋尼氏染色镜下形态萋尼氏染色镜下形态荧光染色镜下形态荧光染色镜下形态LEDFluorescencemicroscopy

LED荧光显微镜LEDFluorescencemicroscopy

LELED荧光显微镜成本低廉的超亮发光二极管可承受的价格，价格接近于现有的光学显微镜寿命长（~15-20,000小时）省电可用电池供能可靠性更强不需要空调设施不需要暗室诊断性能优于标准荧光显微镜操作人员工作负荷减轻LED荧光显微镜成本低廉的超亮发光二极管普通荧光显微镜和发光二极管荧光显微镜性能比较（不同实验室的结果进行汇总与平均）显微镜方法灵敏度(%)特异度(%)普通荧光显微镜直接涂片67.496.1普通荧光显微镜浓集涂片66.699.2发光二极管荧光显微镜直接涂片71.6(p=0.1025)96.4发光二极管荧光显微镜浓集涂片72.4(p=0.0073)98.8普通荧光显微镜和发光二极管荧光显微镜性能比较（不同实验室的结

Bactec®MGIT960/320Bact/Alert3DVERSATREK生产厂家美国BD公司法国生物梅里埃公司美国Trek诊断公司仪器定位专业分枝杆菌检测系统业内金标准普通细菌血培养系统需加装分枝杆菌培养特殊组件普通细菌血培养系统需加装分枝杆菌培养特殊组件单机容量960个检测位每年可至少检测8000个样本240个瓶位每年可检测2000个样本528个瓶位日均标本处理量25~30个6~7个9个检测原理荧光增强法：采用敏感性较强的荧光信号探测氧气的变化情况，只需单一反应，所以速度快，准确性高PH值比色法：当培养瓶内有微生物生长，其释放出的CO2，经水饱和后，产生H+，使PH值产生变化，感应器的颜色也随之变化。需双重反应，因此速度较慢，假阳性率较高，此技术已趋向淘汰压力检测：检测细菌生长中各种气体产生和消耗而引起的瓶内压力的变化。灵敏度差。此技术已趋向淘汰检测技术瓶外检测技术瓶外检测技术瓶内检测技术易导致污染及生物安全问题平均阳性报告时间8－11天15－21天不详药敏试剂5种一线抗TB药物，全部具有FDA及SFDA认证无药敏试剂提供只有3种一线药物培养/药敏试验Bactec®MGIT960/320Bact/Alert阴性培养阳性培养无或微弱荧光FFFO2FO2FO2FO2FO2FFO2FO2CO2O2O2O2O2O2O2O2O2CO2CO2O2FFFFFO2FO2FFFFCO2O2O2O2O2O2强荧光传感器对氧气高度敏感的钌复合物肉汤改良Middlebrook7H9肉汤上部空间已预先充填10%CO2BACTEC™MGIT™960/320

指示器系统阴性培养阳性培养无或微弱荧光FFFO2FO2FO2FO2FOMGIT/3D制造的液体培养基优点比固体培养快(平均10-12天vs.20-24天)比固体培养基更敏感可以自动判读，或使用标准指示管和操作手册进行判读也加快了药敏试验的速度局限需要NALC-NaOH进行痰处理和离心普通菌群的污染很常见比固体培养更经常地检出非结核分枝杆菌（常常不致病）确定诊断前必须对所有的阳性培养物进行结核分枝杆菌的鉴定比固体培养基昂贵MGIT/3D制造的液体培养基优点②血清学诊断血清学诊断技术优势：是一种对疾病进行早期诊断的理想方法。无需活细胞培养和特殊仪器设备操作简便结果显示快速目前用于血清学诊断的主要方法:酶联免疫吸附试验(ELlSA)斑点金免疫渗滤法(DIGFA)免疫印迹法(WesternBlotting)等等②血清学诊断血清学诊断技术优势：是一种对疾病进行早期诊断的理WHO对来自不同国家的19种试剂盒产品进行评估，结果表明：与痰培养相比，这些试剂盒检测的灵敏度为1%~60%，特异度为53~99%1

。原因：由于所用的测定方法、使用的试剂种类或抗原、抗体的不同等，导致测定结果差异较大，并且缺乏可比性。WHO认为现有的血清学诊断试剂的敏感度和特异度都有待进一步提高，不推荐其作为一种快速诊断的方法在临床使用。1WHOWorldHealthOrganization.DiagnosisevaluationseriesNo.2:laboratory-basedevalutionof19commerciallyavailablerapiddiagnostictestsfortuberculosis.2008.WHO对结核抗体评估WHO对来自不同国家的19种试剂盒产品进行评估，结果表明：与2011年WHO正式公告：由于目前的商业血清学试剂在结核检测中存在较大差异，且检测结果很高比例的假阳性和假阴性，因此不建议使用血清学方法作为结核杆菌的诊断实验1。1WHOCommercialSerodiagnosticTestsforDiagnosisofTuberculosis./publications/2011/9789241502054_eng.pdf不能早期诊断！容易漏诊、误诊！血清学检测的评价2011年WHO正式公告：由于目前的商业血清学试剂在结核检测结核感染者体内存在特异的效应T淋巴细胞，效应T淋巴细胞再次受到结核抗原刺激时会分泌多种细胞因子（IFN-γ）。因此，检测效应T淋巴细胞可用于结核病或结核潜伏感染者的诊断。由于效应T细胞存活时间很短，而且具有特异性，因此可以作为机体是否正处于被感染的指标，无论是否有临床症状。基于IGRA原理的产品目前已被美国、加拿大、英国、德国、意大利、瑞士、法国、荷兰、日本等二十余个国家写入本国的结核诊疗指南中。目前应用的进口IGRA主要有两种商品化的试剂：1）澳大利亚Cellestis公司的QuantiFERON-TBGOLDInTube（QFT-GIT）2）英国OxfordImmunotec公司的T-SPOT.TB蛋白水平分子诊断:γ-干扰素释放实验（IGRA)结核感染者体内存在特异的效应T淋巴细胞，效应T淋巴细胞再次受γ-干扰素释放实验（IGRA）γ

干扰素检测阴性γ干扰素检测阳性TB抗原多肽T细胞活化T细胞γ干扰素γ-干扰素释放实验（IGRA）γ干扰素γ干扰素TB抗原多肽T-SPOT®.TB原理T-SPOT®.TB是以拥有专利的特异抗原（ESAT-6/CFP-10），通过酶联免疫斑点技术（ELISPOT）检测受试者体内是否存在结核效应T淋巴细胞，从而判断目前该受试者是否感染结核杆菌（现症感染）的新方法。结核杆菌特异抗原：早期分泌抗原靶6（EarlySecretedAntigenicRarget6，ESAT-6）培养滤液蛋白10（CultureFiltrateProtein10，CFP10）T-SPOT®.TB原理T-SPOT®.TB是以拥有专利的特结核杆菌特异抗原由结核杆菌基因组RD1区相同的操纵子编码的蛋白所有的卡介苗（BCG）均丢失该基因序列绝大多数的环境分枝杆菌也不存在RD1区ESAT-6与CFP-10抗原结核杆菌特异抗原由结核杆菌基因组RD1区相同的操纵子编码的蛋结核杆菌特异抗原苏氏海堪萨斯戈登牛非洲结核杆菌特异抗原苏氏海堪萨斯戈登牛非洲T-SPOT®.TB临床性能指标特异性只针对结核分枝杆菌复合群敏感，与绝大多数环境分枝杆菌和卡介苗（BCG）无交叉反应

美国FDA数据：特异性97.1%(297/306)国内临床数据：特异性94.1%(478/508)灵敏度基本不受免疫力低下/受抑制影响，在肺外结核患者中有很高的检出率美国FDA数据：灵敏度95.6%(175/183)国内临床数据：灵敏度95.3%(624/655)T-SPOT®.TB临床性能指标特异性灵敏度ReferenceSensitivityJafarietal2006AJRCCM174;9:1048-53100.0%(12/12)FerraraetalLancet2006376;1328-34*83.3%(20/24)LeeetalEurRespirJ200628;24-30*96.6%(84/87)GolettietalClinMicrobiolInfect200612;6:544-50*91.3%(21/23)MeieretalEJCMID200524;529-53695.9%(70/73)KangetalChest.2007Sep;132(3):959-65*92.2%(59/64)JanssensetalERJ200730(4):722-898.3%(57/58)ClarkeetalClinExpImmunol2007150(2):238-44.90.0%(27/30)DetjenetalCID20071;45(3):322-8*92.9%(26/28)OzekincietalJIntMedRes2007;35:696-70392.9%(26/28)SoysaletalIJTLD200812(1):50-56*80.8%(80/99)DominguezetalClinVaccImmunol200815(1);168-71*85.7%(36/42)CheeetalJClinMicrobiol.2008Apr9*94.1%(254/270)VincentietalClinExpImmunol.2007Oct;150(1):91-8*84.6%(11/13)WangetalEmergingInfectDis200713;4:553-887.2%(34/39)LosietalEurRespirJ.2007Dec;30(6):1173-9100.0%(10/10)KimetalArchInternMed167;20:2255-2259100.0%(22/22)ConnelletalPLoSONE2008.3;7:e2624*100.0%(9/9)Kobashietal.ScandJInfectDis2008.40;8:629-34*87.5%(42/48)Kobashietal.JInfect.2008[Epubaheadofprint].*90.0%(36/40)Domínguezetal.DiagnMicrobiolInfectDis.2008.*[Epubaheadofprint]84.2%(32/38)Golettietal.PLoSONE.2008.3;10:e3417.*89.9%(62/69)Bosshardetal.RespirMed.2008.[Epubaheadofprint]98.4%(62/63)HiguchiMedMicrobiolImmunol.2008.[Epubaheadofprint]*95.9%(47/49)TOTAL92.0%(1139/1238)灵敏度ReferenceSensitivityJaf特异性特异性T-SPOT®.TB的实验步骤用BDCPT管或Ficoll提取液收集外周血单个核细胞结核特异抗原（ESAT-6/CFP10）刺激结核特异的效应T淋巴细胞使其分泌γ-干扰素效应T淋巴细胞分泌的γ-干扰素与膜板预包被的抗γ-干扰素抗体结合并固定在细胞周围1个斑点=1个效应T细胞加入显色液，观察结果过夜孵育，洗板，加入酶标二抗T-SPOT®.TB的实验步骤用BDCPT管或Ficol阴性结果阳性结果空白对照抗原AESAT-6抗原BCFP10阳性对照（PHA）实验效果图阴性结果阳性结果空白对照实验效果图方法学的优点检测特异性的提高帮助临床区分卡介苗接种和环境分枝杆菌感染引起的“假阳性”，避免了临床的无效用药检测灵敏度的提高有利于临床对结核病的早发现、早治疗，避免了疾病的传播与扩散快速48小时出结果方法学的优点检测特异性的提高方法学的局限不能区分活动性TB与潜伏感染不能够提示临床患者的病变部位，需要结合临床的判断目前还不能够根据斑点数量的多少来判断患者是活动性结核病或是潜伏感染者检测收费高（800元/次）方法学的局限不能区分活动性TB与潜伏感染实验结果的解释阴性结果提示患者体内不存在针对结核杆菌特异的效应T细胞。假阴性结果：①感染阶段不同；②少数免疫系统功能不全/疾病；③实验非正常操作。阳性结果提示患者体内存在针对结核杆菌特异的效应T细胞，患者存在结核感染。但是否是活动性结核病，需结合临床症状和其它检测指标综合判断。假阳性结果：①4种环境分枝杆菌感染时：M.kansasii（堪萨斯）、M.szulgai（苏氏）、M.marinum（海）、M.gordonae（戈登）实验结果的解释阴性结果各国对潜伏感染风险人群的筛查指南风险人群美国指南加拿大指南英国指南免疫力抑制人群（例如，HIV感染者，使用强的松或TNF-α抑制剂治疗）TST或IGRA；如果是阴性或高度怀疑的，TST和IGRA都要检查TST，如果TST阴性要用IGRA确认TST或IGRABCG接种者（如果也属于其它风险人群）推荐用IGRA没有特定的推荐TST或IGRA与传染性肺结核患者密切接触TST或IGRATST，用IGRA进一步确认TST阳性TST，用IGRA进一步确认TST阳性医务工作者TST或IGRA推荐用TSTTST或IGRA，视情况而定无法再来确认TST结果的人群（例如，流浪汉，注射吸毒者或交通不方便）推荐用IGRA没有特定的推荐推荐用IGRA国外出生的人群只筛查过去5年内移民的人群；TST或者IGRA只筛查过去2年内小于15岁的移民；TST，用IGRA进一步确认TST阳性只筛查新移民；TST筛查5至15岁移民，用IGRA进一步确认TST阳性；IGRA筛查16至35岁移民其它风险人群TST或IGRATST，用IGRA进一步确认TST阳性TST，用IGRA进一步确认TST阳性各国对潜伏感染风险人群的筛查指南风险人群美国指南加拿大指南英样本量为26680调查者的15个多中心研究显示,在4年的随访中,IGRA-阳性的个体中发病数为4~48例/1000人/每年.2011年9月的研究结果提示，IGRA-阴性对于儿童（小于5岁）不能排除结核病(Pediatr.Infect.Dis.J.30,817–818,2011).ChildhoodtuberculosistreatmentremainsimprecisescienceNatureMedicineVolume:17,Page:116011October2011.样本量为26680调查者的15个多中心研究显示,在4年的TB-DNA检测：1.能稳定检测10copy的TB-DNA，灵敏度高，特异性强。2.早期、快速、准确地诊断结核病。痰液、肺及支气管灌洗液——肺结核血液——播散性结核和各脏器的结核病脑脊液——中枢神经系统结核病宫颈拭子、尿道拭子——泌尿生殖道结核病3.荧光定量PCR检出结核杆菌阳性率显著高于痰涂片抗酸染色和改良罗氏培养法。4.TB-DNA浓度可用于判断疗效：痰标本中结核杆菌的数量呈逐渐下降趋势，TB-DNA拷贝数下降。根据病原体DNA浓度，对药物治疗及疗效观察提供参考依据。③分子生物学诊断TB-DNA检测：③分子生物学诊断Real-timePCRReal-timePCR

环介导等温扩增法(LAMP)的技术特点是针对靶基因的6个区域设计4条特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶在等温条件(63-65℃)下保温30－60分钟，

即可完成核酸扩增反应。与常规PCR

相比，不需要模

板的热变性、温

度循环、电泳及

紫外观察等过程，

具有简单、快速、

特异性强的特点。环介导恒温扩增（LAMP）技术环介导等温扩增法(LAMP)的技术特点是针对靶基因的2小时全过程目测法检测流程2小时全过程目测法检测流程检测方法说明结果判断

在阴性对照反应管液体颜色呈橙色，阳性对照反应管液体颜色呈绿色的条件下：若待检样本反应管中液体颜色呈绿色，则可报告该样本检测结果为结核分枝杆菌阳性；若待检样本反应管中液体颜色呈橙色，则可报告该样本检测结果为结核分枝杆菌阴性；若阴阳性对照反应管结果与上述情况不符，则本次检测结果无效，应重新检测。检测方法说明结果判断在阴性对照反应管液体颜色呈橙RNA作为临床分子诊断靶标的优点：RNA拷贝数≥DNA拷贝数更具临床意义:生命力旺盛的病原体RNA转录活跃RNA远不如DNA稳定病原体死亡，RNA很快降解

1.交叉污染少

2.较好的愈后指标结核杆菌RNA(TB-RNA)RNA作为临床分子诊断靶标的优点：RNA拷贝数≥DNA拷SAT技术原理SAT技术原理操作过程操作过程4.结核病的分子药敏HAIN技术DNA•STRIP®T-spot

-XpertMTB/RIFDNA微阵芯片探针熔解曲线技术4.结核病的分子药敏HAIN技术DNA•STRIP®T-药物药物作用机制参与基因编码酶作用突变频率（%）INH氧自由基对DNA，脂质等多效应KatG触酶-过氧化物酶活化原药42~58INH对NADH竞争性INH-NADH加成物抑制分支菌酸合成代偿katG功能inhAkasAahpCndhnatglf烯酰基载体蛋白还原酶酮酰基蛋白合成酶烷基氢过氧化物酶NADH脱氢酶芳香胺乙酰转移酶吡喃半乳糖变位酶分支菌酸代谢靶酶靶酶？靶酶？NAD+减少乙酰化失活INH靶酶？21~3410~15耐药标记物RFP抑制信使RNA转录rpoBRNA多聚酶靶酶96~100PZA酸化胞浆，失活酶活性抑制脂肪酸代谢？替代烟酰胺掺入NAD抑制膜转运功能pncAFasI吡嗪酰胺酶FasI？活化原药靶酶？72~97EMB阿拉伯半乳聚糖合成抑制阿拉伯呋喃糖累积脂阿拉伯甘露聚糖合成抑制embCABembB阿糖转移酶靶酶47~65SM肽链翻译错误rpsLrrs核糖体30S亚基S12蛋白核糖体16SrRNA靶位靶位52~598~21AK/KMOFx肽链翻译错误抑制DNA回旋酶rrsgyrA核糖体16SrRNADNA回旋酶A亚基靶位靶酶75~94Cs抑制肽聚糖合成ulrA/dadBD-丙氨酸合成酶靶酶药物药物作用机制参与基因编码酶作用突变频率（原理：采用线性探针技术（LiPA），扩增后的产物与预先固化在膜上的特异性探针杂交，通过显色反应判断结果。检测标本：涂阳痰标本/TB-DNA阳性标本固体或液体培养菌株①Hain技术原理：①Hain技术GT-Blot48自动杂交仪1台所需设备：GTQPCR－96扩增仪1台Mikro220离心机1台恒温器1台超声波振荡仪1台GT-Blot48自动杂交仪1台所需设备：GTQPCRTARGET靶基因菌种鉴定16SrRNAIS6110异烟肼katG、inhA、ahpC、oxyR、KasA、ndh利福平rpoB乙胺丁醇embB吡嗪酰胺pncA链霉素rpsL、rrs喹诺酮类药物gyrA、gyrBTARGET靶基因菌种鉴定16SrRNAIS6110异烟肼MTBDRplus方法原理：PCR扩增检测rpoB、katG和inhA基因突变位点，诊断RFP和INH耐药。MTBDRplus方法原理：PCR扩增检测rpoB、katrpoB

野生型探针:WT1-WT8rpoB

耐药突变探针:MUT1-3:D516V,H526Y,H526D,S531L→通过缺失的野生型信号进行突变探测→通过出现的突变信号进行突变探测MTBDRplus

rpoB511513516518522526531533rpoBWT2rpoBWT4rpoBWT6rpoBWT8rpoBWT7rpoBMUT1(D516V)rpoBMUT3(S531L)rpoBMUT2A(H526Y)rpoBMUT2B(H526D)514515rpoBWT1rpoBWT3rpoBWT5509508505rpoB野生型探针:WT1-WT8MTBDRplusMTBDRplus操作流程DNA提取用NALC/NaOH处理痰标本2)PCR扩增3)

杂交扩增产物和固化在膜上的特异性探针杂交4)

结果判读MTBDRplus操作流程DNA提取2)PCR扩增3)MTBDRplus反应条带(示范)MTBDRplus反应条带(示范)BandeletteMTBDR®(HainLifescience)

鉴定结核菌利福平rpoBINHkatG315BandeletteMTBDR®(HainLifesc药物GenoTypeMTBDRplus结果比例法药敏结果

耐药

敏感INH

耐药450

敏感716灵敏度：86.5%(45/52)特异度：100%(16/16)符合率：89.7%(61/68)菌株标本GenoTypeMTBDRplus方法与比例法药敏试验结果比较药物GenoTypeMTBDRplus结果比例法药敏结果药物GenoTypeMTBDRplus结果比例法药敏结果

耐药

敏感RFP耐药480

敏感116灵敏度：98.0%(48/49)特异度：100%(16/16)符合率：98.5%(64/65)菌株标本GenoTypeMTBDRplus方法与比例法药敏试验结果比较药物GenoTypeMTBDRplus结果比例法药敏结果痰标本（涂片阳性）GenoTypeMTBDRplus方法与比例法药敏试验结果比较药物GenoTypeMTBDRplus结果比例法药敏结果

耐药

敏感INH

耐药630

敏感1129灵敏度：98.4%(63/64)特异度：100%(129/129)符合率：99.5%(192/193)痰标本（涂片阳性）GenoTypeMTBDRplus方法与痰标本（涂片阳性）GenoTypeMTBDRplus方法与比例法药敏试验结果比较药物GenoTypeMTBDRplus结果比例法药敏结果

耐药

敏感RFP

耐药3912

敏感2140灵敏度：95.1%(39/41)特异度：92.1%(140/152)符合率：92.7%(179/193)痰标本（涂片阳性）GenoTypeMTBDRplus方法与优点：Hain技术可以快速检测RFP和INH的耐药时间短、操作简单、安全高特异性和灵敏度较高、重复性好主观因素影响小、更为可靠优点：缺点:需要专门设备；未发现所有的耐药突变位点，不能检测所有药物的耐药基因型；MTBDRplus试剂盒的检测试纸条，缺少ahpC-oxyR间隔序列范围，否则可进一步提高INH耐药检测的敏感性；不能取代传统细菌学检测、只能作为参考。缺点:进行标本处理、实时PCR和利福平耐药性检测的完整平台此平台由FIND和Cepheid（一个加州公司）所开发痰标本可以直接放入模块中，而无需与任何试剂进行混合处理GeneXpert设备可进行标本液化、去污染、富集、DNA提取、rpoB实时扩增、应用分子灯塔检测耐药相关的突变该系统非常容易使用，不需要进行分子生物学培训该检测方法另外一个特点是操作完全自动化，使用起来既容易又安全。②.XpertMTB/RIF进行标本处理、实时PCR和利福平耐药性检测的完整平台②.X设计五个重叠的分子信标，检测81碱基rpoB核心区域所有可能的突变用不同的荧光基团标记每个分子信标，使仅在一个反应中完成整个检测成为可能探针能检测野生型菌株（RIF-敏感人群）；ropB突变造成特定信标的信号丢失（RIF-耐受人群）每个探针必须：能检测野生型菌株；不能检测Rif耐药突变菌株，不能检测出非TB分枝杆菌.XpertMTB/RIF的引物设计设计五个重叠的分子信标，检测81碱基rpoB核心区域所有可XpertMTB/RIFXpertMTB/RIFWHO推荐WHO推荐XpertMTB/RIF

与Hain的比较

：只能做TB-DNA和利福平耐药基因；只能通过8个缺失的野生型信号进行突变检测，不能探检测出现的突变信号；样本通量少(4个/次）；所需样本量大（1mL/次）；仪器断电后只能重新开始；Hain有记忆功能。维护：刚进入中国市场，故障后只能返厂修理，费用昂贵。XpertMTB/RIF与Hain的比较：只能做TB③.DNA微阵芯片基本原理：与Southern、Northern是一致的，都是应用已知核酸序列作为探针固定在玻璃等基片上，然后与待测样品的DNA或RNA互补的靶核苷酸序列杂交，从而获得待测样品的信息③.DNA微阵芯片基本原理：与Southern、North基因芯片的检测过程基因芯片的检测过程结核耐药快速检测基因芯片73结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒（DNA微阵列芯片法）

基于rpoB/katG/inhA的基因突变，快速检测分离株或者痰样本中结核分枝杆菌多药耐药（利福平、异烟肼）通量：两种一线抗结核药物、8个突变位点速度：6小时versus

传统4~8周灵敏度：103CFU/反应特异性：防污染体系；对照设计严谨；自动判读利福平耐药利福平敏感结核耐药检测基因芯片软件判读激光共焦扫描仪样品制备仪杂交仪发表文章：TheInternationalJournalofTuberculosisandLungDisease.2009,13(7):914–920.发明专利：申请号：200810105172.X。授权公告号：CN101285062B。结核耐药快速检测基因芯片73结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒（1.晶芯®分枝杆菌核酸检测试剂盒2.晶芯®十七种分枝杆菌菌种鉴定试剂盒3.晶芯®分枝杆菌耐药检测试剂盒4.晶芯®九项遗传性耳聋基因检测试剂盒DNA微阵芯片1.晶芯®分枝杆菌核酸检测试剂盒DNA微阵芯片④.探针熔解曲线技术④.探针熔解曲线技术检测结果判断检测结果判断结核病的实验室诊断分析课件Sputum

涂片培养—孵育8周（阳性）药敏试验—观察

孵育4周观察生长情况

涂片/TB-DNA/TB-RNA

（阳性）分子诊断/药敏技术液体培养及药敏试验

平均时间2-3个月平均时间20天只需1-2天小结Sputum涂片培养—孵育8周药敏试验—观察孵涂片/T感谢

聆听！感谢聆听！结核病的实验室诊断结核病的实验室诊断主要内容结核病的流行情况1结核病的病原学32结核病的实验室诊断3结核病的分子药敏34主要内容结核病的流行情况1结核病的病原学32结核病的实验室诊1.结核病的流行概况全球范围内结核病疫情急剧恶化人口大规模流动结核菌耐药现象益发严重结核病合并艾滋病感染我国是世界上仅低于印度的第二结核病大国结核菌感染率44.5%新发活动性结核患者130万/年死亡13万/年1.结核病的流行概况全球范围内结核病疫情急剧恶化2011WHOtuberculosiscontrolreport我国是全球27个耐药结核病高负担国家之一2013年世界卫生组织宣布全球耐多药结核病紧急状态2011WHOtuberculosiscontrol全球的结核病患者,在接受治疗之前已经传染给了别人！！！早期快速诊断与治疗成为制约结核病控制的关键：有细菌学诊断依据的病人不超过50%全球的结核病患者,在接受治疗之前已经传染给了别人！！！早期快当前结核研究的热点新型抗结核药物(50%)新型快速诊断技术(40%)新型结核疫苗(10%)当前结核研究的热点新型抗结核药物(50%)86/45近期结核病诊断方法的相关研究JID2012:205(Suppl2),S147.近期结核病诊断方法的相关研究JID2012:205(Su2.结核病的病原学

结核分枝杆菌(M.tuberculosis)是引起人类结核病的主要病原体。1882年由德国医生Koch发现。结核分枝杆菌属于厚壁门、裂殖菌纲、放线菌目、分枝杆菌科、分枝杆菌属。分枝杆菌复合群共包括人型、牛型、非洲型和田鼠型，而人型结核分枝杆菌是人类主要的致病菌。2022/11/18GDTB872.结核病的病原学结核分枝杆菌(M.tuberculosi结核分枝杆菌(M.tuberculosis)生物学主要特点：1.细胞壁中含有大量脂质2.引起的疾病都呈慢性，并伴肉芽肿3.抗酸染色阳性结核分枝杆菌(M.tuberculosis)生物学主要特点：生长特点：生长缓慢，繁殖一代在人工培养基内约需要15～20小时，在静脉感染未经免疫小鼠肺中约需要15小时，在巨噬细胞内约需要15～20小时，在家兔角膜中约需要20～22小时。生长特点：实验室检查方法的历史1880s Tuberclebacilli的发现

Ziehl-Neelsen染色方法1900s Mantouxtest(TSTwithtuberculin)1920s Petragnani

medium

PurifiedProteinDerivative（PPD）1930s Lewenstein-Jensen培养基1940s Dubosagar,Ogawa培养基1950s Middlebrook7H91990s NAAT2000s ELISPOT,QuantiFERON,2010s LPA,GeneXpert2020s

???实验室检查方法的历史1880s Tuberclebacil3.结核病的实验室诊断细菌学涂片：敏感性低传统固体培养：所需时间长，2~3月分子生物学TB-DNATB-mRNA血清/免疫学IGRA：有望替代TST，但不能区分活动性TB与潜伏感染血清学：存在抗原纯度和特异性差等方面的问题液体培养及药敏试验：平均时间20天3.结核病的实验室诊断细菌学涂片：传统固体培养：所需①.细菌学诊断①.细菌学诊断萋尼氏染色荧光染色罗氏培养/药敏试验我国目前最常用的结核病实验室诊断技术快培/药敏试验萋尼氏染色荧光染色罗氏培养/我国目前最常用的结核病实验室诊断涂片►干燥►固定初染脱色复染显微镜检查登记/报告显微镜检查碱性复红盐酸酒精亚甲兰石炭酸金胺O盐酸酒精高锰酸钾光学显微镜检查荧光显微镜检查涂片►干燥►固定初染脱色复染显微镜检查登记/报告显萋尼氏染色镜下形态萋尼氏染色镜下形态荧光染色镜下形态荧光染色镜下形态LEDFluorescencemicroscopy

LED荧光显微镜LEDFluorescencemicroscopy

LELED荧光显微镜成本低廉的超亮发光二极管可承受的价格，价格接近于现有的光学显微镜寿命长（~15-20,000小时）省电可用电池供能可靠性更强不需要空调设施不需要暗室诊断性能优于标准荧光显微镜操作人员工作负荷减轻LED荧光显微镜成本低廉的超亮发光二极管普通荧光显微镜和发光二极管荧光显微镜性能比较（不同实验室的结果进行汇总与平均）显微镜方法灵敏度(%)特异度(%)普通荧光显微镜直接涂片67.496.1普通荧光显微镜浓集涂片66.699.2发光二极管荧光显微镜直接涂片71.6(p=0.1025)96.4发光二极管荧光显微镜浓集涂片72.4(p=0.0073)98.8普通荧光显微镜和发光二极管荧光显微镜性能比较（不同实验室的结

Bactec®MGIT960/320Bact/Alert3DVERSATREK生产厂家美国BD公司法国生物梅里埃公司美国Trek诊断公司仪器定位专业分枝杆菌检测系统业内金标准普通细菌血培养系统需加装分枝杆菌培养特殊组件普通细菌血培养系统需加装分枝杆菌培养特殊组件单机容量960个检测位每年可至少检测8000个样本240个瓶位每年可检测2000个样本528个瓶位日均标本处理量25~30个6~7个9个检测原理荧光增强法：采用敏感性较强的荧光信号探测氧气的变化情况，只需单一反应，所以速度快，准确性高PH值比色法：当培养瓶内有微生物生长，其释放出的CO2，经水饱和后，产生H+，使PH值产生变化，感应器的颜色也随之变化。需双重反应，因此速度较慢，假阳性率较高，此技术已趋向淘汰压力检测：检测细菌生长中各种气体产生和消耗而引起的瓶内压力的变化。灵敏度差。此技术已趋向淘汰检测技术瓶外检测技术瓶外检测技术瓶内检测技术易导致污染及生物安全问题平均阳性报告时间8－11天15－21天不详药敏试剂5种一线抗TB药物，全部具有FDA及SFDA认证无药敏试剂提供只有3种一线药物培养/药敏试验Bactec®MGIT960/320Bact/Alert阴性培养阳性培养无或微弱荧光FFFO2FO2FO2FO2FO2FFO2FO2CO2O2O2O2O2O2O2O2O2CO2CO2O2FFFFFO2FO2FFFFCO2O2O2O2O2O2强荧光传感器对氧气高度敏感的钌复合物肉汤改良Middlebrook7H9肉汤上部空间已预先充填10%CO2BACTEC™MGIT™960/320

指示器系统阴性培养阳性培养无或微弱荧光FFFO2FO2FO2FO2FOMGIT/3D制造的液体培养基优点比固体培养快(平均10-12天vs.20-24天)比固体培养基更敏感可以自动判读，或使用标准指示管和操作手册进行判读也加快了药敏试验的速度局限需要NALC-NaOH进行痰处理和离心普通菌群的污染很常见比固体培养更经常地检出非结核分枝杆菌（常常不致病）确定诊断前必须对所有的阳性培养物进行结核分枝杆菌的鉴定比固体培养基昂贵MGIT/3D制造的液体培养基优点②血清学诊断血清学诊断技术优势：是一种对疾病进行早期诊断的理想方法。无需活细胞培养和特殊仪器设备操作简便结果显示快速目前用于血清学诊断的主要方法:酶联免疫吸附试验(ELlSA)斑点金免疫渗滤法(DIGFA)免疫印迹法(WesternBlotting)等等②血清学诊断血清学诊断技术优势：是一种对疾病进行早期诊断的理WHO对来自不同国家的19种试剂盒产品进行评估，结果表明：与痰培养相比，这些试剂盒检测的灵敏度为1%~60%，特异度为53~99%1

。原因：由于所用的测定方法、使用的试剂种类或抗原、抗体的不同等，导致测定结果差异较大，并且缺乏可比性。WHO认为现有的血清学诊断试剂的敏感度和特异度都有待进一步提高，不推荐其作为一种快速诊断的方法在临床使用。1WHOWorldHealthOrganization.DiagnosisevaluationseriesNo.2:laboratory-basedevalutionof19commerciallyavailablerapiddiagnostictestsfortuberculosis.2008.WHO对结核抗体评估WHO对来自不同国家的19种试剂盒产品进行评估，结果表明：与2011年WHO正式公告：由于目前的商业血清学试剂在结核检测中存在较大差异，且检测结果很高比例的假阳性和假阴性，因此不建议使用血清学方法作为结核杆菌的诊断实验1。1WHOCommercialSerodiagnosticTestsforDiagnosisofTuberculosis./publications/2011/9789241502054_eng.pdf不能早期诊断！容易漏诊、误诊！血清学检测的评价2011年WHO正式公告：由于目前的商业血清学试剂在结核检测结核感染者体内存在特异的效应T淋巴细胞，效应T淋巴细胞再次受到结核抗原刺激时会分泌多种细胞因子（IFN-γ）。因此，检测效应T淋巴细胞可用于结核病或结核潜伏感染者的诊断。由于效应T细胞存活时间很短，而且具有特异性，因此可以作为机体是否正处于被感染的指标，无论是否有临床症状。基于IGRA原理的产品目前已被美国、加拿大、英国、德国、意大利、瑞士、法国、荷兰、日本等二十余个国家写入本国的结核诊疗指南中。目前应用的进口IGRA主要有两种商品化的试剂：1）澳大利亚Cellestis公司的QuantiFERON-TBGOLDInTube（QFT-GIT）2）英国OxfordImmunotec公司的T-SPOT.TB蛋白水平分子诊断:γ-干扰素释放实验（IGRA)结核感染者体内存在特异的效应T淋巴细胞，效应T淋巴细胞再次受γ-干扰素释放实验（IGRA）γ

干扰素检测阴性γ干扰素检测阳性TB抗原多肽T细胞活化T细胞γ干扰素γ-干扰素释放实验（IGRA）γ干扰素γ干扰素TB抗原多肽T-SPOT®.TB原理T-SPOT®.TB是以拥有专利的特异抗原（ESAT-6/CFP-10），通过酶联免疫斑点技术（ELISPOT）检测受试者体内是否存在结核效应T淋巴细胞，从而判断目前该受试者是否感染结核杆菌（现症感染）的新方法。结核杆菌特异抗原：早期分泌抗原靶6（EarlySecretedAntigenicRarget6，ESAT-6）培养滤液蛋白10（CultureFiltrateProtein10，CFP10）T-SPOT®.TB原理T-SPOT®.TB是以拥有专利的特结核杆菌特异抗原由结核杆菌基因组RD1区相同的操纵子编码的蛋白所有的卡介苗（BCG）均丢失该基因序列绝大多数的环境分枝杆菌也不存在RD1区ESAT-6与CFP-10抗原结核杆菌特异抗原由结核杆菌基因组RD1区相同的操纵子编码的蛋结核杆菌特异抗原苏氏海堪萨斯戈登牛非洲结核杆菌特异抗原苏氏海堪萨斯戈登牛非洲T-SPOT®.TB临床性能指标特异性只针对结核分枝杆菌复合群敏感，与绝大多数环境分枝杆菌和卡介苗（BCG）无交叉反应

美国FDA数据：特异性97.1%(297/306)国内临床数据：特异性94.1%(478/508)灵敏度基本不受免疫力低下/受抑制影响，在肺外结核患者中有很高的检出率美国FDA数据：灵敏度95.6%(175/183)国内临床数据：灵敏度95.3%(624/655)T-SPOT®.TB临床性能指标特异性灵敏度ReferenceSensitivityJafarietal2006AJRCCM174;9:1048-53100.0%(12/12)FerraraetalLancet2006376;1328-34*83.3%(20/24)LeeetalEurRespirJ200628;24-30*96.6%(84/87)GolettietalClinMicrobiolInfect200612;6:544-50*91.3%(21/23)MeieretalEJCMID200524;529-53695.9%(70/73)KangetalChest.2007Sep;132(3):959-65*92.2%(59/64)JanssensetalERJ200730(4):722-898.3%(57/58)ClarkeetalClinExpImmunol2007150(2):238-44.90.0%(27/30)DetjenetalCID20071;45(3):322-8*92.9%(26/28)OzekincietalJIntMedRes2007;35:696-70392.9%(26/28)SoysaletalIJTLD200812(1):50-56*80.8%(80/99)DominguezetalClinVaccImmunol200815(1);168-71*85.7%(36/42)CheeetalJClinMicrobiol.2008Apr9*94.1%(254/270)VincentietalClinExpImmunol.2007Oct;150(1):91-8*84.6%(11/13)WangetalEmergingInfectDis200713;4:553-887.2%(34/39)LosietalEurRespirJ.2007Dec;30(6):1173-9100.0%(10/10)KimetalArchInternMed167;20:2255-2259100.0%(22/22)ConnelletalPLoSONE2008.3;7:e2624*100.0%(9/9)Kobashietal.ScandJInfectDis2008.40;8:629-34*87.5%(42/48)Kobashietal.JInfect.2008[Epubaheadofprint].*90.0%(36/40)Domínguezetal.DiagnMicrobiolInfectDis.2008.*[Epubaheadofprint]84.2%(32/38)Golettietal.PLoSONE.2008.3;10:e3417.*89.9%(62/69)Bosshardetal.RespirMed.2008.[Epubaheadofprint]98.4%(62/63)HiguchiMedMicrobiolImmunol.2008.[Epubaheadofprint]*95.9%(47/49)TOTAL92.0%(1139/1238)灵敏度ReferenceSensitivityJaf特异性特异性T-SPOT®.TB的实验步骤用BDCPT管或Ficoll提取液收集外周血单个核细胞结核特异抗原（ESAT-6/CFP10）刺激结核特异的效应T淋巴细胞使其分泌γ-干扰素效应T淋巴细胞分泌的γ-干扰素与膜板预包被的抗γ-干扰素抗体结合并固定在细胞周围1个斑点=1个效应T细胞加入显色液，观察结果过夜孵育，洗板，加入酶标二抗T-SPOT®.TB的实验步骤用BDCPT管或Ficol阴性结果阳性结果空白对照抗原AESAT-6抗原BCFP10阳性对照（PHA）实验效果图阴性结果阳性结果空白对照实验效果图方法学的优点检测特异性的提高帮助临床区分卡介苗接种和环境分枝杆菌感染引起的“假阳性”，避免了临床的无效用药检测灵敏度的提高有利于临床对结核病的早发现、早治疗，避免了疾病的传播与扩散快速48小时出结果方法学的优点检测特异性的提高方法学的局限不能区分活动性TB与潜伏感染不能够提示临床患者的病变部位，需要结合临床的判断目前还不能够根据斑点数量的多少来判断患者是活动性结核病或是潜伏感染者检测收费高（800元/次）方法学的局限不能区分活动性TB与潜伏感染实验结果的解释阴性结果提示患者体内不存在针对结核杆菌特异的效应T细胞。假阴性结果：①感染阶段不同；②少数免疫系统功能不全/疾病；③实验非正常操作。阳性结果提示患者体内存在针对结核杆菌特异的效应T细胞，患者存在结核感染。但是否是活动性结核病，需结合临床症状和其它检测指标综合判断。假阳性结果：①4种环境分枝杆菌感染时：M.kansasii（堪萨斯）、M.szulgai（苏氏）、M.marinum（海）、M.gordonae（戈登）实验结果的解释阴性结果各国对潜伏感染风险人群的筛查指南风险人群美国指南加拿大指南英国指南免疫力抑制人群（例如，HIV感染者，使用强的松或TNF-α抑制剂治疗）TST或IGRA；如果是阴性或高度怀疑的，TST和IGRA都要检查TST，如果TST阴性要用IGRA确认TST或IGRABCG接种者（如果也属于其它风险人群）推荐用IGRA没有特定的推荐TST或IGRA与传染性肺结核患者密切接触TST或IGRATST，用IGRA进一步确认TST阳性TST，用IGRA进一步确认TST阳性医务工作者TST或IGRA推荐用TSTTST或IGRA，视情况而定无法再来确认TST结果的人群（例如，流浪汉，注射吸毒者或交通不方便）推荐用IGRA没有特定的推荐推荐用IGRA国外出生的人群只筛查过去5年内移民的人群；TST或者IGRA只筛查过去2年内小于15岁的移民；TST，用IGRA进一步确认TST阳性只筛查新移民；TST筛查5至15岁移民，用IGRA进一步确认TST阳性；IGRA筛查16至35岁移民其它风险人群TST或IGRATST，用IGRA进一步确认TST阳性TST，用IGRA进一步确认TST阳性各国对潜伏感染风险人群的筛查指南风险人群美国指南加拿大指南英样本量为26680调查者的15个多中心研究显示,在4年的随访中,IGRA-阳性的个体中发病数为4~48例/1000人/每年.2011年9月的研究结果提示，IGRA-阴性对于儿童（小于5岁）不能排除结核病(Pediatr.Infect.Dis.J.30,817–818,2011).ChildhoodtuberculosistreatmentremainsimprecisescienceNatureMedicineVolume:17,Page:116011October2011.样本量为26680调查者的15个多中心研究显示,在4年的TB-DNA检测：1.能稳定检测10copy的TB-DNA，灵敏度高，特异性强。2.早期、快速、准确地诊断结核病。痰液、肺及支气管灌洗液——肺结核血液——播散性结核和各脏器的结核病脑脊液——中枢神经系统结核病宫颈拭子、尿道拭子——泌尿生殖道结核病3.荧光定量PCR检出结核杆菌阳性率显著高于痰涂片抗酸染色和改良罗氏培养法。4.TB-DNA浓度可用于判断疗效：痰标本中结核杆菌的数量呈逐渐下降趋势，TB-DNA拷贝数下降。根据病原体DNA浓度，对药物治疗及疗效观察提供参考依据。③分子生物学诊断TB-DNA检测：③分子生物学诊断Real-timePCRReal-timePCR

环介导等温扩增法(LAMP)的技术特点是针对靶基因的6个区域设计4条特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶在等温条件(63-65℃)下保温30－60分钟，

即可完成核酸扩增反应。与常规PCR

相比，不需要模

板的热变性、温

度循环、电泳及

紫外观察等过程，

具有简单、快速、

特异性强的特点。环介导恒温扩增（LAMP）技术环介导等温扩增法(LAMP)的技术特点是针对靶基因的2小时全过程目测法检测流程2小时全过程目测法检测流程检测方法说明结果判断

在阴性对照反应管液体颜色呈橙色，阳性对照反应管液体颜色呈绿色的条件下：若待检样本反应管中液体颜色呈绿色，则可报告该样本检测结果为结核分枝杆菌阳性；若待检样本反应管中液体颜色呈橙色，则可报告该样本检测结果为结核分枝杆菌阴性；若阴阳性对照反应管结果与上述情况不符，则本次检测结果无效，应重新检测。检测方法说明结果判断在阴性对照反应管液体颜色呈橙RNA作为临床分子诊断靶标的优点：RNA拷贝数≥DNA拷贝数更具临床意义:生命力旺盛的病原体RNA转录活跃RNA远不如DNA稳定病原体死亡，RNA很快降解

1.交叉污染少

2.较好的愈后指标结核杆菌RNA(TB-RNA)RNA作为临床分子诊断靶标的优点：RNA拷贝数≥DNA拷SAT技术原理SAT技术原理操作过程操作过程4.结核病的分子药敏HAIN技术DNA•STRIP®T-spot

-XpertMTB/RIFDNA微阵芯片探针熔解曲线技术4.结核病的分子药敏HAIN技术DNA•STRIP®T-药物药物作用机制参与基因编码酶作用突变频率（%）INH氧自由基对DNA，脂质等多效应KatG触酶-过氧化物酶活化原药42~58INH对NADH竞争性INH-NADH加成物抑制分支菌酸合成代偿katG功能inhAkasAahpCndhnatglf烯酰基载体蛋白还原酶酮酰基蛋白合成酶烷基氢过氧化物酶NADH脱氢酶芳香胺乙酰转移酶吡喃半乳糖变位酶分支菌酸代谢靶酶靶酶？靶酶？NAD+减少乙酰化失活INH靶酶？21~3410~15耐药标记物RFP抑制信使RNA转录rpoBRNA多聚酶靶酶96~100PZA酸化胞浆，失活酶活性抑制脂肪酸代谢？替代烟酰胺掺入NAD抑制膜转运功能pncAFasI吡嗪酰胺酶FasI？活化原药靶酶？72~97EMB阿拉伯半乳聚糖合成抑制阿拉伯呋喃糖累积脂阿拉伯甘露聚糖合成抑制embCABembB阿糖转移酶靶酶47~65SM肽链翻译错误rpsLrrs核糖体30S亚基S12蛋白核糖体16SrRNA靶位靶位52~598~21AK/KMOFx肽链翻译错误抑制DNA回旋酶rrsgyrA核糖体16SrRNADNA回旋酶A亚基靶位靶酶75~94Cs抑制肽聚糖合成ulrA/dadBD-丙氨酸合成酶靶酶药物药物作用机制参与基因编码酶作用突变频率（原理：采用线性探针技术（LiPA），扩增后的产物与预先固化在膜上的特异性探针杂交，通过显色反应判断结果。检测标本：涂阳痰标本/TB-DNA阳性标本固体或液体培养菌株①Hain技术原理：①Hain技术GT-Blot48自动杂交仪1台所需设备：GTQPCR－96扩增仪1台Mikro220离心机1台恒温器1台超声波振荡仪1台GT-Blot48自动杂交仪1台所需设备：GTQPCRTARGET靶基因菌种鉴定16SrRNAIS6110异烟肼katG、inhA、ahpC、oxyR、KasA、ndh利福平rpoB乙胺丁醇embB吡嗪酰胺pncA链霉素rpsL、rrs喹诺酮类药物gyrA、gyrBTARGET靶基因菌种鉴定16SrRNAIS6110异烟肼MTBDRplus方法原理：PCR扩增检测rpoB、katG和inhA基因突变位点，诊断RFP和INH耐药。MTBDRplus方法原理：PCR扩增检测rpoB、katrpoB

野生型探针:WT1-WT8rpoB

耐药突变探针:MUT1-3:D516V,H526Y,H526D,S531L→通过缺失的野生型信号进行突变探测→通过出现的突变信号进行突变探测MTBDRplus

rpoB511513516518522526531533rpoBWT2rpoBWT4rpoBWT6rpoBWT8rpoBWT7rpoBMUT1(D516V)rpoBMUT3(S531L)rpoBMUT2A(H526Y)rpoBMUT2B(H526D)514515rpoBWT1rpoBWT3rpoBWT5509508505rpoB野生型探针:WT1-WT8MTBDRplusMTBDRplus操作流程DNA提取用NALC/NaOH处理痰标本2)PCR扩增3)

杂交扩增产物和固化在膜上的特异性探针杂交4)

结果判读MTBDRplus操作流程DNA提取2)PCR扩增3)MTBDRplus反应条带(示范)MTBDRplus反应条带(示范)BandeletteMTBDR®(HainLifescience)

鉴定结核菌利福平rpoBINHkatG