分子生物学实验讲义

分子生物学实验讲义ExperimentalDirectionofMolecularBiology昆明医学院基础学院生物化学教研室DepartmentofBiochemistryFacultyofBasicMedicalSciences,Kunming2007年3月实验一质粒DNA的提取与限制酶切鉴定IsolationofPlasmidDNAandIdentificationbyRestrictionDigestion一、

目的(Objectives)掌握质粒DNA小量快速提取法；了解DNA限制性核酸内切酶酶切鉴定原理。二、

原理(Principles))质粒（plasmid）是一种染色体外的稳定遗传因子。其分子量大小在1－200kb之间。是具有双链闭合环状结构的DNA分子，质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，具有自主复制和转录能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。质粒一般独立游离在细胞质内，也可整合到细菌染色体中，它离开宿主的细胞就不能存活，而它控制的许多生物学功能却赋予宿主细胞某些表型。所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。采用溶菌酶可破坏菌体细胞壁，十二烷基硫酸钠（Sodiumdodecylsulfate,SDS）可使细胞壁裂解。细菌经溶菌酶和阴离子去污剂（SDS）处理后，细菌DNA缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀出来，而质粒DNA则留在上清液中。再经酒精沉淀、洗涤处理，可得到质粒DNA。共价闭环DNA（covalentlyclosedcircularDNA，简称cccDNA）质粒以超螺旋形式存在。若两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，这种松弛型的DNA分子叫作开环DNA（opencircularDNA,简称ocDNA）。在电泳时，同一质粒如以cccDNA形式存在，它比其开环和线状DNA的泳动速度都快，因此在本实验中，质粒DNA在电泳凝胶中呈现3条区带。限制性内切酶是分子生物学研究中的一种工具酶，这类酶的特点是具有能够识别双链DNA分子上的特异核苷酸顺序的能力，能在这个特异性核苷酸序列内，切断DNA的双链，形成一定长度的DNA片段。如：EcoRⅠ和HindⅢ的识别序列和切口是：

EcoRⅠ：G↓AATTC

HindⅢ：A↓AGCTT限制性内切酶对环状质粒DNA有多少切口，就能产生多少酶切片段，因此鉴定酶切后的片段在电泳凝胶的区带数，就可以推断酶切口的数目，从片段的迁移率可以大致判断酶切片段大小的差别。用已知分子量的线状DNA为对照，通过电泳迁移率的比较，就可以粗略推测分子形状相同的未知DNA的分子量。三、

主要设备、实验材料和试剂（Equipments,MaterialsandAgents）1．主要设备(Equipments)（1）塑料离心管1.5mL×30（2）塑料离心管架×1（3）微量加样器10μL、100μL、1000μL各一支（4）常用玻璃仪器及滴管等（5）台式高速离心机（16000r/min）（6）电泳仪（7）电泳槽（8）样品槽模板2．材料(Materials)：质粒转化大肠杆菌3．试剂(Agents)（1）溶液Ⅰ：pH8.0G.E.T缓冲液（50mmol/L葡萄糖，10mmol/LEDTA，25mmol/LTris-HCl）；用前加溶菌酶4mg/mL。（2）溶液Ⅱ:1mol/LNaOH40μl,5%SDS40μl,蒸馏水120μl，临用时配制。（3）溶液Ⅲ：pH4.8乙酸钾溶液（60mL5mol/LKAc，11.5mL冰乙酸，28.5mLH2O）（4）苯酚/氯仿（1∶1，V/V）：苯酚需在160℃重蒸，加入抗氧化剂8-羟基喹啉，使其浓度为0.1%，并用Tris-HCl缓冲液平衡两次。氯仿中加入异戊醇，氯仿/异戊醇（24∶1，V/V）。

（5）pH8.0TE缓冲液：10mmol/LTris，1mmol/LEDTA，其中含有RNA酶（RNase）20μg/mL。（6）TAE电泳缓冲液：（7）DNA染色试剂SybrGreen或EB染色液：（8）10X上样缓冲液（9）DNA分子量标准物（DNAMarker）四、操作步骤(Methods)1．培养细菌(cultivationofbacteria)将带有质粒的大肠杆菌于培养液中过夜培养2．细菌中质粒DNA的快速提起（RapidIsolationofPlasmidDNAFromBacteria）（1）取液体培养菌液1.5mL置小离心管中，10000r/min离心1min去掉上清液。加入150μL的溶液Ⅰ，充分混悬细菌，在室温下放置10min。（2）加入200μL新配置的溶液Ⅱ。加盖，颠倒5次使之混匀。冰上放置5min。（3）加150μL冷却的溶液Ⅲ，加盖后颠倒5混匀，冰上放置15min。10000r/min离心5min，上清液倒入另一离心管中。（4）向上清液中加入等体积苯酚/氯仿，震荡混匀，10000r/min离心2min，将上清液转移至新的离心管中。（5）向上清液中加入等体积无水乙醇，混匀，室温放置2min。离心5min，倒去上清乙醇溶液，将离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。（6）加1mL70%乙醇，震荡并离心，倒去上清液，晾干，加入20μL的TE缓冲液，使DNA完全溶解，待用。3．质粒DNA的限制酶切(RestrictionDigestionofPlasmidDNA)取洁净消毒1.5ml离心管1支，分别加入下列成分：自提样品质粒：10μL10×酶切缓冲液：2μL限制性内切酶：2～4u加双蒸水至总体积20μL，小心混匀，置于37℃水浴中，酶解1h，反应终止后，各酶切样品于冰箱中贮存备用。4．DNA琼脂糖凝胶电泳(AgaroseGelElectrophoresisofDNA)（1）琼脂糖凝胶的制备：称取0.4g琼脂糖，置于三角瓶中，加入50mLTAE缓冲液，置微波炉加热全部融化后，取出摇匀，此为0.8%的琼脂糖凝胶。（2）琼脂糖凝胶板的制备：将胶模两端用胶带封闭，水平放置，插入上样梳。待琼脂糖凝胶液将冷却至65℃左右时，小心倒入胶模中，使胶液缓慢展开，直到在整个玻璃板表面形成均匀的胶层，室温下静置20min，待凝固完全后，轻轻拔出上样梳，在胶板上即形成相互隔开的样品槽。（3）取3支1.5ml离心管，分别加入DNAmarker10μL、全部酶切DNA、未酶切的质粒DNA5μL，再向各管中加入上样缓冲液2μL，SybrGreen2μL，混匀。（4）加样：用微量加样器将上述3种样品分别加入凝胶样品小槽内。每次加完一个样品，要用蒸馏水反复洗净微量加样器，以防止相互污染。(5)电泳加完样品后的凝胶板，立即通电。样品进胶前，应使电流控制在20mA，样品进胶后电压控制在60~80V，电流为40~50mA。当指示剂色带移动至距离胶板1～2cm处，停止电泳。(6)

将电泳后的胶板在紫外检测仪下观察在琼脂糖凝胶中的DNA条带。五、结果观察(Observationofresults)在波长为254nm的紫外灯下，观察染色后的电泳胶板。DNA存在处显示出绿色的荧光条带。六、思考题(Questions)1．细菌染色体DNA与质粒DNA分离的主要依据是什么？实验二PCR技术及应用PCRTechniqueandItsApplications一、

目的(Objective)掌握PCR基本原理和方法；熟悉PCR技术的应用。二、原理(Principles)聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，为最常用的分子生物学技术之一。典型的PCR由模板高温变性、引物与模板退火和引物链沿模板延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的DNA得以迅速扩增。其主要步骤是：将待扩增的模板DNA置高温下（通常为93℃-94℃）使其变性为单链；人工合成的两个寡核苷酸引物（单链DNA）在其合适的复性温度下分别与待扩增模板DNA的两条单链互补结合，两个引物在模板上结合的位置决定了扩增片段的长短；耐热的DNA聚合酶（Taq酶）在72℃将单核苷酸从引物的3’端开始掺入，按5’→3’方向延伸，合成与DNA模板互补的新链。

PCR能快速特异扩增任何已知目的基因或DNA片段，并能轻易在50～100μL反应体积中，对皮克（pg）级含量的目的基因扩增得到微克级（μg）的特异性DNA片段。因此，PCR技术一经问世就被迅速而广泛地用于分子生物学的各个领域。它不仅可以用于基因的分离、克隆和核苷酸序列分析，还可以用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析，遗传病和传染病的诊断，肿瘤机制的探索，法医鉴定等诸多方面。三、

主要设备、实验材料和试剂（Equipments,MaterialsandAgents）1．主要设备(Equipments)（1）PCR仪（2）台式高速离心机（16000r/min）（3）微量加样器10μL、100μL、1000μL各一支（4）电泳仪、电泳槽2．材料(Materials)（1）薄壁反应管0.2mL×20（2）塑料离心管架×1（4）常用玻璃仪器及滴管等3．试剂(Agents)（1）DNA模版

（2）对应目的基因的特异引物（3）2mMdNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM

（4）10×PCRBuffer

（5）TaqDNA聚合酶

（6）DNA染色试剂SybrGreen四、操作步骤(Methods)1．在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。

10×PCRbuffer

5μl

dNTPmix（2mM）

4μl

引物1（10pmol）

2μl

引物2（10pmol）

2μl

Taq聚合酶（2U/μl）

1μl

DNA模板（1ng/μl）

1μl

加ddH2O至

50μl，稍加离心混匀。视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。

2．设定反应程序，将上述混合液置PCR仪中进行扩增。扩增条件为93℃预变性2min，进入循环扩增阶段：93℃30s→58℃30s→72℃30s，循环20－25次，最后在72℃保温5min。

3．结束反应，PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。

4．PCR的电泳检测：取10μl扩增产物，加1μlDNA染色试剂SyberGreen，电泳检测。五、结果观察(Observationofresults)在波长为254nm的紫外灯下，观察染色后的电泳胶板。DNA存在处显示出绿色的荧光条带。六、注意事项(Cautions)１．PCR反应应该在一个没有DNA污染的干净环境中进行。2．所有试剂都应该没有核酸和核酸酶的污染，作过程中均应戴手套。

3．PCR试剂配制应使用最高质量的新鲜双蒸水，采用0.22μm滤膜过滤除菌或高压灭菌。

4．试剂都应该以大体积配制，试验一下是否满意，然后分装成仅够一次使用的量储存，从而确保实验与实验之间的连续性。

5．试剂或样品准备过程中都要使用一次性灭菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿应洗涤干净并高压灭菌。

6．PCR的样品应在冰浴上化开，并且要充分混匀。七、思考题(Questions)1、PCR扩增与细胞内DNA半保留复制有何异同？生物化学与分子生物学实习指导（中文版）生物化学与分子生物学实习指导实验一蛋白质含量测定(比色分析法和分光光度法)实验二从小鼠肝脏中提取DNA实验三DNA酶解及DNA片段琼脂糖凝胶电泳实验四现代PCR技术实验五人血清抗胰蛋白酶（α1－AT）的分离及鉴定内容一盐析法，凝胶过滤法内容二纤维素离子交换层析，蛋白含量测定，酶活性测定内容三SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳内容四总结实验六酶的特异性、激动剂、抑制剂实验七温度、pH对酶促反应速度的影响实验八运动对尿中乳酸含量的影响实验九肝糖原实验实验十肝脂质的提取及薄层层析实验一蛋白质含量测定(比色分析法和分光光度法)【目的要求】1.掌握比色分析法和分光光度法基本原理、标准曲线的制作及使用，标准管法结果计算2.熟悉蛋白质含量测定常用方法、原理及应用3.了解常用可见光、紫外分光光度计的测定原理及使用【教学内容】1.酚试剂法蛋白质含量测定Lambert-Beer定律，比色分析法和分光光度法基本原理,722型分光光度计使用，常用蛋白质含量测定方法及应用，酚试剂法测定蛋白质含量原理、操作,标准曲线的制备及使用2.双缩脲法蛋白质含量测定自学和独立完成实验并与酚试剂法比较，结果计算3.紫外分光光度法蛋白质含量测定紫外分光光度法测定蛋白质含量原理，方法，优缺点，注意事项；国产752型紫外分光光度计使用，UV—260分光光度计使用，注意事项，波长扫描，标准曲线制作【实验原理】一、比色分析法许多物质本身具有一定的颜色，也有许多物质本身无颜色，在加入适当的显色剂后生成有色物质。溶液浓度越大，颜色越深。因此可以利用比较溶液颜色深浅的方法来测定有色溶液的浓度。这种方法叫比色分析法。1.物质的颜色和波长：可见光：波长（λ）400—760nm紫外光：λ小于400nm红外光：λ大于760nm光的互补：将两种适当颜色的可见光按一定强度比例混合可得到白光，这两种光叫互补光，该现象叫光的互补。单色光：白光通过棱镜后可分解成各种波长不同的色光，把具有一种波长，不能再分解的光叫单色光。2.溶液的颜色和光吸收的关系：溶液的颜色，是由于不同的有色物质有选择地吸收某种颜色的光而引起的。溶液呈现的颜色是与它主要吸收的光相互补的光的颜色。溶液吸收的光越多，呈现的颜色越深。例如：一束白光通过核黄素溶液，溶液呈黄色，是因为蓝色光被吸收，而其它颜色的光均为两两互补，透过光只多余出黄色光，所以核黄素溶液呈黄色。光吸收曲线：测定同一物质对不同波长光线的吸收程度，以波长为横坐标，光密度为纵坐标作图，所得曲线为光吸收曲线。3.物质浓度，液层厚度与光吸收的关系（Lambert--Beer定律）：当一束单色光通过溶液后，光被溶液吸收的程度（D）与溶液的浓度（C），液层的厚（L）以及入射光的强度（I0）有关。溶液浓度越大，液层越厚，吸光越多，这就是物质（均匀透明固体，液体，气体）对光的吸收定律。lgI0/I意义：当I=I0时，lgI0/I=0，表示溶液完全不吸收光线；当I＜I0时，lgI0/I值较大，表示溶液对光吸收较多；当I→0时，lgI0/I值无穷大，表示光线几乎被溶液完全吸收（溶液不透光）。由此可见，lgI0/I表示了溶液对光的吸收程度。表示方法：光密度OD或D（opticaldensity）吸光度A（Absorbance）消光度E（Extinction）于是，(3)式可写成：D=KCL公式中K为消光系数，K=D/CL，表示有色溶液在单位浓度和单位厚度时的吸光度。同一溶质，K值相同。百分消光系数：C=1%，L=1cm克分子消光系数：C=1克分子浓度，L=1cmD=KCL意义：物质对光吸收程度与该物质的消光系数K，溶液浓度C，液层厚度L成正比。4.待测溶液浓度的计算：（1）标准管法：在同样条件下，测得标准液和待测液的光密度（D）值，然后计算：标准液：Ds=KsCsLs待测液：Du=KuCuLu其中，Ls=Lu，Ks=Lu，Ds/Du=Cs/CuCu=（Du/Ds）×Cs（2）标准曲线法：分析大批待测样品时，采用此法较方便。先配制一系列浓度由小到大的标准溶液，测出它们的光密度（D）值。在一定浓度范围内，溶液浓度（C）与其光密度（D）之间呈直线关系。以各管D为纵坐标，C为横坐标，绘制标准曲线。待测溶液D值测出后，在曲线上查出C。（3）标准系数法：多次测定标准溶液的光密度后求出平均值，标准系数=标准液浓度/标准液平均光密度，同法测出待测液的光密度代入下式：C=待测溶液光密度×标准系数（4）消光系数法：1%浓度，1cm厚度溶液中测得：K=E1cm1%或１克分子浓度，１cm厚度溶液中测得：K=ξC=D/E1cm%,或C=D/ξ常用于紫外吸收法测定蛋白质，核酸含量，二者分别在280nm和260nm处有最大吸收，其消光系数可查到，在同样条件下，测定待测溶液的光密度,带入上式即可求得C。优点：可直接测定，不需呈色，不损失样品,操作简便注意：选择1cm石英比色杯（玻璃杯在紫外光区强烈吸收紫外光，不能使用）二、比色分析的测定方法1.比色分析法：原理：白光透过滤光板后，可得到近似的单色光，让单色光透过有色溶液，然后射到光电池上，光电池受光放出电子，所产生的电流与光的强度成正比关系。利用滤光板可获得近似的单色光，波长范围30-50nm。滤光板最易透过的光是有色溶液最易吸收的光。一般说来，选择滤光板的颜色应与被测溶液的颜色为互补色。2.分光光度法：分光光度法使用分光光度计，利用棱镜或光栅获得单色光，波长范围3-5nm，所以比比色分析法的灵敏度，准确度和选择性都要高。三、比色分析条件的选择1.波长的选择：原则“吸收最大，干扰最小”例：A，B两种物质，A物质最大吸收峰在a处，B物质在a处也有吸收，对A物质的测定有干扰，故选b处波长进行比色测定以满足以上原则。2.光密度的选择：D值读数在检流计标尺中部时，准确度较高，相对误差最小。一般D=0.05—13.显色条件的选择：比色分析中，常需要利用空白溶液调节仪器的透光率为100%，此时D为0。空白溶液仅仅不含被测物质，而其它溶液，试剂和处理条件与被测溶液完全相同。因此，利用空白溶液可消除显色溶液中其它有色物质的干扰，抵消比色杯和试剂对入射光的影响。四、722型分光光度计的使用1.选择波长2．比色杯：（1）液体3/4—2/3，不可过多或过少。（2）用擦镜纸擦干外表面液体。3.灵敏度：调整后不再动。4.将装有空白溶液的比色杯放入光路。原则：开盖调“D=0”，关盖调“T=100”。五、752型紫外可见分光光度计的使用1.选择波长2．比色杯：测蛋白、核酸时使用石英比色杯，专机专用，余同上。3.灵敏度：调整后不再动。4.注意：测蛋白、核酸时，开氘灯。六、蛋白质的测定常用方法：1.根据蛋白质含氮量进行测定的定氮法。2.根据蛋白质结构或组成的紫外吸收特性进行测定的紫外分光光度法。3.根据蛋白质与不同呈色试剂反应而进行测定的比色法。【实验内容】一、酚试剂法（FolinMethod）原理：蛋白质中肽键在碱性溶液中与铜离子形成络合物，此络合物能使酚试剂中的磷钼酸还原产生兰色化合物；同时，蛋白质中的酪氨酸、色氨酸也能与酚试剂的磷钼酸，磷钨酸作用产生兰色化合物，颜色深浅与蛋白质的含量成正比。试剂：1.碱性铜液2.酚试剂3.0.9%NaCl4.标准牛血清白蛋白溶液（1％）操作步骤：1．取上述牛血清白蛋白溶液1.0ml用0.9%NaCl稀释10倍后，按下表操作：温放置20分钟，每管加酚试剂0.5毫升，立即混匀3．室温放置30分钟后，以第6管为空白管，选波长650nm比色，读取光密度。二、双缩脲法（BiuretMethod）原理：凡具有两个以上肽键（—CO-NH—）的物质，在碱性溶液中与铜离子反应，形成紫红色络合物，称双缩脲反应。由于蛋白质含有肽键，也能发生双缩脲反应，颜色深浅与蛋白质浓度成正比。试剂：1.双缩脲试剂2.0.9%NaCl3．标准血清4．待测血清步骤：1．取3支干净的试管按下表操作：2．混匀，30分钟后以第3管为空白管，用520nm波长比色，读取光密度。3．计算：蛋白质含量g%=（Du/Ds）×标准蛋白浓度【注意事项】1．试管洗刷干净，刻度吸管专管专用2．双缩脲法和酚试剂法两个实验的波长分别为520nm和650nm，测定时注意转换波长3．比色测定时，勿触及比色杯光面实验二从小鼠肝脏中提取DNA【目的要求】1.掌握DNA分离的原理、各试剂作用及操作过程2.掌握肝匀浆制备及注意事项3.熟悉DNA浓度、纯度测定原理及方法,仪器使用4.了解分子生物学实验技术(录像)【教学内容】1.从肝中提取DNA小鼠处死方法,试剂配制,离心机使用,肝匀浆制备,DNA分离纯化原理及注意事项2.DNA浓度、纯度测定原理及方法,仪器使用3.(录像带教学)核酸分离纯化,DNA序列测定,核酸探针标记与分子杂交【实验原理】1．生物组织中DNA是以DNA-蛋白质复合物的形式存在2．在稀NaCl溶液中，DNA-蛋白质溶解度小，RNA-蛋白质溶解度大;在浓NaCl溶液中，DNA-蛋白质溶解度大，RNA-蛋白质溶解度小（分开DNA和RNA）3．SDS（十二烷基硫酸钠），使蛋白质变性（分开DNA和蛋白质）（1）SDS是一种阴离子表面活性剂，能使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质的疏水部位;（2）SDS可引起蛋白质构象改变（3）SDS是一种良好的解离剂，可使蛋白质溶解，变性（4）形成SDS-蛋白质复合物，并使复合物带负电4．氯仿-异丙醇可以将蛋白质除去5．适量的冷无水乙醇可使DNA析出。6．防止DNA酶解的办法——加入EDTA-2Na（乙二胺四乙酸二钠）7．检查DNA纯度：A260/A280（1）A260/A280＝1.8，高纯度DNA（2）A260/A280<1.8，含蛋白质（3）A260/A280>1.8，含RNA【试剂】(1)0.14MNaCl，0.1MEDTA(2)5MNaCl(3)30%SDS(4)氯仿-异丙醇(5)0.015MNaCl-0.0015M柠檬酸钠(6)冷无水乙醇【步骤】一．提取脱氧核糖核蛋白1.杀鼠取肝3克（2—3只小鼠），15ml0.14MNaCl，0.1MEDTA洗去血液2.肝匀浆制备（1）乳钵中剪碎（2）15ml0.14MNaCl，0.1MEDTA（3）不要用力研磨3.离心3000rpm10分钟，弃上清沉淀加入0.14MNaCl，0.1MEDTA15ml轻轻悬起离心3000rpm10分钟，弃上清沉淀加入0.14MNaCl，0.1MEDTA10ml使之溶解，转至50毫升三角烧瓶中二．除蛋白质1.加入30%SDS1ml混匀，60℃水浴轻摇15分钟，取出冷至室温2.5MNaCl2.75ml,轻摇10分钟3.氯仿-异丙醇19ml（沉淀蛋白）,轻摇20分钟,离心2500rpm10分三．粗提DNA1.吸上清（水相）转入玻璃离心管（含DNA）,弃沉淀（剩余物）2.加入1.5倍体积冰乙醇（无水乙醇）轻摇至DNA析出四．检测1．用镊子或玻璃棒取出置试管中，加入0.015MNaCl-0.0015M柠檬酸钠1毫升2．稀释适当倍数：量取10-50μl(用0.1ml刻度吸管吸取)原液，用0.015MNaCl-0.0015M柠檬酸钠稀释到5ml（稀释100-500倍）3．测A260/A280（用0.015MNaCl-0.0015M柠檬酸钠做空白溶液）五．计算1.DNA浓度：（μg/ml）=A260×50×稀释倍数2.DNA纯度：A260/A280【注意事项】1.研磨时上下用力，尽量避免DNA链断裂。2．加入氯仿—异丙醇后勿剧烈摇动，以免大分子断裂。3．有机溶剂对人体有害，操作时要注意。实验三DNA酶解及DNA片段琼脂糖凝胶电泳【目的要求】1.掌握限制性核酸内切酶概念、特点及作用原理，DNA酶解技术的应用2.掌握琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段原理及其操作3.熟悉电泳基本原理及其影响因素【教学内容】1．限制性核酸内切酶概念、特点及作用原理，DNA酶解技术的应用2．DNA片段琼脂糖凝胶电泳3．电泳概念、分类、应用、基本原理及其影响因素,琼脂糖凝胶制备、加样、电泳及结果分析【实验】一．DNA酶解原理：1.限制性核酸内切酶：是一类能识别并水解双链DNA中特定碱基顺序的核酸水解酶。一般能识别4-6个碱基对，并在特定位点切割。如：HindⅢA↓AGCTTEcoRⅠG↓AATTCHpuⅡC↓CGG2.酶单位数：在最适温度、PH条件下，1小时完全水解1μgλDNA所需的酶量为1个单位。试剂：(1)λDNA（0.38μg/μl）(2)HindⅢ(16u/μl)(3)酶解Buffer(Tris-HCl,NaCl,MgCl2,DTT)(4)反应终止液（溴酚蓝1%，SDS1%，EDTA2%，甘油50%）方法：1.取两只EP管（1）λDNA10μl，双蒸水10μl（2）λDNA10μl，HindⅢ10μl充分混匀2.37℃水浴2小时。3.保温结束后加入终止液5μl。二.琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段（水平潜水式）原理：1．DNA含有PO43-基团，在pH7.5Buffer中带负电,在电场中向正极移动。由于不同大小的DNA片段的电荷密度大致相同，自由电泳时，各核酸分子的迁移率区别很小，难以分开2．选用适当浓度的凝胶作为支持物，使之具备一定的孔径，即可发挥分子筛效应（凝胶孔径对大小不同的分子有不同的阻力），使大小不同的核酸片段迁移率出现较大差异，达到分离的目的，同样条件对Maker电泳，对比观察DNA酶解效果3．DNA经溴乙锭（EB）染色，溴乙锭可以插入DNA双螺旋结构两个碱基之间，与核酸形成络合物，在紫外（300nm,360nm）激发下，产生桔黄色荧光（590nm可见光）。标准Maker经溴乙锭（EB）染色可以观察到6条带，分别为:23Kb,9.9Kb,4.4Kb,4.3Kb,2.2Kb,2.0Kb试剂：（1）1%琼脂糖（2）TAE液（3）Marker（4）EB方法：1.电泳仪接线：黑（负）—黑，红（正）—红2．凝胶槽准备：用胶布固定胶槽两侧，调整梳子高度距离槽底2-3毫米，调好水平。3．灌胶：(1)称取0.8克琼脂糖,加入80毫升TAE中,热浴溶解至透明(2)60℃左右加入EB100μl(终浓度0.5μg/ml),倒入备好的凝胶槽中。应注意胶面平整,无气泡(3)冷却后,拔去梳子4．加样:(1)去掉胶布，将灌好的胶板平放在电泳槽中(2)加入电极Buffer使之高出胶面(1-3毫米)(3)用进样器吸样品20μl加入样品槽中5．电泳:v=100V,1-1.5小时,至溴酚蓝移出2/36．观察:(戴手套)紫外灯下（254-365nm）,暗处观察,记录。可见DNA橙红色区带【注意事项】1．在EP管加入试剂时要用漩涡混合器混合后离心。2．琼脂糖凝胶电泳时加样侧应位于负极端。3．溴乙锭可引起基因突变，操作时要注意个人防护。4．紫外光对人眼有害，观察时加盖玻璃罩，观察时间不宜太长。实验四PCR技术【目的要求】1．掌握PCR技术概念、原理、方法及应用2．熟悉PCR仪的使用及注意事项3．了解TaqDNA聚合酶的来源和特点，引物的设计原则4．了解现代PCR技术的扩展【教学内容】1．PCR技术概念、原理、方法、应用及技术扩展2．TaqDNA聚合酶的来源和特点，引物的设计原则3．PCR仪的使用及注意事项4．模板的制备【实验】原理：以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板5’末端和3’末端相互补的寡核苷酸片断为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制机制沿着模板链延伸至完成新的DNA合成，重复这一过程，即可使目的DNA片断得到扩增。PCR技术实际上是在摸板DNA，引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的酶促反应。试剂：1.TaqDNA聚合酶2.dNTP3.引物4.模板5.缓冲液(50mmol/L,10mmol/L,Tris-HCl,1.5mmol/LMgCl2)步骤：1．将PCR反应组分放在冰上解冻，并进行短时间离心以使组分沉降管底2．根据下列顺序在PCR反应管中加入各反应组分：3．将反应组分混匀后，加入50μl石蜡油，离心数秒4．根据下列参数进行PCR扩增：5.将10μlPCR扩增产物（含1×上样缓冲液）点样于1.5-2.0％琼脂糖凝胶中，电泳后在紫外灯下观察DNA扩增产物。【PCR技术的应用】1.在法医学上的应用：一根毛发,一滴血,少量精液,牙齿,口腔上皮细胞可进行DNA鉴定2.遗传疾病的诊断和治疗：可在怀孕早期获得少量样品(羊水,绒毛)进行扩增,发现异常的胎儿早期终止妊娠3.在艾滋病检测中的应用:对于大多数AIDS患者，通过血清学方法检测其血清中HIV-1抗体可特异敏感地加以筛查和诊断，但对于疑似HIV-1感染的病例，早期机体内尚无HIV-1抗体产生，或携带病毒的母亲生产的婴儿是否已感染HIV-1（垂直传播，新生儿体内尚无抗体产生），直接检测病毒则十分必要4.检测癌基因:可选择性地扩增ras基因百万倍，灵敏度为5-10%，即100个细胞含有5-10个具有ras基因点突变的细胞即可检测出来5.DNA克隆:只要知道目的基因的两侧序列，通过一对和模板DNA互补的引物，就可以十分有效地扩增出所需要的片段6.DNA序列的测定和基因定量7.考古学的应用【PCR技术的扩展】1.RT-PCR2.不对称PCR3.巢式PCR4.原位PCR5.反向PCR6.重组PCR【注意事项】1.加各试剂时，要注意准确操作2.PCR仪运行时勿随意改动3.溴乙锭可引起基因突变，操作时要注意个人防护4.紫外光对人眼有害，观察结果时加盖玻璃罩，观察时间不宜太长实验五人血清抗胰蛋白酶（α1－AT）的分离及鉴定【目的要求】1.掌握α1-AT分离纯化各步骤原理、操作及鉴定方法2.掌握基本技术操作及仪器使用3.熟悉人血清蛋白质的分类方法,α1-AT性质4.了解生物大分子制备技术,分离纯化类型5.学会利用学过的分离纯化方法进行基本的科研设计6．练习研究论文基本写作【教学内容一】分段盐析法，凝胶过滤法（盐析法概念及原理，分段盐析概念，分子筛效应，柱层析基本技术）【实验原理】1.盐析法是一种利用蛋白质在高盐溶液中溶解度不同而分离的方法。通过将硫酸铵加入蛋白质溶液中，使蛋白质表面电荷被中和，水化膜被破坏，导致蛋白质在水溶液中的稳定性因素去除而沉淀。2.通过分段改变盐类浓度达到分离目的的方法叫分段盐析法。3.凝胶过滤又称分子筛层析。混合物随流动相流经装有凝胶作为固定相的层析柱时，分子量大的物质因不能进入凝胶网孔而沿凝胶颗粒间的空隙先被洗脱(阻力小,流程短,流速大),分子量小的物质因能进入凝胶网孔而受阻滞,流速缓慢,流程长而后被洗脱,由于流速不同可以把大小不同的分子分开.【仪器与试剂】1．离心机2．真空泵3．饱和硫酸铵溶液：称取767g固体硫酸铵，加入1000ml水中，加热使之溶解，室温冷却后4℃静置过夜，然后用氨水将pH调至中性。4．固体（NH4）2SO45．SephadexG—256．奈氏试剂7.双缩脲试剂8．pH7.4,0.05MPBS【步骤】一分段盐析1．观看人血清抗胰蛋白酶（α1－AT）的分离及鉴定教学录像2．每组量取20ml血清，倒入一干净烧杯中，缓慢加入饱和硫酸铵20ml，边加边搅拌,放入4℃冰箱30分钟3．从冰箱中取出烧杯，将血清倒入离心管，3000rpm，离心20分钟4．将上清倒入一干净量筒中，记录体积后，倒入干净烧杯中，按17.6g/100ml量取固体硫酸铵，缓慢加入上清中，边加边搅拌。4℃冰箱放置30分钟5．将烧杯中液体倒入抽滤器中，负压抽滤6．刮下滤纸上的粗提蛋白，用4ml缓冲液溶解，准备加样二凝胶过滤层析1．凝胶柱准备：（1）连接层析柱（2）夹住出口，加入1/3体积的0.05MpH6.4PBS，灌胶，待凝胶自然沉降约1cm时，打开出口，控制流速，60滴/分（3）层析柱填装完成后，连接下口瓶，调节流速，使入口和出口流速相同。平衡至入口pH值与出口pH值相同（即pH试纸呈色相同），关闭出口，等待加样2．加样：用吸管吸去胶面以上的缓冲液，立即加入蛋白粗提液（沿管壁缓慢加入）3．打开出口，调流速15滴/分，待蛋白粗提液完全进入胶面，用少量缓冲液清洗管壁。连接下口瓶4．检测：用双缩脲试剂检测洗脱液。待试剂变红，开始收集，直到试剂不变色停止收集。测量并记录收集液的体积，留取1ml样品（标记为G—25样品），放入一冷冻管中冰箱冻存；剩余的液体收集入一大试管中，作好标记，下次实验用5．洗去铵盐：全速洗脱，用奈氏试剂检测洗脱液，直到橙色消失为止，回收凝胶【注意事项】1．盐析所用器皿一定要干燥2．盐析时，应将饱和硫酸铵或固体硫酸铵加入到血清中，且边加边搅拌3．层析柱上方要留有少量液体，避免使凝胶暴露于空气中4．凝胶过滤上样时，使样品沿管壁缓缓流下，勿冲破胶面【教学内容二】DEAE-纤维素离子交换层析(离子交换层析概念,交换剂的组成，分类,交换剂的选择，离子交换层析基本原理,分离α1-AT原理及操作过程,注意事项,洗脱方式及意义)。酶活性测定，蛋白质定量【原理】1.DEAE-cellulose离子交换层析：DEAE-cellulose是应用最广的阴离子交换剂，本身带有正电荷，能不同程度的吸附溶液中的阴离子。层析时使用不同离子强度或不同pH值的缓冲溶液进行分段洗脱，含负电荷少的离子首先被洗脱下来，含负电荷多的蛋白质后被洗脱下来，于是不同蛋白质被分开。2.α1－AT活力测定：α1－AT的活力是通过检测它对胰蛋白酶的抑制力而测定的。胰蛋白酶可以水解低分子底物—苯甲酰精氨酰对硝基苯胺，产生黄色产物对硝基苯胺，颜色深浅与胰蛋白酶活力成正比。将各步纯化的α1-AT样品与一定量的胰蛋白酶溶液反应，检测胰蛋白酶剩余活力，该剩余活力与α1-AT活力成负相关。【仪器】1．722分光光度计2．恒温水浴【试剂】1．DEAE-纤维素2．样品：由G-25除盐的α1-AT粗提液3．0.05mol/LpH6.4磷酸缓冲液；0.12mol/LpH6.4磷酸缓冲液4．0.5mol/LNaCl5．0.5mol/LHCl6．胰蛋白酶液：取3mg胰蛋白酶溶解于16.6mlpH3水中，浓度为180μg/ml7．0.05mol/LpH8.2Tris-HCl缓冲液，内含0.02mol/LCaCl28．苯甲酰－精氨酰－对硝基苯胺（简称BAPNA）,取18mgBAPNA溶解于10ml甲醇中,加Tris-HCl缓冲液到50ml9．33%乙酸【步骤】一DEAE-cellulose离子交换层析1.观看教学录像2.取出上次课的粗提样品，