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文档简介

A型口蹄疫液相阻断ELISA2015年12月一、液相阻断ELISA基础知识液相阻断ELISA（LB-ELISA）通途：1、检测口蹄疫感染，广泛用于国际贸易中，是OIE指定方法之一；2、监测牛、羊和猪等偶蹄动物血清中口蹄疫免疫效价，评价口蹄疫疫苗免疫效果。BL-ELISA原理图待检血清与病毒抗原混合液捕获抗体检测抗体病毒酶结合物显色液阳性不显色阴性显黄色二、实验前准备1、使用前，试剂盒所有组份应回复到18-26℃，试剂要混合均匀，每个样品使用一个吸头。2、浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水25倍稀释。三、实验操作步骤1、抗原抗体反应布板图296孔酶标板检测20份样品布局图S11:32S2S3S4S5S6S7S8S9S10+1:32-1:41:641:641:81:1281:1281:2561:256S11:32S12S13S14S15S16S17S18S19S201:512病毒抗原1:641:10241:1281:20481:2561:40961.1稀释病毒抗原：用配制好的洗涤液在孔外6倍稀释病毒抗原。1.2待检血清稀释：在血清稀释板上，使用洗涤液连续2倍稀释每份被检血清，每份血清稀释2-8孔，根据检测用途而定。使每孔最终量都为50vl。1.3稀释阳性对照，参照步骤1.2，连续2倍稀释，从1：16-1：1024。1.4稀释阴性对照，参照步骤1.2，连续2倍稀释，从1：2-1：4。2、样抗原抗体混合液及病毒抗原对照从血清稀释板上按次序转移到包被板上50vl/孔，封板，37℃反应30Min。3、洗涤液洗版5次，拍干。加抗体溶液50vl/孔，封板，37℃反应35Min。4、同上洗板5次，拍干。加酶结合物50vl/孔，封板，37℃反应35Min。2、结果判定抗原对照4孔，弃去1个最高和最低值，计算剩余2孔的平均OD值，再除以2，即50%对照值，该值即为临界值，表示阻断50%反应的对照OD450值。备检血清OD450值＞临界值，判为阴性；备检血清OD450值≤临界值，判为阳性；每份血清系列滴度稀释中，阳性孔的最高稀释倍数即为该备检血清的抗体效价。若临界值处于2孔之间，抗体效价取相邻阳性孔和阴性孔稀释倍数的反对数中间值，如果处在1：64和1:128之间，则该份血清抗体效价是1：90。定性检测时，两个孔只有一个孔为阳性，则抗体滴度为1：128，2孔均为阳性，则抗体效价＞1：128.抗体效价≥1：128，判为阳性；抗体效价≤1：64，判为阴性；抗体效价在1：64-1：128之间，判为可疑；可以血清需要复检，复检抗体效价≥1：128，判为阳性；抗体效价≤1：64，判为阴性；五、注意事项1、实验前必须认真阅读说明书。2、试剂盒所有浓缩试剂在低温放置下，可能有无机盐结晶，如果有结晶盐出现，80℃温育30min可溶解，且不影响实验。3、所有试剂必须回复室温使用，以免影响抗原抗体反应4、温育设备要精确度要高，温度过高过低都会影响OD值高低

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