酶联免疫吸附双抗体夹心法课件

酶联免疫吸附双抗体夹心法

测定血清中甲胎蛋白含量

临床八年1205班2组陈旭陈楷李皓一、实验目的

1掌握酶联免疫吸附实验（ELISA）的原理2熟悉酶联免疫吸附实验的操作方法二、实验原理基础知识

1971年瑞典学者Engvail和Perlmann,荷兰学者Van

Weerman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，即酶联免疫吸附测定法(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)。ELISA现在已成为目前分析化学领域中的前沿课题，它是一种特殊的试剂分析方法，是在免疫酶技术(immunoenzymatictechniques)的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术。原理一

ELISA的基础是抗原（或抗体）的固相化及抗原（或抗体）的酶标记。结合在固相载体表面的抗原（或抗体）仍保持其免疫学活性。原理二

抗原(或抗体)可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性。原理三

固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。ELISA的三条基本原理双抗体夹心法方法

用已知抗体包被，加入待测抗原，再加酶标抗体，加底物显色。

固相(包被)抗体Ab+样品(抗原Ag)+酶标抗体Ab*→Ab-Ag-Ab*+底物(TMB)→显色应用

这种方法欲测的抗原必须有两个可以与抗体结合的部位，因为其一端要与包被于固相载体上的抗体作用，而另一端则要与酶标记特异性抗体作用。双抗体夹心法图示1、已知抗体包3、加酶标抗体4、加酶作用的底物2、加肿瘤患者血4、加酶作用的底物洗涤洗涤洗涤洗涤双抗体夹心法测抗原1、已知抗体包2、加健康人血清3、加酶标抗体+-YYYEYEYEYYEYEYEYYYYEYEYEYYYYYYYYYYYYYYYYYY三、实验仪器&试剂仪器

全自动酶标仪、全自动酶标洗板机四、实验步骤获得AFP未标定抗体将AFP抗体与固相载体连接形成固相抗体洗涤除去未结合的抗体及杂质加入封闭蛋白溶液以封闭载体表面残留的蛋白结合位点洗涤并除去未结合的封闭蛋白加血清形成固相抗体－抗原复合物详细步骤1.标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标准品100μl，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μ，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。（稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为（1800ng/L，1200ng/L，600ng/L，300ng/L，150ng/L）。辣根过氧化物酶(HRP)常用底物：(1)邻苯二胺(OPD)：反应显橙黄色，应避光，致癌性。(2)四甲基联苯胺(TMB)：TMB是一种脂溶性较强的基团，由于这种高度的脂溶性，使其易形成多聚体，在HRP活性部位产生粗大的、深蓝色沉淀物反应后呈蓝色。酶反应用HCL或H2SO4终止后，TMB产物由蓝色呈黄色，最适吸收波长为450nm。五、结果分析以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。六、思考题试验中哪些因素可能会对实验结果造成影响？（一）固相载体（二）抗原（三）试验样品（四）结合物(五）洗涤剂与稀释剂（六）底物（七）作用时间(八)试验的重复性（精确度）（九）对使用仪器要求六、应用检查抗原半抗原1.内分泌方面已经用于检测雌性激素、绒毛膜促性腺激素、黄体素、胰岛素、皮质醇、促甲状腺素和孕酮等2.在血液学方面可用于检查凝固因子（如第Ⅷ凝固因子）、红细胞抗原及结合球蛋白（HaptoGlobin）等检查抗体1.在寄生虫病方面，它用于对疟原虫、阿米巴、利日曼原虫、锥虫、血吸虫、旋毛虫病等