全国流行性脑脊髓膜炎防治指南(试行)

行膜（（Neisseriameningitidis）、C于年和1977年先后发次全国1967年春季最403/105.49%，流A群疫／10AB群BC群有CNm级群众的身人精选资料，欢迎下载疫级各6小时在小有关程序带菌县为单位以2岁以下健精选资料，欢迎下载分离的菌病预、当内23县月内5例或5痛6死出现及精选资料，欢迎下载首切接综旦发现有病例为学％％，难以据病例的康人群带A群流A+C群流省精选资料，欢迎下载A群流A+C群A群流月2与第3个月3时第2接种1＋流脑接2岁以2A群流A+CA3个月；22AA1针于1。A+C群流流脑督部院要早采精选资料，欢迎下载密切7热吐务参考行免A群流6个月当地发C群2周小学生及流2岁以精选资料，欢迎下载1％通医群众筑工精选资料，欢迎下载

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流行性脑脊髓膜炎的样品采集和运送适宜的检测样品为脑脊液液肤粘膜出血点挤出液清及鼻咽拭子等例的脑脊液液肤粘膜出血点挤出液中检出脑膜炎奈瑟菌可直接作为确诊依据。一、样品采集：拭子：长柄棉拭子采咽后壁两侧分泌物即接种于卵黄双抗培养基（或巧克力血平板，也可将咽拭子放入液体双抗增菌管内，增菌8-12小时以后分离培养。．脑脊液：采集毫升脑脊液，可直接接种于巧克力EPV板，也可先增菌再进行分离培养。液菌手续抽取发热期病人全血毫升即加于50毫升的葡萄糖肉汤中增菌后再分离培养；．淤血点：选病人皮肤上的新鲜淤斑或淤血点，消毒后用针头挑破，挤出组织液，用无菌棉签蘸取先接种含双抗的葡萄糖增菌肉汤管中增菌小时后分离培养或直接接种EPV平板片染色直接镜检涂片革兰染色，直接镜检；涂片也可做免疫荧光检查。．血清：采集病人发病早期和恢复期周内）双份血清，检测血清中特异性抗体呈4倍或4倍以上升高。二、样品的处理和运送．及时处理样品：脑膜炎奈瑟菌比较脆弱，采集样品后，应尽可能地做到床边接种，若无可能则应再最短的时间内送至实验室进行接种培养。．早期采集样品：应尽可能采集病人用药前的早期样品，这可以明显提高病原的捡出水平。．保温运送：脑膜炎奈瑟菌对温度较为敏感，温度过低或过高均可导致菌株死亡。在运送样品或培养物时，应保持样品处20℃-36℃之间，切记不能低温运送（检测抗体的血清标本除外要求每份血液标本不少于3毫升离血清后低温(<-20℃)保存检测流脑抗体测定和/或细菌分离与鉴定。精选资料，欢迎下载附件2－A

流行性脑脊髓膜炎病原学诊断方法A1病原体(脑膜炎奈瑟氏菌Neissriameningitiｄｉs)分离从疑似流脑患者采集或急性期血液分离Nm。A1.1标本的采集A1.1.1：无菌操作，吸出CSF立即放到无菌试管内离心3000r/min30min)，用灭菌过的毛细管吸取沉淀物直接接种10％羊血巧克力色琼脂上(CSF上清液部分供检测Nm特异抗原，亦可将其置于20℃待测5％二氧化碳环境37℃培养24～72h日检查细菌生长的情况时分离纯培养物供鉴定。A1.1.2血液：采取病人急性期静脉血液6mL，无菌操作，向盛有30mL菌用葡萄糖肉汤的三角瓶内注入血(余下的2mL血液离心后吸出血清，供检测Nm特异抗原和抗体，亦可将其置于20℃待测)5％二氧化碳环境，培24～72h，每日进行观察、分离、培养。A1.2接种和菌种鉴定A1.2.1细菌形态应为革兰阴性卵圆形或肾形μm×0.6μm大小。常成对排列，临近两边扁平凹陷。A1.2.2菌落接种于巧克力色琼脂平皿上二氧化碳℃培24h后，其菌落直径约1mm，表面突起、光滑、湿润、圆整、略带灰白色、半透明、不溶血、无色素。培养时间延长，菌落增大、变成黄色、不透明，并可出现颗粒状中心和放射性周边。A1.2.3生长及抗原特性大多数Nm菌株分解葡萄糖和麦芽糖酸不产气。不分解蔗糖、果糖和乳糖。过氧化酶和氧化酶阳性。Nm新分离菌株具有下列主要抗原：血清群特异性荚膜多糖，主要外膜蛋白－OMP(包括血清型特异的2/3类OMP，亚型特异的类OMP以及4与5类OMP)，铁调节蛋白，脂寡糖LOS)，脂蛋白、菌毛抗原等，根据群特异性荚膜多糖的结构与组成成分，Nm可分为13个血清群(A、、C、D、29E、H、I、K、L、W135、X、Y、Z)，其中90％以上的病例是由、BCNm起的。根据可将B群与C群Nm分成20个血清型差不多半数菌株目前尚不能分型可分型菌株中，1524型P1.2P1.1P1.12P1.15及P1.16亚型多见；精选资料，欢迎下载对于Nm现有与两个血清型，以亚多见。可以分成13个LOS免疫型，其A群以L10和L11型多见B群中以L379复合型多见。Nm特异性荚膜多糖、型和亚型的OMP等抗原成分对流脑发病与流行及其菌苗的研究均具有重要价值。精选资料，欢迎下载附件2－B

流行性脑脊髓膜炎血清学诊断方法B1玻片凝集试验B1.1目的应用玻片凝集试验对Nm病原菌株或带菌者菌株进行血清学分群。B1.2材料B1.2.1待检的Nm菌株纯培养物。B1.2.2Nm断血清：多价I(包含、B、C、D)，多价Ⅱ〔包含1889(Y)、1890(H)1892(29E)［包319(W135)1916(X)1486(I)1811(K)群］及11群单价血清，共计14种。B1.2.3洁净载玻片。B1.2.4生理盐水。B1.3试验方法B1.3.1先将诊断血清按说明书稀释成所需的浓度，滴一滴在洁净的玻片上。B1.3.2用白金耳刮取菌苔少许玻片上沾取少量血清一旁研磨均匀与血清混匀。B1.3.3轻轻摇动玻片数次，在1～2min内出现明显凝集者，即为阳性。B1.3.4检查从病人分离的疑似时先试血清，若不与其发生凝集，则试用B或C群血清，仍不凝集时，则试用多价Ⅱ或多价Ⅲ血清。若发生凝集，再用单价血清定群。从病人分离的疑似Nm对现有诊断血清皆不凝集者则送研究单位进一步鉴定。B1.3.5在玻片上与各群诊断血清水或正常兔血清皆发生凝集者定为自凝菌。B2酶联免疫吸附试验(ELISA)：按照试剂盒说明书进行操作。B3杀菌力试验B3.1目的应用微量杀菌力试验(TTC)测定病人急性期和恢复期血清中对Nm杀菌抗体水平。此方法也可用于健康人群的血清抗体测定。B3.2材料B3.2.1

靶菌：对补体的自然杀菌作用具有耐受性，但对杀菌抗体反应敏感的Nm(A群29019，B群和C群Nm)。精选资料，欢迎下载B3.2.2稀释液：Dulbeccos磷酸盐缓冲盐水液：氯化(NaCl)8.0g，氯化(KCl)0.2g，磷酸氢二(Na2HPO4)1.15g，磷酸二氢钾(KH2PO4)0.2g，蒸馏水800mL；液：氯化钙(CaCl2)0.1g，蒸馏水100mL；液：氯化镁(MgCl2·6H2O)0.1g，蒸馏水100mL。上述三液分别灭菌℃15min，4备用。需用时A液份B液和C液各1份的比例混合，pH为7.1。使用时释液加灭活兔血1mL500gB2500单位或硫酸抗敌霉素5000单位。稀释液盛于小瓶中，4℃备用，可存2周。B3.2.3滴定板部U”形的96孔有机玻璃微滴板备用同样大小的普通玻璃作盖板它们平放在80℃的烤箱内烤后备用验完毕约80℃的热水泡板1h杀死靶菌，再以自来水冲洗干净，并用棉棒拭净不洁净的孔。最后以蒸馏水冲洗一次，37℃烤干后同上于80干烤。滴定板使用一段时间后或遇到杂菌污染较严重时水杀死靶菌并冲洗干净；在比较稀的硫酸重铬酸钾清洁液内浸泡，冲洗干净后同上处理备用。B3.2.4兔补体：可以购买成品。B3.2.5

氯化三苯四氮唑TriphenylTetrazoliumChloride，TTC)琼脂培养基(TTC琼脂)B3.2.5.1TTC琼脂配方：牛肉膏0.5％，氯化0.5％，日本蛋白3.0％，可溶性淀0.2％，以蒸馏水配制，调pH7.4～7.6，琼脂0.5％。B3.2.5.2TTC琼脂制作上述培养基成分熔化后装于大试管灭15min，冷却后置℃备用。临用前将培养基加热熔化，每培基加50％葡萄糖注射液0.1mL1％TTC水溶液(4℃避光保存)0.1mL混匀放45℃水溶液中待用。B3.2.5.3阳性参考血清用Nm免疫兔制备的诊断血清，未加防腐剂，经预试测定其杀菌抗体滴度较高(1∶3200以上)。B3.3杀菌抗体测定步骤B3.3.1靶菌液的制备精选资料，欢迎下载B3.3.1.1开启A或C群Nm菌种种到巧克力色琼脂平皿上℃二氧化碳孵箱或烛缸培养15～20h3～5个菌落涂于另一平皿～15h。B3.3.1.2用Nm诊断血清和生理盐水进行玻片凝集及显微镜检查菌种。B3.3.1.3菌种被确证以后其菌苔匀于灭菌脱脂牛奶管中成浓菌液，分装若干支小试管，每管约0.2mL置—20℃以下保存，Nm可存活～6个月。B3.3.1.4需用靶菌时，取出一支上述牛奶菌种管，熔化后立即转种并放℃冰箱内保存，供每日分离靶菌制作菌悬液，可备用周。在测定抗体的过程中，每次所用靶菌传种的代数保持一致。B3.3.1.5从所分离的靶菌平皿上挑取～5典型菌落，涂抹转种巧力色琼脂平皿37℃烛缸培养4～6h，刮取菌苔，于盛3.5mL左右稀释液的试管壁上用白金耳将其充分研磨，制成轻度混浊的均匀菌悬液，其光密度值相当于0.1。B3.3.1.6取出上述菌悬液2mL加到0.5cm比色杯内为540nm的分光光度计上测其光密度值。B3.3.1.7稀释液用量按式(B1)计算：mL；

X＝OD×10—0.1……………(B1)

式中—稀释液用量，OD——光密度值。按照式(B1)计算稀释液用量后往里加入靶菌悬液时相当于光密度值为0.1的靶菌液作了10倍稀释吸均匀后其开始再连续作倍稀释至10－5稀释度，以菌液的最终浓度为每毫升含个菌落形成单位为宜。B3.3.1.8稀释好的靶菌悬液在1h内用完。B3.3.2杀菌抗体的测定B3.3.2.1先在微滴板每孔内加1滴相当于μL的稀释液。B3.3.2.2用移液器从每排第一孔内加25μ经56℃30min灭活的待检血清吸5～10次后吸出25μL至下一孔此作连续倍比稀释至最后一孔份血清分别用一支移液枪头。B3.3.2.3从低温冰箱内取出补体，37℃温水中摇动将其速溶，每孔加一滴。若补体已冷冻干燥往安瓿内加相当于补体血清原体积的稀释液其融化后精选资料，欢迎下载即刻使用。B3.3.2.4每孔加一滴稀释成合适浓度的靶菌菌液置微型振荡器上中速振荡5min，再在37℃培养25min，取出后重复上述振荡。B3.3.2.5每孔加已熔化冷至℃左右的TTC脂后，微滴板置℃烛缸内培养15～20h后观察结果。B3.3.2.6每次试验需做下列对照：阳性参考血清对照；孔补体对照稀释液、补体、菌液各一滴，检查补体自然杀菌活性)；4细菌生长对照(稀释液、灭活补体和靶菌菌液各1)。每次检测时至少每5块微滴板中应有一组上述三种对照试验。B3.3.2.7往各孔滴完靶菌菌液之后菌液两滴分别滴加到一个巧克力色琼脂平皿的一端，沿着划好的两条线倾斜下流，于37℃烛缸内同时培养，次日检查每滴靶菌的菌落数及其纯度。B3.3.2.8判断结果时检查上述三种对照试验的结果体的和细菌生长对照的各孔应出现众多的红色点状小菌落考血清应达到原来确定的杀菌滴度各孔中红色点状菌落数目明显地少于补体对照孔或不出现红色点状菌落时判断为杀菌阳性果所试孔中的菌落数目接近补体对照孔的一半或更多时，则判断为杀菌阴性。B3.3.2.9根据红色点状菌落数目的多少，以符号“＋”记录试验结果。若补体及靶菌生长对照各孔的细菌正常生长时出现众多红色点状菌落记＋＋＋＋各孔与其比较，菌落数减少30％以下，记为“＋＋＋50％左右记右记菌落则记以细菌生长成呈“＋”及以下者判断为杀菌阳性；以“＋＋”及以上者判为杀菌阴性。以出现杀菌阳性的血清最高稀释度为杀菌抗体的最高滴度。精选资料，欢迎下载附件2－CC1目的

流行性脑脊髓膜炎胶乳凝集试验应用胶乳凝集试验测定病人CSF、急性期血清和尿中特异抗原，辅助流脑临床诊断。C2材料可购买成品胶乳检测试剂，按照说明书进行操作。C3.2以胶乳凝集试验检测疑似流脑病人标本内群特异性抗原。C3.2.1病人标本的处理CSF离心(3000r/min30min)，取上清，沉淀部分作细菌培养；急性期血液(2mL)，分离血清，置℃将其灭活30min；急性期尿液5mL无乙醇，置4℃1～2h，离心(3000r/min，15min)，弃上清，收集沉淀部分加0.25mLBBSB液将其溶解，同前离心，小心地吸取上清液待测，不要吸取尿中不溶解的沉渣。C3.2.8在上述病人标本中只要有一种标本与抗任何一所致敏Lx发生明显凝集反应，则说明所检标本中含有相应群特异的抗原，即可辅助临床诊断为流脑。附件2－D

标本及疑似菌株ＰＣＲ辅助鉴定对于不能用血清学分群的脑膜炎奈瑟菌疑似菌株或无法进行脑膜炎奈瑟菌分离培养的脑脊液液清标本可采用ＰＣＲ方法进行ＤＮＡ扩增辅助检测鉴定。3.1目的基因：唾液酸转移酶基因（基因为PCR扩增的目的片段来区分Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｗ１３５、Ｙ等五个常见流脑血清群。orf-2因：可作为流脑奈瑟菌属的特异性基因。3.2寡聚核苷酸引物序列crgAF:5’-gctggcgccgctggcaacaaaattc-3’,R:5’-cttctgcagattgcggcgtgccgt-3’Orf-2(A)F:5’-cgcaataggtgtatatattcttcc-3,R:5’-cgtaatagtttcgtatgccttctt-3’SiaD(B)F:5-ggatcatttcagtgttttccacca-3’R:5’-gcatgctggaggaataagcattaa-3’SiaD(C)F:5-tcaaatgagtttgcgaatagaaggt-3’R:5’-caatcacgatttgcccaattgac-3’SiaD(Y)F:5-ctcaaagcgaaggctttggtta-3，’R:5’-ctgaagcgttttcattataattgctaa-3’SiaD(W135)F:5-cagaaagtgagggatttccata-3’R:5’-cacaaccattttcattatagttactgt-3’3.3样品处理可采用目前市售的ＤＮＡ提取试剂盒提取样品ＤＮＡ取直接煮沸方法，将样品煮沸３０分钟，离心，取上清作为扩增样品。3.4扩增及检测条件92℃30秒，55℃40，72℃30秒37个环，反应产物1.5-2%脂糖凝