分子荧光光谱法课件

分子荧光光谱法

MolecularFluorescenceSpectroscopy

1ppt课件分子荧光光谱法

MolecularFluoresce荧光是指一种光致发光的冷发光现象。当某种常温物质经某种波长的入射光（通常是紫外线）照射，吸收光能后进入激发态，并且立即退激发并发出比入射光的的波长长的出射光（通常波长在可见光波段）；而且一旦停止入射光，发光现象也随之立即消失。具有这种性质的出射光就被称之为荧光。

2ppt课件荧光是指一种光致发光的冷发光现象。当某种常温物质经某种波长的光致发光

物体依赖外界光源进行照射，从而获得能量，产生激发导至发光的现象。它大致经过吸收、能量传递及光发射三个主要阶段，光的吸收及发射都发生于能级之间的跃迁，都经过激发态。而能量传递则是由于激发态的运动。紫外辐射、可见光及红外辐射均可引起光致发光。如磷光与荧光。光致发光最普遍的应用为日光灯。它是灯管内气体放电产生的紫外线激发管壁上的发光粉而发出可见光的。其效率约为白炽灯的5倍。3ppt课件光致发光3ppt课件磷光是一种缓慢发光的光致冷发光现象。当某种常温物质经某种波长的入射光（通常是紫外线）照射，吸收光能后进入激发态（具有和基态不同的自旋多重度），然后缓慢地退激发并发出比入射光的的波长长的出射光，而且与荧光过程不同，当入射光停止后，发光现象持续存在。发出磷光的退激发过程是被量子力学的跃迁选择规则禁戒的，因此这个过程很缓慢。4ppt课件磷光是一种缓慢发光的光致冷发光现象。当某种常温物质经某种波长分子荧光光谱法的特点①灵敏度高

荧光分析是由试样溶液所发生的荧光的强度来测定试样溶液中荧光物质的含量。荧光分析的灵敏度不仅与溶液的浓度有关，而且与紫外光照射强度及荧光分光光度计的灵敏度有关．因此荧光分析的灵敏度高于一般的分光光度法．最低检出限比分光光度法低一个数量级以上，适合于痕量物质的检测。5ppt课件5ppt课件②选择性好。凡是会发生荧光的物质首先必须会吸收一定频率的光，但会吸收光的物质却不—定会产生荧光。对于某一给定波长的激发光，产生荧光的物质发出的荧光波长也不相同，只要控制荧光分光光度计中激发光和荧光单色器的波长便可得到选择性良好的方法．③能够引起荧光的化学物质较少，应用范围小。大多数物质本身不会产生荧光，一些物质在加入某种试剂后能够产生荧光。6ppt课件②选择性好。6ppt课件分子荧光产生机理

7ppt课件分子荧光产生机理7ppt课件

荧光光谱是物质分子吸收紫外光后产生的分子发射光谱。2.跃迁类型分子中原子的电子能级跃迁，伴随振动能级的跃迁。1.光谱类型8ppt课件荧光光谱是物质分子吸收紫外光后产生的分子发射光谱。13.分子的激发与失活（1）分子的激发基态→激发态(S1、S2、激发态振动能级)：吸收特定频率的辐射，跃迁一次到位。激发态→基态：多种途径和方式，速度最快、激发态寿命最短的占优势。9ppt课件3.分子的激发与失活9ppt课件单重态：一个分子中所有电子自旋都配对的电子状态。三重态：有两个电子的自旋不配对而平行的状态。激发三重态能量较激发单重态低。

10ppt课件单重态：一个分子中所有电子自旋都配对的电子状态。10ppt大多数有机物分子含有偶数电子，这些电子成对且自旋方向相反地存在于各个原子或分子轨道上。所以大多数分子在基态时处于单重态。当分子受光照射时，若光子能量恰好等于分子的某两个能级的能量之差，则分子吸收光子并从基态跃迁到第一激发态或更高的激发态中的某个振动能级。但其自旋方向不会立刻改变，分子仍处于单重态。持续一段时间后，激发态电子的自旋可能倒转，生成三重态。11ppt课件大多数有机物分子含有偶数电子，这些电子成对且自旋方向相反地存单重态能级间的跃迁符合光谱选律，跃迁概率大。分子通过吸收辐射而直接被激发到三重态的跃迁是禁阻的，概率很小。12ppt课件单重态能级间的跃迁符合光谱选律，跃迁概率大。分子通过吸收辐射（2）激发态分子的失活:

激发态分子不稳定，以辐射或无辐射跃迁的

方式回到基态。

（3）跃迁的方式：13ppt课件（2）激发态分子的失活:

激发态分子不稳定振动弛豫：由于分子间的碰撞，激发态分子由同一电子能级中的较高振动能级转至较低振动能级的过程，其效率较高。

激发态分子常常首先发生振动驰豫。内转换：相同多重态的两个电子能级间，电子由高能级回到低能级的分子内过程。

①无辐射跃迁

14ppt课件振动弛豫：①无辐射跃迁14ppt课件系间窜越：激发态分子的电子自旋发生倒转而使分子的多重态发生变化的过程。含有重原子的分子中（如I、Br等），系间窜跃最常见。

外转换：激发态分子与溶剂或其他溶质相互作用和能量转换而使荧光（或磷光）减弱甚至消失的过程。荧光强度的减弱或消失，称为荧光熄灭或猝灭。

15ppt课件系间窜越：15ppt课件②辐射跃迁荧光：受光激发的分子经振动驰豫、内转换、振动驰豫到达第一电子激发单重态的最低振动能级，以辐射的形式失活回到基态，发出荧光。

由于无辐射使分子吸收的能量有部分损失，因此荧光的能量比吸收的能量小，即荧光波长一般比激发光波长长。16ppt课件②辐射跃迁16ppt课件磷光：若第一激发单重态的分子通过系间窜跃到达第一激发三重态，再通过振动驰豫转至该激发的最低振动能级，然后以辐射的形式回到基态，发出的光线称为磷光。由于激发三重态能量较激发单重态低，所以磷光的波长比荧光的波长稍长。磷光仅在很低的温度或黏性介质中才能观测到。因此磷光很少应用于分析。17ppt课件磷光：17ppt课件l2l1l

3l

2S1T1系间跨越内转换振动弛豫S2S0能量T2内转换发射荧光发射磷光外转换振动弛豫18ppt课件l2l1l3l2S1T1系间跨越内转换振动弛豫S24.荧光产生的过程：（1）处于基态最低振动能级的荧光物质分子受到紫外线的照射，吸收了和它所具有的特征频率相一致的光线，跃迁到第一电子激发态的各个振动能级；（2）被激发到第一电子激发态的各个振动能级的分子通过无辐射跃迁降落到第一电子激发态的最低振动能级；（3）降落到第一电子激发态的最低振动能级的分子继续降落到基态的各个不同振动能级，同时发射出相应的光量子，这就是荧光：（4）到达基态的各个不同振动能级的分子再通过无辐射跃迁最后回到基态的最低振动能级．19ppt课件4.荧光产生的过程：19ppt课件5.分子产生荧光必须具备的条件（1）具有合适的结构。只有少数具有某些结构特性的体系才会产生荧光现象。（2）具有一定的荧光量子产率。

20ppt课件5.分子产生荧光必须具备的条件20ppt课件（1）荧光与结构的关系

电子跃迁类型

*→的荧光效率高，系间窜跃至三重态的的速率常数较小，有利于荧光的产生。共轭效应含有*→跃迁能级的芳香族化合物的荧光最常见且最强。具有较大共轭体系或脂环羰基结构的脂肪族化合物也可能产生荧光。21ppt课件（1）荧光与结构的关系电子跃迁类型21ppt课件取代基效应：苯环上有吸电子基常常会妨碍荧光的产生；而给电子基会使荧光增强。

22ppt课件取代基效应：苯环上有吸电子基常常会妨碍荧光的产生；而给电子基平面刚性结构效应

可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有。23ppt课件平面刚性结构效应23ppt课件（2）荧光量子产率Φ

物质分子发射荧光的能力用荧光量子产率（Φ）表示：Φ与失活过程的速率常数k有关：凡是使荧光速率常数kf增大而使其他失活过程（系间窜越、外转换、内转换）的速率常数减小的因素（环境因素和结构因素）都可使荧光增强。24ppt课件（2）荧光量子产率Φ

物质分子发射荧光的能力用荧光量子产率6.荧光强度与浓度的关系荧光是物质吸收光子之后发出的辐射，荧光强度（F）与①荧光物质的吸光程度及其②发射荧光的能力有关：

F=K′（I0—I）

I0

—入射光辐射强度；I

—透射光辐射强度；

K′—取决于荧光量子产率（Ф）。25ppt课件6.荧光强度与浓度的关系25ppt课件Lambert-Beer定律：=26ppt课件Lambert-Beer定律：=26ppt课件

溶液浓度较低时：

当入射光的λ1和

I0一定时：

F=Kc

即：

在低浓度时，溶液的荧光强度与荧光物质的浓度成正比。

————这是荧光法定量的基础。

27ppt课件溶液浓度较低时：27ppt课件7.影响荧光强度的因素（1）内部因素自猝灭——发光物质分子间碰撞而发生的能量无辐射转移。自猝灭随溶液浓度的增加而增加。自吸收——荧光化合物的发射光谱的波长与其吸收光谱的波长重叠，溶液内部激发态分子所发射的荧光在通过外部溶液时被同类分子吸收，从而使荧光被减弱。荧光强度F与光源的辐射强度I0有关，因此增大光源辐射功率I0可提高荧光测定的灵敏度。紫外-可见分光光度法无法通过改变入射光强度来提高灵敏度。28ppt课件7.影响荧光强度的因素28ppt课件（2）环境因素

①温度

温度对荧光的影响很大。

温度降低会减少碰撞和非辐射失活的概率，因此会增加荧光强度。例如：荧光素的乙醇溶液在0℃以下每降低10℃，荧光产率增加3%，当温度降低至-80℃时，荧光产率为100%。

29ppt课件（2）环境因素①温度29ppt课件②pH值

含有酸性或碱性取代基的芳香化合物的荧光与pH有关。pH的变化影响了荧光基团的电荷状态，从而使其荧光发生变化。30ppt课件②pH值

含有酸性或碱性取代基的芳香化合物的荧光与p③溶剂

溶剂极性增加，有时会使荧光强度增加，荧光波长红移。若溶剂和荧光物质形成氢键或使荧光物质电离状态改变，会使荧光强度、荧光波长改变。含重原子的溶剂（碘乙烷、四溴化碳）使荧光减弱，磷光增强。④溶解氧

往往使荧光强度降低。31ppt课件③溶剂31ppt课件Ⅲ、荧光分析仪32ppt课件Ⅲ、荧光分析仪32ppt课件测量荧光的仪器主要由四个部分组成：激发光源、样品池、双单色器系统、检测器。I0IF33ppt课件测量荧光的仪器主要由四个部分组成：I0IF33ppt课件光源：最常用的是高压汞蒸气灯。发出的是较强的线状谱，其中365，398，436，546，579，690，734nm谱线较强。大多数荧光化合物都可以在一定波长范围内用不同波长的光诱发荧光，因此通常至少有一条汞线是适用的。高压氙灯发出的光线强度大，而且是连续光谱，克服了汞蒸气灯射线数目少、强度差别大的缺点。但氙弧灯热效应大，稳定性较差。高功率连续可调激光光源是一种新型荧光激发光源。激光的单色性好、强度大。激光光源近年来应用日益普遍。钨灯和氢灯发出的紫外光强度太小，在荧光中应用不多。34ppt课件光源：34ppt课件单色器：第一单色器——选择激发光波长λ1

（＞250nm的紫外光），称为激发单色器。第二单色器——选择(测量)发射光（荧光）波长λ2，与激发光入射方向垂直，称为荧光单色器。样品池：采用低荧光材料，通常为石英池。检测器：光电倍增管。35ppt课件单色器：35ppt课件Ⅳ、荧光法的应用36ppt课件Ⅳ、荧光法的应用36ppt课件荧光法灵敏度高、选择性好，可用于痕量分析，但是能产生荧光的物质较少，使其应用范围较小。37ppt课件荧光法灵敏度高、选择性好，可用于痕量分析，但是能产生荧光的物1.荧光激发光谱和荧光发射光谱

任何荧光化合物都具有两种特征光谱：（1）荧光（发射）光谱：固定激发光的波长，测量不同荧光波长处荧光的强度，得到荧光光谱，即荧光强度—荧光波长图。

（2）荧光激发光谱（荧光物质的吸收光谱）：在荧光最强的波长处测量随激发光波长的改变而变化的荧光强度，得到荧光激发光谱。即荧光强度-激发光波长图。

38ppt课件1.荧光激发光谱和荧光发射光谱38ppt课件200250300350400450500nm荧光激发光谱荧光光谱蒽的激发光谱和荧光光谱荧光强度

激发光波长

荧光波长39ppt课件200250300350400450500nm荧光激发光谱荧40ppt课件40ppt课件2.激发光谱与发射光谱的关系（1）镜像规则荧光光谱的形状与基态中振动能级的分布有关，而激发光谱的形状反映了第一激发态单重态中的振动能级的分布。一般情况下，基态和第一激发单重态中的振动能级分布是相似的，通常荧光光谱与激发光谱大致呈镜像对称。41ppt课件2.激发光谱与发射光谱的关系（1）镜像规则41ppt课件42ppt课件42ppt课件（2）Stokes位移

Stokes位移是指激发光谱与荧光光谱之间的波长差值。

荧光的波长总是大于激发光的波长。这是由于发射荧光之前的振动驰豫和内转换过程损失了一定的能量。43ppt课件（2）Stokes位移43ppt课件（3）荧光光谱的形状与激发光波长无关电子跃迁到不同激发态，吸收不同波长的能量，产生不同的吸收带，但荧光均是激发态电子回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态而产生的，这与荧光物质分子被激发至哪一能级无关。因此，荧光光谱的形状和激发光的波长λ1无关。44ppt课件（3）荧光光谱的形状与激发光波长无关44ppt课件关于激发光的波长λ1：①决定荧光物质是否能够产生吸收并发射出荧光；②能够使荧光物质产生吸收并发射出荧光的激发光的波长并不具有唯一性；③在保证激发的前提下，不同激发波长处的荧光发射光谱相同，但荧光强度不同。④在进行荧光测定时，须选择激发光波长以保证荧光强度最大。45ppt课件45ppt课件3.激发光波长λ1

和λ2的选择：（1）首先，在紫外光区内，固定激发光波长（可以任意选择几个）对荧光物质进行荧光发射光谱的扫描，从而确定产生最大的荧光强度时的荧光波长λ2；（2）固定荧光波长λ2，对荧光物质进行激发光谱的扫描，确定最佳的激发光波长λ1

。46ppt课件3.激发光波长λ1和λ2的选择：46ppt课件4.定量方法①标准曲线法：配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制标准曲线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强度，在标准曲线上求出浓度。②比较法：在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，再进行比较。47ppt课件4.定量方法①标准曲线法：47ppt课件3.无机物的荧光分析无机物能够直接产生荧光并用于测定的很少。可通过与荧光试剂作用生成荧光配合物、或通过催化或猝灭荧光反应进行荧光分析。非过渡金属离子的荧光配合物较多。可用于荧光分析的元素已近70种。荧光试剂是具有两个或以上与MZ+形成螯合物的电子给予体官能团的芳香结构。OHNSO3NaN=NOHHOON8-羟基喹啉石榴茜素R48ppt课件3.无机物的荧光分析OHNSO3NaN=NOHHOON无机化合物的分析：铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法；氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定；铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定；铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定；铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定。49ppt课件无机化合物的分析：49ppt课件4.有机物的荧光分析荧光法在有机化合物中应用较广。芳香化合物多能发生荧光。脂肪族化合物往往与荧光试剂作用后才可产生荧光。CH2N2N(CH3)2SO2Cl50ppt课件4.有机物的荧光分析CH2N2N(CH3)2SO2Cl50p

51ppt课件

51ppt课件52ppt课件52ppt课件

分子荧光光谱法

MolecularFluorescenceSpectroscopy

53ppt课件分子荧光光谱法

MolecularFluoresce荧光是指一种光致发光的冷发光现象。当某种常温物质经某种波长的入射光（通常是紫外线）照射，吸收光能后进入激发态，并且立即退激发并发出比入射光的的波长长的出射光（通常波长在可见光波段）；而且一旦停止入射光，发光现象也随之立即消失。具有这种性质的出射光就被称之为荧光。

54ppt课件荧光是指一种光致发光的冷发光现象。当某种常温物质经某种波长的光致发光

物体依赖外界光源进行照射，从而获得能量，产生激发导至发光的现象。它大致经过吸收、能量传递及光发射三个主要阶段，光的吸收及发射都发生于能级之间的跃迁，都经过激发态。而能量传递则是由于激发态的运动。紫外辐射、可见光及红外辐射均可引起光致发光。如磷光与荧光。光致发光最普遍的应用为日光灯。它是灯管内气体放电产生的紫外线激发管壁上的发光粉而发出可见光的。其效率约为白炽灯的5倍。55ppt课件光致发光3ppt课件磷光是一种缓慢发光的光致冷发光现象。当某种常温物质经某种波长的入射光（通常是紫外线）照射，吸收光能后进入激发态（具有和基态不同的自旋多重度），然后缓慢地退激发并发出比入射光的的波长长的出射光，而且与荧光过程不同，当入射光停止后，发光现象持续存在。发出磷光的退激发过程是被量子力学的跃迁选择规则禁戒的，因此这个过程很缓慢。56ppt课件磷光是一种缓慢发光的光致冷发光现象。当某种常温物质经某种波长分子荧光光谱法的特点①灵敏度高

荧光分析是由试样溶液所发生的荧光的强度来测定试样溶液中荧光物质的含量。荧光分析的灵敏度不仅与溶液的浓度有关，而且与紫外光照射强度及荧光分光光度计的灵敏度有关．因此荧光分析的灵敏度高于一般的分光光度法．最低检出限比分光光度法低一个数量级以上，适合于痕量物质的检测。57ppt课件5ppt课件②选择性好。凡是会发生荧光的物质首先必须会吸收一定频率的光，但会吸收光的物质却不—定会产生荧光。对于某一给定波长的激发光，产生荧光的物质发出的荧光波长也不相同，只要控制荧光分光光度计中激发光和荧光单色器的波长便可得到选择性良好的方法．③能够引起荧光的化学物质较少，应用范围小。大多数物质本身不会产生荧光，一些物质在加入某种试剂后能够产生荧光。58ppt课件②选择性好。6ppt课件分子荧光产生机理

59ppt课件分子荧光产生机理7ppt课件

荧光光谱是物质分子吸收紫外光后产生的分子发射光谱。2.跃迁类型分子中原子的电子能级跃迁，伴随振动能级的跃迁。1.光谱类型60ppt课件荧光光谱是物质分子吸收紫外光后产生的分子发射光谱。13.分子的激发与失活（1）分子的激发基态→激发态(S1、S2、激发态振动能级)：吸收特定频率的辐射，跃迁一次到位。激发态→基态：多种途径和方式，速度最快、激发态寿命最短的占优势。61ppt课件3.分子的激发与失活9ppt课件单重态：一个分子中所有电子自旋都配对的电子状态。三重态：有两个电子的自旋不配对而平行的状态。激发三重态能量较激发单重态低。

62ppt课件单重态：一个分子中所有电子自旋都配对的电子状态。10ppt大多数有机物分子含有偶数电子，这些电子成对且自旋方向相反地存在于各个原子或分子轨道上。所以大多数分子在基态时处于单重态。当分子受光照射时，若光子能量恰好等于分子的某两个能级的能量之差，则分子吸收光子并从基态跃迁到第一激发态或更高的激发态中的某个振动能级。但其自旋方向不会立刻改变，分子仍处于单重态。持续一段时间后，激发态电子的自旋可能倒转，生成三重态。63ppt课件大多数有机物分子含有偶数电子，这些电子成对且自旋方向相反地存单重态能级间的跃迁符合光谱选律，跃迁概率大。分子通过吸收辐射而直接被激发到三重态的跃迁是禁阻的，概率很小。64ppt课件单重态能级间的跃迁符合光谱选律，跃迁概率大。分子通过吸收辐射（2）激发态分子的失活:

激发态分子不稳定，以辐射或无辐射跃迁的

方式回到基态。

（3）跃迁的方式：65ppt课件（2）激发态分子的失活:

激发态分子不稳定振动弛豫：由于分子间的碰撞，激发态分子由同一电子能级中的较高振动能级转至较低振动能级的过程，其效率较高。

激发态分子常常首先发生振动驰豫。内转换：相同多重态的两个电子能级间，电子由高能级回到低能级的分子内过程。

①无辐射跃迁

66ppt课件振动弛豫：①无辐射跃迁14ppt课件系间窜越：激发态分子的电子自旋发生倒转而使分子的多重态发生变化的过程。含有重原子的分子中（如I、Br等），系间窜跃最常见。

外转换：激发态分子与溶剂或其他溶质相互作用和能量转换而使荧光（或磷光）减弱甚至消失的过程。荧光强度的减弱或消失，称为荧光熄灭或猝灭。

67ppt课件系间窜越：15ppt课件②辐射跃迁荧光：受光激发的分子经振动驰豫、内转换、振动驰豫到达第一电子激发单重态的最低振动能级，以辐射的形式失活回到基态，发出荧光。

由于无辐射使分子吸收的能量有部分损失，因此荧光的能量比吸收的能量小，即荧光波长一般比激发光波长长。68ppt课件②辐射跃迁16ppt课件磷光：若第一激发单重态的分子通过系间窜跃到达第一激发三重态，再通过振动驰豫转至该激发的最低振动能级，然后以辐射的形式回到基态，发出的光线称为磷光。由于激发三重态能量较激发单重态低，所以磷光的波长比荧光的波长稍长。磷光仅在很低的温度或黏性介质中才能观测到。因此磷光很少应用于分析。69ppt课件磷光：17ppt课件l2l1l

3l

2S1T1系间跨越内转换振动弛豫S2S0能量T2内转换发射荧光发射磷光外转换振动弛豫70ppt课件l2l1l3l2S1T1系间跨越内转换振动弛豫S24.荧光产生的过程：（1）处于基态最低振动能级的荧光物质分子受到紫外线的照射，吸收了和它所具有的特征频率相一致的光线，跃迁到第一电子激发态的各个振动能级；（2）被激发到第一电子激发态的各个振动能级的分子通过无辐射跃迁降落到第一电子激发态的最低振动能级；（3）降落到第一电子激发态的最低振动能级的分子继续降落到基态的各个不同振动能级，同时发射出相应的光量子，这就是荧光：（4）到达基态的各个不同振动能级的分子再通过无辐射跃迁最后回到基态的最低振动能级．71ppt课件4.荧光产生的过程：19ppt课件5.分子产生荧光必须具备的条件（1）具有合适的结构。只有少数具有某些结构特性的体系才会产生荧光现象。（2）具有一定的荧光量子产率。

72ppt课件5.分子产生荧光必须具备的条件20ppt课件（1）荧光与结构的关系

电子跃迁类型

*→的荧光效率高，系间窜跃至三重态的的速率常数较小，有利于荧光的产生。共轭效应含有*→跃迁能级的芳香族化合物的荧光最常见且最强。具有较大共轭体系或脂环羰基结构的脂肪族化合物也可能产生荧光。73ppt课件（1）荧光与结构的关系电子跃迁类型21ppt课件取代基效应：苯环上有吸电子基常常会妨碍荧光的产生；而给电子基会使荧光增强。

74ppt课件取代基效应：苯环上有吸电子基常常会妨碍荧光的产生；而给电子基平面刚性结构效应

可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有。75ppt课件平面刚性结构效应23ppt课件（2）荧光量子产率Φ

物质分子发射荧光的能力用荧光量子产率（Φ）表示：Φ与失活过程的速率常数k有关：凡是使荧光速率常数kf增大而使其他失活过程（系间窜越、外转换、内转换）的速率常数减小的因素（环境因素和结构因素）都可使荧光增强。76ppt课件（2）荧光量子产率Φ

物质分子发射荧光的能力用荧光量子产率6.荧光强度与浓度的关系荧光是物质吸收光子之后发出的辐射，荧光强度（F）与①荧光物质的吸光程度及其②发射荧光的能力有关：

F=K′（I0—I）

I0

—入射光辐射强度；I

—透射光辐射强度；

K′—取决于荧光量子产率（Ф）。77ppt课件6.荧光强度与浓度的关系25ppt课件Lambert-Beer定律：=78ppt课件Lambert-Beer定律：=26ppt课件

溶液浓度较低时：

当入射光的λ1和

I0一定时：

F=Kc

即：

在低浓度时，溶液的荧光强度与荧光物质的浓度成正比。

————这是荧光法定量的基础。

79ppt课件溶液浓度较低时：27ppt课件7.影响荧光强度的因素（1）内部因素自猝灭——发光物质分子间碰撞而发生的能量无辐射转移。自猝灭随溶液浓度的增加而增加。自吸收——荧光化合物的发射光谱的波长与其吸收光谱的波长重叠，溶液内部激发态分子所发射的荧光在通过外部溶液时被同类分子吸收，从而使荧光被减弱。荧光强度F与光源的辐射强度I0有关，因此增大光源辐射功率I0可提高荧光测定的灵敏度。紫外-可见分光光度法无法通过改变入射光强度来提高灵敏度。80ppt课件7.影响荧光强度的因素28ppt课件（2）环境因素

①温度

温度对荧光的影响很大。

温度降低会减少碰撞和非辐射失活的概率，因此会增加荧光强度。例如：荧光素的乙醇溶液在0℃以下每降低10℃，荧光产率增加3%，当温度降低至-80℃时，荧光产率为100%。

81ppt课件（2）环境因素①温度29ppt课件②pH值

含有酸性或碱性取代基的芳香化合物的荧光与pH有关。pH的变化影响了荧光基团的电荷状态，从而使其荧光发生变化。82ppt课件②pH值

含有酸性或碱性取代基的芳香化合物的荧光与p③溶剂

溶剂极性增加，有时会使荧光强度增加，荧光波长红移。若溶剂和荧光物质形成氢键或使荧光物质电离状态改变，会使荧光强度、荧光波长改变。含重原子的溶剂（碘乙烷、四溴化碳）使荧光减弱，磷光增强。④溶解氧

往往使荧光强度降低。83ppt课件③溶剂31ppt课件Ⅲ、荧光分析仪84ppt课件Ⅲ、荧光分析仪32ppt课件测量荧光的仪器主要由四个部分组成：激发光源、样品池、双单色器系统、检测器。I0IF85ppt课件测量荧光的仪器主要由四个部分组成：I0IF33ppt课件光源：最常用的是高压汞蒸气灯。发出的是较强的线状谱，其中365，398，436，546，579，690，734nm谱线较强。大多数荧光化合物都可以在一定波长范围内用不同波长的光诱发荧光，因此通常至少有一条汞线是适用的。高压氙灯发出的光线强度大，而且是连续光谱，克服了汞蒸气灯射线数目少、强度差别大的缺点。但氙弧灯热效应大，稳定性较差。高功率连续可调激光光源是一种新型荧光激发光源。激光的单色性好、强度大。激光光源近年来应用日益普遍。钨灯和氢灯发出的紫外光强度太小，在荧光中应用不多。86ppt课件光源：34ppt课件单色器：第一单色器——选择激发光波长λ1

（＞250nm的紫外光），称为激发单色器。第二单色器——选择(测量)发射光（荧光）波长λ2，与激发光入射方向垂直，称为荧光单色器。样品池：采用低荧光材料，通常为石英池。检测器：光电倍增管。87ppt课件单色器：35ppt课件Ⅳ、荧光法的应用88ppt课件Ⅳ、荧光法的应用36ppt课件荧光法灵敏度高、选择性好，可用于痕量分析，但是能产生荧光的物质较少，使其应用范围较小。89ppt课件荧光法灵敏度高、选择性好，可用于痕量分析，但是能产生荧光的物1.荧光激发光谱和荧光发射光谱

任何荧光化合物都具有两种特征光谱：（1）荧光（发射）光谱：固定激发光的波长，测量不同荧光波长处荧光的强度，得到荧光光谱，即荧光强度—荧光波长图。

（2）荧光激发光谱（荧光物质的吸收光谱）：在荧光最强的波长处测量随激发光波长的改变而变化的荧光强度，得到荧光激发光谱。即荧光强度-激发光波长图。

90ppt课件1.荧光激发光谱和荧光发射光谱38ppt课件200250300350400450500nm荧光激发光谱荧光光谱蒽的激发光谱和荧光光谱荧光强度

激发光波长

荧光波长91ppt课件200250300350400450500nm荧光激发光谱荧92ppt课件40ppt课件2.激发光谱与发射光谱的关系（1）镜像规则荧光光谱的形状与基态中振动能级的分布有关，而