DB1693-2018青海藏羊胚胎玻璃化冷冻制作规程

ICS 65.020.30B43备案：60857-2018 DB63B43青 海 省 地 方 标 准DB63/T1693—2018青海藏羊胚胎玻璃化冷冻制作规程2018-09-25发布 2018-12-01实施青海省质量技术监督局 发布DB63/T1693DB63/T1693—2018II前 言本规程按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由青海省农牧厅提出并归口。本标准起草单位：青海省家畜改良中心。DB63/T1693DB63/T1693—2018PAGEPAGE9青海藏羊胚胎玻璃化冷冻制作规程范围本规程适用于青海省高原型、ft谷型、欧拉型藏羊冷冻胚胎制作。GB/T5458液氮生物容器NY/T1674胚胎质量检测技术规程DB63/T039青海藏羊DB63/T547.1青海藏羊饲养管理技术规范下列术语和定义适用于本文件。3.1供体羊提供胚胎的羊个体。3.2超数排卵利用生殖激素提高供体羊同期卵泡发育数量和卵子数量的技术。3.3冲胚配种后第7d，用冲卵管等装置，把供体母羊子宫内的胚胎冲洗出来的过程。3.4检胚对胚胎进行清洗、质量鉴定和分级的过程。3.5超低温保存胚胎放置在液氮中长期保存。3.6体型外貌评价、生长发育等指标符合DB63/T039要求，具有种用价值，体质健康无疫病。DB63/T547.1A体型外貌评价、生长发育等指标符合DB63/T039要求，生殖机能正常，体质健康无疫病。DB63/T547.1供体羊超数排卵开始处理时间，应在诱导发情的第9d进行。促排号。）09d12h（FSH），46（FSH）（PG）0.2mg，7（FSH）时取出阴道栓。剂量:根据促卵泡素（FSH）药用剂量，依据供体母羊体重增减。在第12d8h~12h1μg和维生素ADE3ml配种后的第7d从子宫回收胚胎。胚胎采集要在专门的手术室内进行，手术室要求洁净明亮，光线充足，面积宜大于15m2以便于操作。配备照明用电,室内温度保持在20℃~25℃，手术前用紫外灯照射1h~2h。供体羊手术前停食12h，供给适量饮水。术者剪短指甲，用指刷、肥皂水清洁，并进行消毒，术者需穿清洁手术服，戴工作帽和口罩。液氮罐、手术保定架、恒温水浴锅、高压消毒锅、超声波洗涤仪、1000ml容量瓶、超纯水器、电热鼓风干燥箱、体视镜、羊用二通式冲卵管、滞留针、集卵杯、手术器械、创伤巾。药品0.9。含犊牛血清的杜氏磷酸盐缓冲液。杜氏磷酸盐缓冲液（PBS）配制方法见附录A。供体羊仰放在手术保定架上，四肢固定，通过肌肉注射药物进行全身麻醉处理。275避开血管，在手术部位纵向切开5cm~8cm长的切口，切口方向与组织走向尽量一致，肌肉切开采用钝性分离。冲胚3037℃灭菌生理盐水冲去镜检胚胎的鉴定和分级按照NY/T1674进行。A、B级胚胎可用于进行冷冻。胚胎冷冻前，要在杜氏磷酸盐缓冲液（PBS液）中冲洗10次。冷冻溶液具体配制方法见附录B。10EG5min0.25ml25s（0.25ml）。(openpulled65straw，OPS)法0.25ml229.5cmOPS0.8mm~10.08mm。2537OPS10EG中平衡30s25s（0.25溶1。41 2 3 2 1说明：1—栓；—0.5mol/l图1玻璃化冷冻保存胚胎细管（0.25ml）溶液配置顺序标记OPS1。贮存将标记后的胚胎细管存放在液氮生物容器中。液氮生物容器符合GB/T5458。解冻25102510s，待0.5mol/l0.5mol/l5min，PBS液洗(openpulled65straw，OPS解冻在25℃室温下，将冷冻的OPS管由液氮中取出后直接浸入含有0.5mol/l蔗糖液的表面皿中解冻，然后将回收的胚胎移入新鲜的0.5mol/l蔗糖液中平衡5min，以脱出抗冻保护剂，最后用PBS洗净胚胎。附录A（资料性附录）杜氏磷酸盐缓冲液（PBS）配方表A.1给出了杜氏磷酸盐缓冲液（PBS）配方。A、B原粉配方见表A.1，将A、B原粉分别用灭菌双蒸水冲洗入容量瓶定容至1000ml，并加入犊牛灭活血清10ml，充分混匀待用。表A.1杜氏磷酸盐缓冲液（PBS）配方试剂名称浓 度A原粉NaCl8.0g/lKCl0.20g/lCaCl20.10g/lMgCl26H2O0.20g/lB原粉Na2HPO47H2O2.16g/lKH2PO40.20g/l附录B（）选用精密度容量瓶，严格按照溶液配制方法进行操作：10EG（）＝EG1ml＋DPBS9ml；FSFicoll（70000)1.5g＋DPBS（不含BSAFCS）3.51ml加Sucrose（）0.85610.5mgBSA（5ml，）；70000)3.0BSA或Sucrose（）1.71221mg10）；EFS35（）：EG3.5ml＋FS6.5ml，即为EFS35。0.5ml/lScrs8.75g0m34.。附录C（资料性附录）青海藏羊胚胎冷冻记录表表C.1给出了青海藏羊胚胎冷冻记录表。表C.1青海藏羊胚胎冷冻记录表品种