学习小礼包-3实验相关

Westernblot实验步骤与注意事项by妍儿&逛吃逛吃逛 WBprotocol&注意事项by七 WB测组织和细胞的蛋白表达量by威 蛋白提取相关知识介绍by 膜蛋白提取介绍by BCA蛋白浓度检测（碧云天P0012为例）by常春 半干转与湿转对比by刘 WB实验细节by雷 问题条带的心得体会by WesternBlot常见问题及对策byWBtrouble byo&慧 做好WesternBlotting，你需要知道的那些事儿by阿拉 WB数据处理与图表制作by阿波没有 WB写作by巧巧、梁鸾&Westernblot实验步骤与注意事项 by妍儿&逛吃逛吃逛吃对分别用RIPA或LaemmliSampleBuffer液提取的蛋白进行Westernblot，电转缓冲液、封闭液、TBST/PBST洗膜液、抗体、预染的ProteinMarker、TBST：TBS（10×）100mL+纯水900mL+Tween205mLPBST：PBS（10×）100mL+纯水900mL+Tween205mL封闭液：脱脂奶粉/BSA（牛蛋白）5g+TBST溶解定容至100ml后4℃压缩胶一般选用5%左右的浓度，不同KDa的蛋白应选择合适浓度的分离胶 （一）SDS电玻璃板（提前完成）：一只手扣紧玻璃板，另一只手取少量洗衣粉轻轻配5%的浓缩胶，加入TEMED后立即摇匀后灌胶。将剩余空间的蛋白原液量，并将各样本蛋白原液蒸水配至相同的蛋白浓度。取1.5mL离心管，加入一定量的5×SDSloadingbuffer以及四倍体积的配好的电泳：先选择80V恒压电泳，待溴酚兰迁移至分离胶后(约)，提高电酸谈补充材料 移液器吸取1×电泳液各孔，保证无气泡盖上盖子（当只电泳一块胶时，取出另一半电泳槽内胶板夹转一张膜需准备2张10×10cm海绵、2张7.0×8.0cm的滤纸和1张7.5×8.5cm将已跑好的SDS凝胶平铺在PVDF上选择转印程序

RunTime 20Vfor1min23Vfor25Vfor

1h 检测完一个分子后，用Stripbuffer洗涤15min、再重新用TBST/PBST洗根据抗体说明书用1×iBind溶液稀释抗体，一抗二抗稀释后总体积要达吸取5mL的1×iBind在卡片中间区域再加入1mL1×iBind溶液，中间区域形成液团蛋白面朝下将PVDF膜覆盖在液团上，低分子量靠近厚端滚轮赶走PVDF膜中气泡盖上iBind盖子，打开孔盖，有1-4号孔（1）1孔中加入2mL稀释后一抗（2）2孔中加入2mL的1×iBind溶液（3）3孔中加入2mL稀释后二抗（4）4孔中加入6mL的1×iBind溶液室温最少孵育2.5小时，也可4℃过夜孵育孵育完成后，将PVDF膜置于去离子水中漂洗即可进行免疫发光检测作为催化剂够提氧促使丙酰单体聚合TMD为加速剂能够促进P氧基，加速丙烯酰胺单体的聚合。空气温度较低时TMD使用Bio-Rad或者碧云天的产建议两边加入预染的ProteinMarker，方便观察不同KDa蛋白的分离情况，也方便后续的裁膜。的ProteinMarker的品牌和货号:Thermo26616、延长电转时间，最好是每次电转时都使用新的电转液。不同KDa的蛋白电转封闭常用脱脂奶粉或BSA，建议建议做磷酸化蛋白的western时使用BS（止过亮，阻碍。WBprotocol&注意事 by七WesternBlot蛋白样品一、贴壁细白样品净将干扰后续的蛋白浓度测定和westernblot检测结果。PMSF（100mM，PMSF合，可在临用前加，于冰上充解，为使细胞充解培养瓶要经常来于4℃下12000rpm离心20min以去除细胞碎片（提前开离心机预冷的细胞有时按照实验要求只能加100-200μ的裂解液，按照上述操作，直接壁细白样品的操作外还应收集培养液中的细胞。做法如下：二、悬浮细白样品酸谈补充材料 充解后，即可用将匀浆液转移至EP管中，然后在4℃下12000rpm离20min，取上清进行蛋白定量并分装，暂时不用的蛋白于-80℃保存一、玻璃使用柔软的羊毛刷和的玻璃清洁剂将PAGE胶的玻璃板充分刷洗，拿取玻璃板时要戴着干净套，并且只接触玻璃板的侧边，保持玻璃板表面的酸谈补充材料 沸了。同时在水中煮蛋白样品有下面弊端：aEP管容易炸开，样品丢失。b.慢加入样品。每个孔加样体积大致保持一致，空的孔也上同样体积的电泳跑浓缩胶时用80-100V，使样品压成一条线，跑到分离胶以后用200V跑，使不同大小的蛋白分子充分分离转一块胶需准备滤纸（多张薄滤纸或2张转膜的厚滤纸和1张膜最后转膜夹能紧紧贴住“滤纸-胶-膜-滤纸三明治”为宜转膜时电极方向注意是膜正胶负同上方法进行二抗孵育，室温下孵育1h后，用TBST在室温下脱色摇4次以上，每次5min；进行化学发光反应一般使用HRP-ECL发光法，操作，制得短一点，一般刚贴上就可以拿开。如果暗室中看不见荧光，就需要延长问题1：转预处理膜时没有完全均匀地靶蛋白等电点等于或接近转移缓冲液pH值甲醇浓度过高SDS浓度不够转移大于100KDa的蛋白时，需要在转膜液中加入适量SDS转移时间不够问题2：背景膜没有完全均匀湿透膜被污染封闭洗膜一抗孵育不当二抗孵育不当过度缩短时间另外，NC膜的背景通常比PVDF膜的背景更干净，可以选择使用NC膜问题3：没有阳性条带或条带较样本中不含目标蛋白封闭过度抗体问题酶失活HRP抑制剂干扰延长时间问题5：条带位置（大小）不对；或有非特异性条蛋白问题抗体问题问题6：背封闭液中有体HRP耦联二抗中有体问题7：膜上出现反像（暗背景上白色带HRP含量过高ECL发光液进行检测 测组织和细胞的蛋白表达 by威参考资料=abcam实验指南+CST实验指南+takara实验指南+酸谈+威少经验总结+其他实验指南精品内容=目的原理+蛋白质样品+蛋白质定量之BCA法+上样准备之蛋目的：WB是用特异性抗体对PAGE电泳的蛋白质样品进行，并通过分析的位置和深度来获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情白质样品转移到固相载体（PVDF膜orNC膜）上，固相载体以非共价键形式也可以直接倒）（若有鼻涕样的说明RIPA加的不够，还需要再加，但不可加太多）超声结束后，冰上裂解20分钟超声结束后，冰上裂解20分钟配平）(6)将离心后的上清分装转移至1.5ml离心管，取一小部分测蛋白浓度，其他进loadingbuffer采用1：4稀释成1×）。金属浴：100℃，5-10分钟室温冷却：10-20分钟三、蛋白质定量之BCA主要有BCAowry法和Bradford法三种，BCA法是主流，其他具体看说明书配置不同浓度的标准蛋白液：取10μl标准品稀释到100μl释到260μl，使最终浓度为0.5mg/ml。第二个梯度：4μl+PBS76μl，其他类提前配置好，多配一孔以防万一），每个样品3个复孔，每孔20μl，加入五、SDS电泳吸干。（威少：缓慢匀速将胶加至距上面1.5cm处，一般到第一个绿配置并加入电泳液：.将之前配好的胶固定在电泳装置上，加入1×电泳1000ml（配方各个实验区都有）后马上拔梳子，两3μl，如果两侧有空的梳孔，应该加入20μl1X的loadingbuffer，起“压边”作至分离胶时将电压调至120V90min，一般在溴酚蓝跑出胶时停止电泳，也加SDS，分子量大的话可以加入0.01-0.03%；猫大版说＜100KDa不用加补充材料 猫大版（威少补充材料 把胶放在膜上面，膜两边滤纸不能相互接触，否则短路。滤纸也有酸 补充材料 滤纸放在下面）个实验区，Tween20比较粘稠，可以先将枪头剪掉一部分，再进行吸取。防止一抗或/和二抗与膜的非特异性结合，需要进行膜的封闭）orBSA（一3.封闭：可以用TBST一下，将膜置于盛封闭液的孵育盒（可以淘宝定制(1)配置：用1%BSA（一区用TBST）液体稀释二抗（比例看说明书，种属根据（二抗作用时间必须严格控制）10min；5min；5min；猫大：5min×812次。仔细洗涤，否则显影背景高）(1)底物化学发光ECL显色：在1.5mlEP管（外包锡纸，避光放在4℃）按1:1混将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图像处理系统ImageJ分析目标带的分子量 yOne因其高昂的售价令很多人望而却步，猫大用的是Gel-Proyzer。(1)对WB 去除背景：Process|SubtractBackground 设置定量参数：yze|SetMeasurements,点击Area，MeanGray及IntegratedDensity设置单位：yze|SetScale,在“unitoflength”的方框里输入“pixels” 选择FreehandSelection，尽量把条带圈起来，点击键盘m，出来IntDen灰 数据IntDen进行分析 如果条带不正，需修正，Imagetransformrotate调节angle值，直到条带水 SecondLane（快捷键Ctrl+2），最后yzeGelPlotlanes。 （如过夜）洗膜过度：勿过度洗一抗失效：使用新鲜抗体，重复使用有效浓度会降低二抗受叠氮钠抑制：避免叠氮钠和HRP检测试剂盒过期和底物失活：使用新鲜的底抗体孵育温度过高：4℃孵育Tween20。脱脂奶粉含有酪蛋白，该蛋白本身就是一种磷酸化蛋白，会结未结合蛋白质洗涤不充分：增加洗涤次数膜的选择导致的高背景：NC膜比PVDF检测到过的新蛋白或同一蛋白中具有相似表位而结构不同的闭时间和/或温度，向封闭缓冲溶液中加入0.05%的Tween20，抗体稀释液抗体质量：尝试使用不同的抗体抗体纯化：使用亲和纯化的抗体，减少非特异条带(1转膜时膜上有气泡或抗体在膜上分布不均：转膜过程中尽量去除气泡，抗体深背景出现白色条带（非预期背景细菌污染：4°C抗体量不足：确保在振荡孵育时抗体充分浸没膜蛋白提取相关知识介 by白淀，通过高盐的细胞白抽提试剂抽提得到细胞白。利用去污剂破坏脂质双分子层，破裂细胞溶解蛋白蛋白变性使其稳抑制蛋白酶活性快速裂解，多种裂解成分经过精心优化，能快速使细胞裂以用于蛋白活性检测（信号传递研究和酶动力学检测）和WesternBlot等各还可以用于WesternBlotting。适用于培养细胞（包括悬浮细胞）和新鲜组细胞裂解成分一般使用的是表面活性剂，常用的有曲拉通X-100（TritonX-和SDS为离子型。不同裂解成分的裂解强度不同，一般来说TritonX-100和水解。蛋白酶抑制剂（proteaseinhibitor）从广义上指与蛋白酶分子活性中心上的一些基团结合，使蛋白酶下降，甚至，但不使酶蛋白变性的物质。各乙二胺四乙酸（EDTA）：DFP的抑制常数相似，可以有效抑制胰蛋白酶（trypsin）、糜蛋白酶（thrombin）等蛋白酶，作为PMSF和DFP的替代物，AEBSF的毒性更低物水解酶和氨基肽酶活性的锌金属蛋白酶），丙氨酰氨基肽酶（氨肽酶M/胃酶抑素A（PepstatinA）：天冬氨酸蛋白酶可逆抑制剂氟化钠（sodiμmfluoride）：酸性磷酸酶可逆抑制剂焦磷酸钠（sodiμmpyrophosphate）：丝氨酸/苏氨酸磷酸酶不可逆抑制剂β-甘油磷酸（β-glycerophosphate）：丝氨酸/钼酸钠（sodiμmmolybdate）：酸性磷酸酶不可逆抑制剂二水酒石酸钠（sodiμmtartratedihydrate）：酸性磷酸酶可逆抑制剂咪唑（imidazole）Tabam1%Triton1%Triton100,,0.1%1%NP-1%NP-1%NP-1%强中强取对白的取剂是是是是是是是是是是是是WB,IP,Co-WB,WB,WB,IP,WB,IP,Co-WB,四、不同样本类型的提取方法（以总蛋白为例贴壁细①倒掉培养液，将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放②每瓶细胞（一般需要5*106细胞）加预冷的PBS（0.01MpH7.2～7.3）④裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后；⑤于4℃下12000rpm离心20min。（提前开离心机预冷⑥将离心后的上清分装，于－80悬浮细微升裂解液的比例加入裂解液。再用手指轻弹以充解细胞。充解后应加药的贴壁细①将培养液倒至15ml离心管中，于2500rpm离心②弃上清，加入PBS并用枪轻轻吹打洗涤，然后2500rpm离心5min。弃上③经常弹一弹以使细胞充解④充解后，即可用移液器将裂解液移至1.5ml离心管中，然后在4℃12000rpm离心20min，取上清分装并置于－80℃保存膜蛋白提取介 by合的非常紧密，一般只有用去垢剂(detergent)使膜解后才可分离出来。相反，外周膜蛋白不磷脂双层，通常通过与脂质的极性基团和/或表面的整合以下以某一种提取膜蛋白的试剂盒（ThermoScientificMem-PERPlusMembraneProteinExtractionKit，89842）为例简介该种提取膜蛋白方法的流用3ml细胞液细胞沉淀，300g离心5分钟移除并丢弃上清液。将细胞重悬在1.5ml的细胞液中并转移到2mL的收集细胞时采用细胞刮，不应采用胰酶消化（猫大老师曾讲过）煮沸更容易导致蛋白，物不能有效进入胶中。四、使用某试剂盒提取膜蛋白进行WB实验的范例文献：范例范例BCA蛋白浓度检测（云天P0012为例） BCA法测定蛋白浓度可以兼容样品中高达5%的SDS，5%的TritonX-BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天P0012）96孔37℃恒温培养蛋白标准品：5mg/ml释为0.5mg/mlBSA（Tips：稀释后的0.5mg/mlBSA蛋白标准可以一次全BCA工作液配将试剂按下表加到96孔板第一列8个标准品孔中，反应各孔加入200μlBCA工作液，96孔板震荡30sec，37℃恒温培养箱放置30分钟。（Tips：也可以室温放置2小时。BCA法测定蛋白浓度时，颜色会一般提取的蛋白浓度应该在多少组织在1-30μg/μl，细胞低一些大概0.1-10μg/μl半干转与湿转对 by刘二、半干转与湿转操作流程对比——流程对比/图解对比/细节对比/条件设定的一湿转图半干Westernblot全程操作流程见“酸谈”WB实验细 by雷BCA定量时尽量不使用96孔板最边缘一圈（由于有些仪器边缘效应配胶时，板子一定彻底干净问题条带的心得体 by10min响结果，可以参考抗体信息及查阅文献来解决二、WB条带背景有黑点三、WB条带显影无条带（10KDa四、WB条带有边缘规则白点用袋孵一抗时，未除净气泡六、WB条带歪斜 WesternBlot常见问题及对 转膜液（transferbuffer）、TBST、电泳缓冲液（runningbuffer）或另一个原因可能是脱脂奶粉掩盖了抗原。在这种情况下使用BSA或减少使高背景通常是由于与PVDF膜结合的抗体浓度过高造成的也可能导致背景过高。建议试试不同的时间来找到最佳时间WBtrouble o&缺乏信号：染色不均匀：抗体被细菌污染可导致染色不均匀，4℃保存抗体并使用新微笑条带：可能的原因是迁移过快或电泳温度过高（改变了pH值和迁移度），应降低迁移速度或低温电泳（冷库或冰上）性条带，只有特异性条带能被封闭从而。蛋白样品有可能没有充分变性，而不是5min，使得蛋白充分做 Blotting，你需要知道的那些事 by阿拉子量蛋白质的转膜，使用孔径0.1或0.2微米的膜。PVDF结合低分子量膜的选择主要考虑3点后续是否有stripandreprobing的打裂，不适合stripandreprobing。PVDF膜结合蛋白的能力较强，质地结实，适合stripandreprobing。但疏水性强，使用前需要用甲醇激活，容易干膜。注意不要用未戴手套指接触膜，最好是用镊子。手套要带无粉的。有粉如果打算stripptingandreprobing，切记先洗去原有抗体再风干，因为风干0.5%的脱脂牛奶（溶解于0.1%Tween的PBS）最常用。脱脂奶粉的品牌酪蛋白（Casein）。常用1%的浓度，但酪蛋白干粉难溶于水进行检测。如果对照中出现条带，即说明avidin或streptavidin结合到了内源体蛋白的缓冲液中（常用0.1%BSA溶液）。否则大部分抗体会吸附于容器就洗膜液成分而言，标准的洗膜液是PBST/TBST溶液，Tween-20的浓度于0.3%时影响抗体的结合。Tritonx-100，NP-40或SDS等洗涤剂可洗掉目标蛋膜表面的流动。十、STRIPAND在同一张膜上对多种蛋白的表达进行检测显然更有效率，所用方法就是常用strip技术是2%SDS和100mM2-巯基乙醇(2-ME)或二硫代苏糖醇法有效但会导致大量的目标蛋白丢失。另法是在室温、pH=2的条件下用膜彻底及再次封闭（因为strip也会去除原有的封闭蛋白）。Strip的液浸泡30分钟，再彻底洗涤)。该反应中形成的基可使过氧化氢酶发生不可WB数据处理与图表制 by阿波没有第一部分数据处理（基于ImageJ、 用打酸谈补充材料 酸谈补充材料 酸谈补充材料 第二部分图表制作（基于Prism、 酸谈补充材料 二、WB条带截取（基于PS用PS打开WB条带图酸谈补充材料 酸谈补充材料 三、组图（基于PS用PS打开之前输出的柱状图和条带图并进行合并后输出为保持格式酸谈补充材料 WB写 by巧巧、梁鸾WesternblotWesternblotCelllysatesweremixedwith1×SDSbuffer.ProteinswereseparatedbySDS-PAGEandthentransferredontoPDVFmembranes.Afterthemembraneshadbeenprobedwithindividualantibodies,theantigen-antibodycomplexwasvisualizedbySuperSignal-enhancedchemiluminescencereagents(Millipore,USA).TheantibodyagainstLRP16(1:500dilution)wasagoatpolyclonalantibodyfromSantaCruzBiotechnology,Inc.AntibodiesofCTNNBIP1,CCND2,DKK4,TCF7,CTBP1,DKK1,FOSL1,FRAT1,andFZD5werefromCellSignalingLRP16preventshepatocellularcarcinomaprogressionthroughregulationofWnt/β-cateninsignaling WesternblottingWesternblottingwascarriedoutusingstandardtechniques.Briefly,cellswerewashedtwicewithPBSandthenlysedwithice-coldlysisbuffer.Theproteinlysatewascollectedaftercentrifugation.TheproteinconcentrationwasfiedusingaBCAassaykit(Pierce,ThermoFisherScientific,Waltham,MA,USA)accordingtothemanufacturer’sinstruction.Equaltyofproteinlysatefromeachsamplewasyzedby10%SDS,followedbyproteintransfertoPVDFmembrane(Millipore).ThemembranewasthenincubatedwithprintibodiesagainstAtg-7,Atg-5,andLC3B-IIautophagyrelated酸谈补充材料 genes(AutophagyAntibodySamplerKit#4445,CellSignalingTechnology,Danvers,MA,USA)overnightat4℃,washed,andincubatedwithappropriateperoxidaseconjugatedsecondaryantibodies.ProteinexpressionwasdetectedusingtheusingUVPimagingsystem(UVP,LLC,Upland,CA,USA).Antibodyagainstβ-actinwasusedasaloadingcontrol.4-AcetylantroquinonolBsuppressesautophagicfluxandimprovescisplatinsensitivityinhighlyaggressiveepithelialcancerthroughthePI3K/Akt/mTOR/p70S6KsignalingpathwayMingcheLiuetal.ToxicologyandAppliedPharmacology:ProteinextractionandwesternblotAfterdesignatedtreatment,cellswerewashedtwicewithice-coldPBS,andthetotalproteinconcentrationwasyzedusingthebicinchoninicacidassay(BCA;BeyotimeInstituteofBiotechnology,Beijing,China)accordingtothemanufacturer’sinstructions.Totalcellextracts(50μgtotalprotein)wereresolvedbysodiumdodecylsulfate(SDS)–10%polyacrylamidegelelectrophoresisandtransferredontopolyvinylidenedifluoride(PVDF)membranes.Nonspecificbindingwasinhibitedbyincubatingthemembraneswith8%skimmedmilkinTris-bufferedsaline(TBS)with0.5%Tween-20.Subsequently,membraneswereincubatedwithantibodiesagainstSIRT1,FOXO3a,cleaved-caspase3(Cl.CASP3),cleaved-polyADP-ribosepolymerase1(Cl.PARP1),cytochromec,P53(allfromCellSignalingTechnology,Danvers,MA,USA),p16,γ-H2A.X(bothfromAbcam,Cambridge,MA,USA),p21(SantaCruz,CA,USA),andβ-actin(ZhongshanGoldenBridgeBiotechnology,Beijing,China)overnightat4℃atanappropriatedilution(1:1000).ThemembraneswerewashedwithTBSwithTween-20(TBS-T)and酸谈补充材料 thenincubatedwithperoxidase-conjugatedAffinipuregoatanti-rabbitIgG(H+L)andanti-mouseIgG(H+L)-labeledsecondaryantibodies(ZhongshanGoldenBridgeBiotechnology,Beijing,China)dilutedat1:5000for1hour37℃.SpecificcomplexeswerevisualizedonanX-rayfilmElectroChemi-Luminescence(ECL)detectionwithBeyoECLPlus(BeyotimeInstituteofBiotechnology,Beijing,China)followingthemanufacturer’sprotocol.Alldatawereobtainedintriplicate,independentexperiments.RolesofmicroRNA-34aingSIRT1inmesenchymalstemZhangetal.StemCellResearch&Therapy(2015)6:19510.1186/s13287-WesternblotAtofreperfusion,ventricleswerefrozenandreducedtopowderusingliquidN2.Thefrozentissuepowderwashomogenizedincoldbuffercontaining(inmM):20MOPS-TrispH7.0,300sucrose,2EDTA,2EGTAandthedetergents1%NonidetP-40,1%SDSpH7.4,withproteaseinhibitors(2μg/mLleupeptin,1μg/mLpepstatinand1mMbenzamidine[Calbiochem,LaJolla,CA, inhibitor(PhosSTOPTM, Sampleswerehomogenizedusingaglasstissuegrinderandcentrifugedat1000×gfor20minat4℃.Aliquotswerestoredat-80℃forWesternblotysis.Proteinconcentrationwasdeterminedbybicinchoninicacid(BCA)assay.ProteinswereseparatedbySDS(sodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegelelectrophoresis)(8%gels)andtransferredontoPVDF(polyvinylidenedifluoride)membranes(MilliporeCorp.,Bedford,MA,USA).Membraneswereprobedwiththefollowingprimaryantibodies:anti-pAkt(S473),anti-Akttotalandanti-β-tubulin.Afterincubationwiththeappropriatesecondaryantibody,antigen–antibodyreactionwasdetectedusingECL酸谈补充材料 (Amersham,Biosciences).BlotswerefiedbydensitometricysisusingthesoftwareUN-SCAN-ITgelSilkScientific,Inc.(Orem,UT,USA)andtheresultswerenormalizedwithrespecttoβ-tubulin,aproteinthatdidnotchangeinthisI/Rmodel.Protectionofthemyocardiumagainstischemia/reperfusioninjurybyangiotensin-(1–9)throughanAT2RandAkt-dependentmechanismEvelynMendoza-Torresetal.Pharmacological二、文献中WesternBlotting图例及描述c,dWesternblot ysisshoweddose-dependentregulationofSIRT1bymiR-34aaftertransfectionwithmiR-34amimic,NCmimic,miR-34ainhibitor,orNCinhibitorfor72hours,respectively.EachcolumnrepresentsmeanSDfromthreeindependentexperiments.*P<0.05vs.control,△P<0.05vs.transfectionwith10nMmiR-34amimic.miRNAmicroRNA,NCnegativecontrol,ORFopenreadingframe,SIRT1silentinformationregulator1,UTRuntranslatedregionRolesofmicroRNA-34aingSIRT1inmesenchymalstemcells.Zhangetal.StemCellResearch&Therapy(2015)6:19510.1186/s13287-a.EnhancedLRP16expressionwasdetectedbyqRT-PCRandWesternblotLRP16preventshepatocellularcarcinomaprogressionthroughregulationofWnt/β-cateninsignaling 第一句（Westernblotting是按照标准方法进行的Westernblottingwasconductedunderstandardprocedures/performedaccordingtostandardmethodsaspreviouslydescribed.Western ysiswasperformedusingx/usingantibodiesagainst（使用的抗体也可以在稍后描述第二句（蛋白获取XcellswerelysedtoobtainproteinsusingProteinsampleswerepreparedwithRIPAlysisProteinsfromxwereextractedfollowingstandardprotocolsaccordingtothemanufacturer’sprotocol.第三句（大致实验步骤Proteinswereseparatedby8%SDS–PAGEandthentransferredtoPVDFmembrane(Bio-Rad,Hercules,CA,USA).Afterblockingin5%nonfatmilk,themembraneswereincubatedwiththefollowingprimaryantibodies:x;thenthefollowingsecondaryantibodieswereused:x.ProteinswereloadedontoSDS(10–15%)gels,separatedelectrophoretically,andtransferredtoPVDFmembranes(Millipore,USA).Afterblockingwith5%driedskimmilkfor3hatroomtemperature,themembraneswereincubatedovernightat4°Cwithpri Afterseparationbysodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegel,proteins(30μg)weretransferredtoaPVDFmembrane(Millipore,Boston,MA,USA).Afterblockingwith5%nonfatmilk,thePVDFmembranewasincubatedwithpri ntibodyinacoldroomovernight.AfterthreewasheswithTris-bufferedsalineTween(TBST)for15min,thePVDFmembranewasincubatedwithperoxidaseconjugatedsecondaryantibody.第四句（条带可视化TheimmunoreactiveproteinbandswerevisualizedbyECLTheproteinwasvisualizedwithECLdetectionTheblotsonthemembraneweredevelopedwith第五句（获取TheimageswereacquiredusingaBio-SpectrumGelImagingSystem(UVP,USA).TheresultswererecordedbyphotographingwithaKODAKImageStation(4000Pro,KODAK,Shanghai,China).第六句（数据处理TheintensityoftheproteinbandswasfiedwithImageJandnormalizedtothatofGAPDH.TheintegrateddensityoftheblotswasdeterminedbythesoftwareImageJ,andpresentedasapercentageoftheinternalcontrolβ-actin.Westernblottingwasperformedaccordingtostandardmethodsaspreviouslydescribed[x]usingantibodiesagainstx.α-Tubulin(Sigma,SaintLouis,MO,USA)wasdetectedasaloadingcontrol.Westernblotwasperformedaspreviouslydescribed[x].SeeAdditionalfilexfordetailsandantibodiesused.Westernblotysiswasperformedusingx.Tocontrolsampleloading,theblottingmembraneswerestrippedandre-probedwithananti–α-tubulinantibody(1:5000,Sigma,SaintLouis,MO,USA).NuclearextractswerepreparedusingtheNuclearExtractionKit(ActiveMotif),accordingtothemanufacturer’sinstructions.Westernblotwasconductedunderstandardprocedures[x].Briefly,cellswerelysedtoobtainproteinsusingRIPA.Proteinswereseparatedby8%SDS–PAGEandthentransferredtoPVDFmembrane(Bio-Rad,Hercules,CA,USA).Afterblockingin5%nonfatmilk,themembraneswereincubatedwiththefollowingprimaryantibodies:x;thenthefollowingsecondaryantibodieswereused:x.Allantibodiesweredilutedinnonfatdrymilk.TheimmunoreactiveproteinbandswerevisualizedbyECLKit(Pierce,ThermoFisherScientific,IL,USA).TheexperimentwasperformedthreeseparateThetotal,mitochondrial,andcytoplasmicproteinsfromxcellsandtumourtissueswereextractedfollowingstandardprotocolsaccordingtothemanufacturer’sprotocol,andtheproteinconcentrationwasdeterminedusingaBCAproteinassaykit.ProteinswereloadedontoSDS(10–15%)gels,separatedelectrophoretically,andtransferredtoPVDFmembranes(Millipore,USA).Afterblockingwith5%driedskimmilkfor3hatroomtemperature,themembraneswereincubatedovernightat4°Cwith ntibodies(listedinSupportingInformationTable).Afterincubationwithhorseradishperoxidase-conjugatedantibodiesfor2hatroomtemperature,anenhancedchemiluminescencemethodwasusedfordetection,andimageswereacquiredusingaBio-SpectrumGelImagingSystem(UVP,USA).BandswerenormalizedwithGAPDHasaninternalWesternblotwasconductedaspreviouslydescribed[x].Briefly,proteinsampleswerepreparedwithRIPAlysisbuffer(Sigma-Aldrich,Cambridge,MA,USA)withproteaseandphosphataseinhibitorcocktails(ThermoFisherScientific).Afterseparationbysodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegel,proteins(30μg)weretransferredtoaPVDFmembrane(Millipore,Boston,MA,USA).Afterblockingwith5%nonfatmilk,thePVDFmembranewasincubatedwithpri ntibodyinacoldroomovernight.AfterthreewasheswithTris-bufferedsalineTween(TBST)for15min,thePVDFmembranewasincubatedwithperoxidaseconjugatedsecondaryantibody.ThenafterthreewasheswithTBSTfor15min,theproteinwasvisualizedwithECLdetectionsolution(Millipore).Thepri werelistedasfollows:x.GAPDHwasusedasinternalcontrol.TheintensityoftheproteinbandswasfiedwithImageJandnormalizedtothatofThetotalproteinswereextractedfromthecells;theproteinlevels酸谈补充材料 fiedbytheBio-Radproteinassay.SDSwasperformedtofractiontheproteins,whichweretransferredontoaPVDFmembrane.Themembranewasblockedwith5%skimmilkfor30minatroomtemperature,incubatedwiththeprintibodies(0.5μg/ml)overnightat4°C,andfollowedbyincubationwiththesecondaryantibodies(conjugatedwithperoxidase)for1hatroomtemperature.TheblotsonthemembraneweredevelopedwithECL.TheresultswererecordedbyphotographingwithaKODAKImageStation(4000Pro,KODAK,Shanghai,China).TheintegrateddensityoftheblotswasdeterminedbythesoftwareImageJ,andpresentedasapercentageoftheinternalcontrolβ-actin.ForWBpartwriting,itincludestwoparts:Methods(Reagents,antibodies,animals,tissuecollectionandWB)&Results(showingtheWBresults:representativeblotsandfigures)InBlackisthemanuscript;InBlueistheReferncePaper:LiuSJ*,ZhengP*,WrightD,etal.Sodiumselenateretardsepileptogenesisinacquiredepilepsymodelsreversingchangesinproteinphosphatase2Aandhyperphosphorylatedtau.Brain.139(Pt7):1919-1938,MaterialandReagentsandantibodies.Antibodies&Companyname,forUS,specifictotheStateName,PlustheECLcompany(Areagentalso)TherabbitpolyclonalantibodiespS198andpS262,whichrespectivelyrecognizedphospho-tauatSer198and262,werepurchasedfromEpitomics(Burlingame,CA).ThemousemonoclonalantibodyTau-5,whichrecognizedtotaltau,waspurchasedfromBDBiosciences(SanJose,CA).酸谈补充材料 Themousemonoclonalanti-PP2AcandPR55werepurchasedfromMilliporeCorporation(Temecula,CA).Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase(GAPDH)wasusedasloadingcontrolandrecognizedbyrabbitmonoclonalanti-GAPDHbody,whichwaspurchasedfromCellSignallingtechnology(Danvers,MA).Bicinchoninicacidproteinassaykit(BCAkit)waspurchasefromPierceBiotechnologyInc.(Rockford,IL).PP2AimmnunoprecipitationphosphataseassaykitwaspurchasedfromMilliporeCorporation(Temecula,CA).EnhancedchemiluminescencedetectionkitwaspurchasedfromGEhealthcareInc.(LittleChalfont,Buckinghamshire,UK).SodiumselenatewaspurchasedfromSigma-AldrichInc.(SaintLouis,MO).Generalchemicals,suchassodiumdeoxycholate(DOC),sodiumdodecylsulphate(SDS)andIGEPALCA-630(NP-40),werepurchasedfromSigma-AldrichInc.(SaintLouis,MO).Osmoticmini-pumpswerepurchasedfromDURECTCorporation(ALZET®models2004and2006,Cupertino,CA).Experimentalanimals.(Animalspecies,housinginfo&EthicsAdultmaleWistarratswereusedinallexperiments.TheseratswereobtainedfromourbreedingcolonyintheDepartmentofMedicine(RMH),UniversityofMelbourne,individuallyhousedandmaintainedon12hlight/darkcycleswithfoodandwateravailableadlibitum.AllanimalexperimentswereapprovedbytheAnimalEthicsCommitteesofTheUniversityofMelbourne,andwereperformedinaccordingwiththeguidelinessetbytheAustralianNHMRCCodeofPracticefortheCareandUseofAnimalsforScientificPurpose.Tissuecollectionandprocessing.(Timepoints,tissuecollectionmethod,braindissectionparts,storingmethod)Twenty-fourhoursafterthelastkindlingstimulation,orafterthefinal-EEGrecordinginthepost-SEmodel,animalsweresacrificedwithalethaldoseofpentobarbital.Thebrainswererapidlyremovedandsplitintotwo3mMKCl,6mMMgCl2,1mMCaCl2,1.25mMNaH2PO4,25NaHCO3,10.6mMglucose.Thelefthemispherewasfixedwith4%paraformaldehydefor48hoursat4°C.Therighthemispherewasmicro-dissectedtoextractthreeregions:amygdala,hippocampusandcortex,whicharehighlyrelevanttokindledseizures.Theblocksoftissuewererapidlyfrozeninliquidnitrogenandat-80°C.Westernblotting.(Homogenizationmethod,proteinextractsmethod:RIPAmostly,proteinficationwithBCAorLowell,Gelmakingprocedureconcentration,%!isimportant,membranestype,transfermethod,blottingantibodies1stand2nd,exposuremethodandloadingcontrol)ThefrozentissuesweregroundondryiceanddissolvedinRIPAbuffer(50mMTris(pH7.4),150mMNaCl,0.1%sodiumdodecylsulphate(SDS),0.5%sodiumdeoxycholateand1%NP-40)withproteaseinhibitorscocktailandphosphataseinhibitorscocktail.Thebrainextractswillbecentrifugedat12,000×gfor15minutesat4°CandthesupernatantwasusedforWesternblotting.AftertheproteinconcentrationofsupernatantwasdeterminedwithBCAkit,thesupernatantwasmixedwithin5:1(v/v)ratiowithsamplebuffercontaining300mMTris-HCl(pH6.8),300mMdithiothreitol,12%SDS,0.6%bromophenolblue,and60%glycerol,boiledfor10minat95°C,thencentrifugedat12,000×gfor10min,andthesupernatantwasstoredat-80°CforWesternblottingysis.WeseparatedthetissueproteinswithSDS-polyacrylamidegelelectrophoresis(SDS),andelectro-blottedthebandsofproteinsontopolyvinyldifluoride(PVDF)membranes.Next,wedevelopedtheblotsonPVDFmembraneswithPS396(1:10,000),PS198(1:2000)andpS262(1:1000),respectively.Then,thesemembraneswerestrippedandreprobedforTau-5(1:1,000)andthenGAPDH.TomeasuretheexpressionofPP2A,werantheotherWesternblotting,whichareseparatedfromtauWesternblotting.WefistblottedthePVDFmembraneswithanti-PR55(1:1,000)andthenanti-PP2Ac(1:1,000)afterstripped.Thesemembraneswerestrippedagainandreblottedbyanti-GAPDH(1:10,000).Allproteinblotswerevisualizedbyenhancedchemiluminescentsubstratekitandexposuretox-fi.TheseblotswerescannedandthemeanintensityoftheblotswasfiedusingNIHImageJsoftware(Abramoffetal.,2004).Theratioofimmunoreactivity(IR)associatedwithphospho-tau(pS198andpS262)tototaltau(Tau-5)andotherproteinstoloadingcontrol(GAPDH)wascalculatedandtheresultswereexpressedasrelativeoftheaveragecontrolvalue(shamoperation,sodiumchloridetreatmentascontrol).Statisticalyses.(ShouldincludesomebriefinforegardingtheWBStatisticalcomparisonswereperformedusingSPSS20.0.Westernblotting,PP2Aactivity,andthenumberanddurationofseizures/daywereysedwithindependent-samplesttests.RepeatedmeasuresANOVAwereusedtoassessseizuredurationandseverit