机能实验设计

一、机能综合实验设计预（一）动脉血压的神经体液调节及药物的影通过观察神经、体液因素及药物等对动脉血压的作用及影响，加深理解动脉血压作为心血管功能活动的综合指标、及其对恒定的调节原理和重要意义。学习大动物实验的基本方法和技术。动脉血压是心血管功能活动的综合指标。正常心、血管的动在神经、体液因素的调节控制下，保持相对稳定，动脉血压相对恒定。因而通过改变神经、体液因素或施加药物，观察动脉压的变化，以间接反映诸因素对心、血管功能活动的调节及影响。动脉血压的相对恒定对于保持各组织、器官正常的血液供应物质代谢是极其重要的，动脉血压的剧烈变化会显著影响各组织、器官的正常活动。当动脉血压大大降低时，会造成组织、器的血供严重不足，功能障碍，甚至危及生命，此时需要及时救治心脏受交感神经和副交感神经（迷走神经）的双重支配。交感神经兴奋通过其末梢释放的去甲肾上腺素（NE）与心肌细胞膜上的b1受体结合，引起心率加快、心肌收缩力增强，心输出量增加，血压升高。迷走神经兴奋通过其末梢放的乙酰胆碱（Acetylcholine，Ach）与心肌细胞膜上的M受体结合，引起心率减慢、心房肌收缩力减弱，心输出量减少，血压低绝大多数血管受交感神经支配。交感缩血管神经兴奋通过其末梢释放的NE与血管平滑肌上的a受体结合，引起血管收缩循环外周阻力增大，血压升高。反之，交感缩血管神经的紧张性降低，血管舒张，循环外周阻力减小，血压下降本实验通过切断、刺激支配心、血管的神经以及给药或体液因素等方法，除可直接观察心率、心脏收缩力及缩血管效应外还可通过观察动脉血压的变化间接了解心、血管活动的变化情况【实验器材和药品动物兔器材兔手术台、捕绑固定用绳、哺乳类动物手术器械、纱布、搪瓷碗、盛毛筒、量筒、手术灯、动脉插管、股动脉管、动脉夹、血压换能器、石蜡油、多道生理记录仪或计算机记录分析系统、心电图记录导线、双凹夹、铁支架、保护电极、子刺激器、2ml注射器、5ml注射器、20ml注射器、有色丝线、棉线、20%氨基甲酸乙酯、肝素（1000单位/毫升）、5%柠檬酸钠1：1万肾上腺素、1：1万去甲肾上腺素、生理盐水、1%肝素生理盐水、0.1%多巴胺、1：10万异丙肾上腺素、2.5%妥拉唑林、普萘洛尔【实验步骤和方法实验装置计算机Biolap98软件系统的使用：打开计算机，显示windows桌面。点击图标“biolap98”，进入BL-310智型生物信号显示与处理系统。点击“可进行生理、药理、毒理、病理等实验”，进入主画面。点击菜单“输入信号”栏，选择通道及标Ⅱ导联显示动物心电，通道2显示压力曲线；点击菜单“显示方式”栏，选择双通道显示方式。调节增益至100左右，时间数为“DC”，滤波用“1kHz”如用多道生理记录仪，则打开电源后，校正两个通道的扫描电压，并调节增益至适当位置。打开记录仪，调节描笔的位置校正描笔的摆动幅度电子刺激器的准备打开电源，选择“连续”刺激方式，波宽为0.5ms，电压为2～3V，频率为16Hz。将刺激电极连接于激器检查血压换能器，用石蜡油将其充满，将换能器三通管与动脉插管的导管相连，将换能器导线与计算机或多道生理记录相连准备动物秤重后，用20%氨基甲酸乙酯按每公斤体重1克的剂量从耳缘静脉缓慢注入，动物麻醉的标志为四肢松软角膜反射消失。麻醉后用绳子将动物背位固定于手术台上，打开手术台底部的电灯保温。剪去颈部手术野的毛以便施行手术手术沿颈部正中线切开皮肤6～7厘米，用止血钳沿正中线分离皮下组织及肌肉（胸舌骨肌），暴露出气管。用两组织钳分别夹住气管两侧的皮肤和肌肉的边缘，并将其拉向两侧，即可见到气管两侧与气管平行的左、右颈总动脉及与其相伴行的一束神经，这束神经中包括迷走神经、交感神经和减压神经。由于神经被包绕于动脉鞘中，所以应小心分离颈动脉鞘，仔辨认三条神经。迷走神经最粗，交感神经较细，减压神经最细且常与交感神经紧贴再一起。一般先分离颈总动脉与迷走神经，后分离减压神经与交感神经。每条神经各分离出2～3厘米，并在各神经下穿一条不同颜色的丝线以便区别和使用。右侧颈总动下穿一条线备用，左侧颈总动脉用于血压测量，在其远心端（头端）和近心端各穿一条线备用插动脉插管插管前先用肝素生理盐水注满插管，检查插管有无破裂，插管尖端是否光滑，不光滑时要用砂纸磨搽。次钝性分离左颈总动脉，尽可能长的向头端分离，然后结扎动脉头端。用动脉夹（与动脉垂直并处于水平位置）夹住动脉的近端，在尽可能长的靠远心端处用眼科剪将动脉剪开一斜口，约剪开管径的一半，然后将动脉插管向心脏方向插入动脉，用已穿的线结扎紧插入动脉的插管，并将同一结扎线固定于插管壁。在插管的适当位置固定插管并使其与动脉的走向一致，以防止插刺破动脉向耳缘静脉内注射肝素以抗凝，每公斤体重1000单位。注射后一分钟左右即可打开、移去动脉夹，此时即可见血液冲动脉插管，同时在显示器上可见有压力波动图象，打开记录仪可记出压力搏动曲线心室搏动观察装置将带有小旗的针灸针于胸骨柄下缘左侧垂直刺入，直至小旗随心室搏动而摇动为止，表明针尖已入心室肌心电引导将心电引导线与针灸针相连接，然后将针灸针刺入动物各肢体末端并固定，在显示器上可观察到心电图象作为心率、心律的观察指标【观察项目观察描记正常血压曲线从正常血压曲线上可见到三级波：一级波即心跳波，是由于心脏舒缩而引起的血压波动，与率及其节律一致二级波即呼吸波是由于呼吸时肺的张缩而引起的血压波动与呼吸周期及其节律一致一般一个呼吸波中有5个心跳波。三级波，不很明显，有时可清楚看到，其原因不完全清楚，可能是由于血管运动中枢紧张性活动的周期性变化所致三级波历时最长，有数个呼吸波组成观察心率及心室收缩强度从心电图上可准确观察和记数心率。心室收缩强度可通过观察针灸针上小旗的摆动幅度进估计（可设一个数值为正常强度，实验时与其比较，给出大概的变化值）用动脉夹夹闭右颈总动脉15秒钟，同时观察、记录血压及心率的变化用保护电极、以适当强度和频率刺激右侧减压神经，同时观察、记录血压、心率及心室收缩强度的变化。然后用两线在减压神经中部结扎，再于两结扎间剪断。用上述同样电刺激分别刺激减压神经的中枢端和末梢端，同时观察、记录上述各标的变化先在手术灯下观察两耳血管网的密度及血管扩张程度，再结扎右侧交感神经，并于结扎线的末梢端（近心端）剪断稍待片刻后再观察两耳血管网的密度及血管扩张程度的变化。然后用上述电流刺激交感神经头侧端，同时观察右耳血管网的密及血管扩张程度的变化用两条线在右侧迷走神经中部结扎，并于两结扎间剪断，用上述电流分别刺激近心端和头侧端，观察、记录血压、率及心室收缩强度的变化从耳缘静脉注入1：1万的肾上腺素0.3毫升，观察、记录血压、心率及心室收缩强度的变化。待完全恢复后，静脉1：1万的去甲肾上腺素0.3毫升，并进行同样观察从耳缘静脉注入0.1%多巴胺0.5ml/kg，观察血压变化。待血压恢复正常后，再注入同样剂量的多巴胺，随即注入妥拉唑林0.3ml/kg，观察血压、心率及心室收缩强度的变化从耳缘静脉注入1：10万异丙肾上腺素0.5ml/kg，观察血压、心率及心室收缩强度的变化。待血压等指标恢复正常后再注入同样剂量的异丙肾上腺素，随即注入0.1%普萘洛尔0.5ml/kg，并进行同样观察股动脉插管和放血在后肢腹股沟部切开皮肤3～5厘米，用血管钳分离皮下组织及筋膜，可看到股神经、股静脉和动脉，股动脉的位置在中间偏后，恰被股神经和股静脉所遮盖。小心分离出股动脉约2～3厘米，穿线备用。用两个动脉夹分别闭末梢端和近心端，在两个动脉夹之间剪一斜口，向近心端方向插入股动脉插管，并结扎固定；插管所连导管的末端置于量杯中为防止血液凝固，可在量杯中加入少许5%柠檬酸钠或肝素。待准备就绪，松开近心端动脉夹（不要移去）开始放血，同时密切察血压变化，当血压降至原水平的50%上下或出现休克现象时，即停止放血，同时观察、记录血压、心率和心室收缩强度的变化随即以较快速度从耳缘静脉输入所收集的血液，并进行同样的观察【注意事项麻醉药注射速度要缓慢，不能过量避免损伤动、静脉，严防出血。如发现出血现象，应立即止血每项实验必须在各观察指标处于正常水平的基础上进行，实验后也必须等待各指标完全恢复后，才能开始下一项实验（二）犬血流动力血流动力学是研究有关血液流动的一些物理学问题，和一般流体力学一样主要研究压力、流阻、流量以及三者的相互关系血流动力学的研究方法是评价心脏泵功能及心血管药药理研究的基本手段。常用的血流动力学实验一级指标有：血压、左室内压左室内压的变化速率、主动脉流量及标Ⅱ心电图等。通过学习心导管插管术及主动脉血流的测量方法，观察左室泵血功能及一因素对左室功能的影响【实验材料动物试剂和药品：3%戊巴比妥钠，1%肝素生理盐水，1：10000肾上腺素溶液1：10000去甲肾上腺素溶液，纯N2气囊，心安注射液等实验装置和器材：PowerLab生理数据采集与处理系统，MFV-3000电磁流量计，哺乳类动物急性手术器械一套，心导管等前置放大计算机PowerLab应用软手术前按下述实验装置示意图连接换能器、导线等，并按实验要求设置相应的数据采集参数及其它实验参数动脉血压----->血压换 左室内压----->血压换能 标Ⅱ心电 主动脉流量---->电磁流量计【实验方法和步骤称重，用3%戊巴比妥钠按1ml㎏麻醉，仰卧固定于手术台上，剪去颈部、左胸部及腹股沟处的毛正中切开颈部皮肤，分离出气管、颈总动脉，穿线，以备插气管插管心导管。气管插管插入后与人工呼吸机相连，以备开胸后做人工呼吸1.切开一侧腹股沟处的皮肤，分离出股动脉、股静脉，穿线，以备插管量血压和输入液体4。左侧胸部第4～5肋间横向切开皮肤，分离肌肉。用开胸器撑开胸腔切口暴露心脏，开动呼吸机行正压人工呼吸纵向切开心包膜，做心包床。仔细分离升主动脉根部并放置适宜内径的探头插入心电引导电极，连接心电图导线【观察项目手术全部结束10～15分钟后，记录心电图、血压、左室内压、左室内压的微分和主动脉流量，做为正常对照脉注射1：10000肾上腺素0.1ml/kg，观察上述指标的变化上腺素作用消失后，再次记录上述指标，作为下一个观察项目的前对照静脉注射1：10000去甲肾上腺素0.1ml/kg，观察上述指标的变化重复步骤3吸入纯N2气，观察上述指标的变化，待缺氧出现时停止吸入纯N2气重复步骤3静脉注射1：1000心得安，0.3ml/kg，观察上述指标的变化验观察结束后，使用PowerLab处理实验结果，整理实验数据【注意事项手术要仔细、柔和，尽量不要损伤小血管，若出血要迅速止血。分离大鼠股静脉时，更要细心柔和，否则静脉塌陷难以插管。狗的皮肤易出血，可用电烧灼器止血呼吸对血压影响很大，应注意呼吸量和呼吸频率，狗呼吸频率约20～24次／分钟导管及换能器的腔体内的空气必须排尽，微小气泡的存在都将影响血压及室内压波动图。测量之前必需确定换能器参考零点。常以大气作为参考零点导管插入过深管口碰在左室壁上则出现低平方波或直线，应将导管退出少许。当示波器上出现动脉波形，但导管不能利通过主动脉瓣时，可快速抖右手所持导管并向前插，往往可获得成功探头应选择选择钩型探头。应用钩型探头时，选择直径适当的探头是用本法取得准确结果的重要条件。必须保持探与血管紧密接触，结果才准确。故实验一般选用比血管外径小5%～10%的探头探头的浸泡：为保证探头有良好的传导性，应用前应将选好的探头浸泡在生理盐水中至少30分钟，新探头必须浸泡小时（三）影响尿生成的因素及药物影尿生成的过程包括肾小球的滤过及肾小管的转运，凡影响上述过程的因素，均可影响尿的生成并引起尿量的改变。本实通过以家兔为对象的急性实验、采用膀胱插管术收集并记录尿流量，从而观察在不同因素或药物的作用下尿量的变化1．学习膀胱插管术、尿量记录及尿糖鉴定等泌尿实验的方法２．进一步学习并熟悉大动物实验的基本技术和方法３．通过实验加深理解尿生成的机理及肾排泄功能的重要意义【实验材料１．动 ２．试剂和药品生理盐水、２０％氨基甲酸乙酯溶液、２０％葡萄糖注射液、１００单位／毫升肝素生理盐水（５％枸橼酸钠）、１／１０，０００去甲肾上腺素、垂体后叶素、速尿、２０％甘露醇、班氏（Benedict）尿糖定性试剂3．装置和器材四道生理记录仪（或计算机实验系统）、血压换能器、电子刺激器、保护电极、计滴器、兔手术台和术器械、动脉插管、膀胱漏斗、注射器（２ml、5ml、10ml、20ml）及针头、培养皿、酒精灯、试管架、试管和试管夹、气插管【实验方法１.仪器装按图连接仪器装调试四道生理记录仪及血压换能器装２．麻醉固 将兔称重后，自耳缘静脉注入２０％氨基甲酸乙酯（５ml/kg），待动物麻醉后仰卧固定于兔手术台上剪去颈部和下腹部手术野的毛3．手在颈部正中切开皮肤6～7厘米，分离皮下组织及肌肉，暴露出气管。在气管靠头侧做倒“⊥”型切口，然后插入气插管并固定。分离左颈总动脉和右迷走神经，在其下穿线备用。按颈动脉插管方法将充满肝素生理盐水的动脉插管插入左颈总脉，动脉插管的另一端连接压力换能器，手术完毕后用温的（37OC）生理盐水纱布覆盖创面在下腹部正中线脐下方作长约3～4厘米的皮肤切口，下端直达耻骨联合。分离皮下组织并沿腹白线切开腹壁。将胱翻出腹外，辨认清楚输尿管，并向肾侧仔细地分离两侧输尿管2～3厘米，在其下方穿一条线，将膀胱上翻用线结扎膀胱颈部阻断它同尿道的通路；然后在膀胱顶部选血管较少处，做一环形的荷包缝合，缝合线两端要足够长，暂不结扎；在荷包缝合的央剪一纵行小切口，插入膀胱漏斗，然后用荷包缝合线将切口边缘固定于膀胱漏斗的凹槽上，膀胱漏斗的另一端则用导管连接计滴器。手术完毕用热的生理盐水纱布覆盖腹部创口【观察项目待尿流量和血压稳定后，即可进行下列各项观察。注意每项实验开始前都必须先记录一段正常尿量和血压曲线作为对照然后进行注射或刺激，并连续观察和记录至效应明显后再等待恢复至原来水平时，才能开始下一项实验（1）自耳缘静脉快速注射38OC生理盐水20ml，观察血压和尿量的变化(2)结扎并剪断右侧迷走神经，用中等强度的电流刺激其外周段20～30秒，使血压维持在40～50mmHg，观察血压和尿的变化(3）先收集尿液2滴进行尿糖定性实验*作为对照，然后自耳缘静脉注射20%葡萄糖溶液（1.5ml/kg），观察血压和尿的变化，再收集尿液2滴作尿糖定性实验(4)自耳缘静脉注射1/10，000去甲肾上素0.5ml，观察血压和尿量的变化(5）自耳缘静脉注射速尿0.5ml/kg，观察血压和尿量的变化自耳缘静脉注射垂体后叶素2单位，观察血压和尿量的变化自耳缘静脉注射20%甘露醇2～3ml/kg，观察血压和尿量的变化(8）在动物的一侧大腿的股三角区，切开皮肤，分离出一侧股动脉，并插入硬塑料管进行放血（血液收集于加有抗凝剂量筒内），使血压降至40～50mmHg，观察血压和尿量的变化。然后输入所收集的血液，观察血压和尿量的变化【注意事项实验前应给兔子多喂青菜，或用橡皮导管向兔胃中灌入40～50ml清水，以增加其基础尿流量实验中需多次静脉注射，应注意保护兔的耳缘静脉。注射时，先从耳梢端开始，逐渐向耳根端移近；或选用小儿头针刺入耳缘静脉，用胶布固定，以便于多次注射使用各项实验顺序的安排是：在尿量增多的基础上进行减少尿生成的实验，在尿量少的基础上进行促进尿生成的实验尿糖定性实验在试管内盛入1ml班氏试剂，加入被检尿液2滴，在酒精灯上加热至煮沸。冷却后观察试液和沉淀物颜色，如试液由蓝色变为黄色或砖红色，表示尿糖实验阳性【讨论思考分析上述各实验结果的原因血压的高低与尿量之间有什么关系尿的生成受哪些因素的影响或调节？其机制是什么二、机能综合实验设计实（一）山莨菪碱及白细胞介素-13预处理对大鼠肾脏缺血/再灌注损伤的影九九级七年制前山莨菪碱是一种胆碱受体阻断药。由于其具有改善微循环，拮抗钙，抗毒性物质等多种对抗I/R损伤的作用。是用于实研究和临床治疗的一种较理想的药有试验证明用645-2预处理大鼠肾I/R损伤模型发现肾功能损伤指标在R4h时高于未处理组说明整体实验动物用645-2预处理在肾I/R早期可加重肾功能障碍。另有试验发现小鼠肾I/R后，如果使IL-6的mRNA表达下调可减轻肾损伤。因此提示654-2使IL-6含量增多可能是654-2早期导致肾损伤的因素之一白细胞介素13（IL-13）是一种多效性的TH2细胞因子，能抑制脂多糖（LPS）及肿瘤坏死因子（TNF）诱导单核巨噬胞产生多种炎症介质，包括IL-1，TNF-a等。目前有实验证明白细胞介素13能够抑制肾小球膜细胞增殖及的IL-6表达本实验采用654-2及IL-13联合用药。以降低大鼠肾脏在缺血再灌注中肾组织的早期损伤材料及方（一）试验材料：250-300克雄性大鼠20只；IL-13（美国Biosource公司产品）；山莨菪碱，PBC液；生化分析仪EXCELL软件（二）方法动物分组：取250-300克雄性大鼠20只随机分为4组，每组5只操作过手术前腹腔注射乌拉坦20%（1ml/kg）麻醉对照组：仅做相应假手术，即不夹闭左肾，只切除右肾缺血/再灌注4h组（R4h）：左肾夹闭，右肾切除，夹闭1h后，松开再灌注4h，R4H+654-2组；I/R处理同上，但应在109腹腔注射654-25010测定：颈动脉断开取5ml。离心取上清液，用双抗体夹心ELISA法测定IL-6含量，用生化分析仪测血肌苷含量，取肾脏称重，计算肾系数：肾重/体重，然后纵切肾脏，取一测肾组织用PBC液冲洗，稀释，制成匀浆，离心取上清液用于测量IL-6统计学处理：所有数据以均数+/-标准差（x+/-s）表示。采用spssEXCELL软件对各组间差异进行方差分析和t检验预测结肾功能变化：再灌注4h组显著高于对照组，说明I/R导致了肾功能障血液对肾组织中IL-6含量的变化：肾组织中IL-6含量依对R4h，照组，R4h+6542+I1-13依次增加：血液中IL-6含量对照组R4h,R4h+6542+IL-13,R4h+654-2顺序增654-2对各指标的影响；654-2R4h时可增加IL-6，Scr含IL-13对各指标的影响：IL-13，654-2联合用药时，血液及肾中IL-6Scr均较654-2单独用药时低，故推测I1-13可低IL-6的生成。从而减轻肾组织的损伤结果预测表R4h+654-R4h+654-2+IL-RenalIL-BloodIL-[参考文献周代星，邓普珍，山莨菪碱对急性完全性脑缺血性/再灌注后脑组织Ca2+MPA含量，SOD活性及超微结构的影响[J]急诊医学钟林，山莨菪碱减轻所致的内皮细胞凋亡。中国病理生理杂志，2000，16（10）：969-于小领，刘风等.莨菪碱预处理对大鼠肾脏缺血/在灌注损伤的影响[J]。中国病理学杂志，2002，18（3）：315-316MalerfytRWfigureCah.GMohamPetersonS,etal.JIMMUNOLGY,白细胞介素13抑制肾小球细膜细胞增殖及IL-6表达[J]，中国病理学杂志。2002，18（1）76-（二）阿司匹林（Asprin）预处理对大鼠肾脏缺血/再灌注损伤的影苏进安交通大学医学院99级七年陕西省西安肾缺血再灌注（ishemia-referfaoion,I-R）损伤是临床上常见的病理过程。近年来研究表明白细胞是构成肾脏缺血/再灌注伤的主要原因。I-R导致白细胞活化、化学趋化、与内皮细胞间粘附和位移。白细胞与内皮细胞间的相互作用经历“滚动”，粘附位移几个阶段。第一步是通过I-R诱导的内皮细胞P选择素大量表达来始动，P选择素能与白细胞对应受体-P选择素糖蛋白I相合。这种起始的低亲和力的结合导致间断性的白细胞-内皮细胞间联合，表现为白细胞的“滚动”。接下来白细胞的CD11a/CD18（细胞功能相关性抗原1）或MaCl，与大量表达的ICAM-1的结合，导致白细胞粘附和侧向运动的停止。血小板—内皮细胞粘附子（PECAM-1），促进白细胞移位到组织间隙，这种粘附分子主要是在细胞间连合部大量表达。到达血管外时，血细胞释放出毒性ROS、蛋白酶和弹力蛋白激酶、进而导致微血管通透性增加、水肿、血栓形成和实质细胞死亡阿司匹林（Asprin）是水杨酸的酯化物，它可以抑制炎症介质的释放，干扰炎症介质与受体的结合，抑制白细胞粘附分合成。I-R后释放的组胺、血小板活化因子（PAF）、白三烯B4（LTB4）、TNFα等促炎介质都参与白细胞活化。有实验证明采用可溶性IL-1受体拮抗剂、抗TNF抗体、PAF抑制剂等均可抑制I-R损伤中白细胞的活化。近年来发现，阿司匹林可触发脂氧素（Lipoxins）等一系列生物活性介质的合成。脂氧素是花生四烯酸在15-脂加氧酶的作用下生成的，可拮抗白三烯等促炎质产生的白细胞趋化、粘附和迁移作用，属于体内抗炎因子之一。在后肢缺血再灌注的小鼠模型上，新型的脂氧素类似物明显轻粒细胞介导的血管通透性病变和其它器官的继发损伤。另外NF-KB等转录因子可调节粘附分子的合成，而阿可匹林主要药理用即为抑制NF-KB等转录因子活性。反义寡脱氧核苷酸和假转录因子在动物模型上已取得成功治疗。可