41 转基因果蝇模型的建立

实验!1!转基因果蝇模型的建立41.1实验原理1981年，科学家构建出带有控制眼睛颜色基因的转座子iyl,注射到果蝇胚胎后，发育出的果蝇眼睛的颜色为野生型，这表示转入的基因己在体内表达。这一性状随果蝇繁殖保留了卜来。随着第一只转基因果蝇诞生，转基因果蝇已经成为研究广范的生物学问题和现象的一种技术了。实际上，任何克隆基因可以用P转座因子系统插入到基因组中。转基因果蝇是指用实验导入的方法使外源基因在果蝇的染色体基因组内稳定整合，然后遗传给后代的果蝇。实际上，注射的DNA由两部分组成。一部分是含有缺陷型P因子的辅助质粒，它虽然能够产生P因子转座酶，能够帮助P因子转化，但是它本身不能移动；第二部分是P转座子构件，由P因子的转座基因与目的基因构建而成的重组载体。在没有辅助载体的情况下，P因子构件是不能转座整合到果蝇基因组中去的。但当辅助载体存在时，它含有的转座酶可以帮助P因子转座，从而使目的DNA（基因）进入细胞核，再伴随P因子一道转座整合到基因组上：从而可以产生稳定遗传的转基因果蝇。存在于P因子序列之间的可选择性的标记基因（如眼色基因）可用来检测和鉴定转基因果蝇的生成。41.2实验材料1.质粒DNA溶液的准备1)2)3)溶液I：50nmioVL25nmiol/L10nmiobL在4°C贮存。溶液II0.21)2)3)溶液I：50nmioVL25nmiol/L10nmiobL在4°C贮存。溶液II0.2mol/L1%配制新鲜的。溶液III5moL;L6011.5niL28.5niL葡萄糖Tns-Cl(pH=8.0)EDTANaOHSDSniLKAc冰醋酸水4)3M醋酸钠，贮存在室温6个月或等份分装置-20°Co2.培养基4)1）葡萄汁平板:30g琼脂加入1L水，在微波炉里溶解;分别加360niL葡萄汁，2g羟苯甲酸甲酯;30g购买的糖，在热金属板上搅拌溶解；把葡萄汁加到溶解的糖中搅拌好，倒入100nun的培养皿内o2）酵母糊：将干酵母加到水中，直到变成花生酱状（30g酵母加入50mL水）：加点摩砾层（颜色变成黑色，比花生酱还软，但在平板上不会流动）。果蝇品系：白眼品系。其他材料和药品1）购买的篮状型咖啡过滤器2）酚、氯仿3）卤经油，系列7004）漂白剂（次氯酸纳）5）EB染液6）乙醇7）TAE8）异丙醇9）双面胶，12nun宽10）塑料大口杯11）注射用玻璃毛细管12）银子13）pMD18-T和pUAST载体14）DNA分子量标记15）PCR产物纯化试剂盒、DNA纯化试剂16）柱式质粒纯化试剂盒4.仪器倒置显微镜、体视显微镜（图41-1）、拉针仪、微量移液器、转基因仪、显微操作器、低温高速台式离心机、隔水式电热恒温培养箱、SHINADZU电子天平、HX-1050恒温循环器、超净工作台、X-90型暗箱式紫外透射仪、THZ-82B气浴恒温振荡器、YY-III-6B型稳压稳流电泳仪、DYY-III型电泳槽、微波炉、XK96-A快速混匀器、GBII240-89不锈钢电热恒温水浴锅、TGR16-12高温冷冻离心机、血sc。离心机、超纯水纯化仪41.3实验方法1.DNA的制备1）目的基因片段的获得：（1）.通过PrunerPreimer5.0程序设计引物序列，并引入EcoRI酶切位点：PCR扩增目的片段后纯化；（2）连接到pMD18-T±o具体连接反应如下：pMDBTl匹，PCR产物5匹，连接溶液16ML,16°C连接过夜；（3）构建好的pMD18-T一目的基因的转化：将100匹的感受态细胞（DH-5a）加入10pL的pMD18-T目的基因连接子中，置冰上30min；42°C30-90s热休克；迅速冰上冷却3~5min；加入1niLLB液体培养基（未加抗生素），37°C摇床1h；3000rpm离心2min,去700pL上清，：剩下菌液混匀，取出150卜iL涂布在37笆预热含氨茉青霉素的平板培养基上,剩余菌液4°C保存；倒置平板，于37°C培养，12h可出现菌落（4）pMD18-T目的基因阳性克隆的筛选与鉴定随机挑选单个菌落于含氨节青霉素的LB液体培养基（lOOpg/mL）中，37°C摇床培养15h左右，小量制备质粒DNA,瓦wRl和Ps/I酶切鉴定是否含插入片段。分光光度计测定质粒DNA的浓度，设计酶切反应体系是：EcoRl与Psfl各1匹，RNase0.5匹，10XHBuffer2pL,质粒DNA1pL,超纯水15.5将反应液成分按以上比例加入EP管中，混匀，于37°C恒温培养箱中酶切过夜，次口电泳点样检查。（5）.pMD18-T-目的基因质粒的酶切、目的片段的纯化回收用EcoRl酶切pMD18-T-目的基因10匹质粒,将反应液成分按以上酶切鉴定的比例加入EP管中，混匀，于37°C恒温培养箱放置过夜，次口用合适浓度的琼脂糖凝胶，60V电压2-3h电泳，以使目的DNA片段和其它DNA片段尽可能分开，切下所要回收的琼脂块。用纯化试剂盒回收。2）pUAST重组载体的构建（1）用EcoRI酶切pUAST质粒，反应体系如下：EcoRl20pL,10XHBuffer20pL,质粒DNA40pL,超纯水120pL,总体枳200pL。将反应液成分加入EP管中，混匀，于37°C恒温培养箱放置过夜，点样3pL检查，确认质粒完全切开；（2）去磷酸化：反应体系如下：CIAP6pL,AlkalinePlusahataseBuffer40|.iL,质粒DNA197pL,超纯水157pL,总体枳200将反应液成分加入EP管中,混匀，于水浴50°C放置30mm；（3）加入酚:氯仿:异戊醇（25:24:1）抽提一次，吸上清；（4）加入三氯甲烷抽提两次，吸上清；（5）加入0.1倍体积3MNaAc和三倍体枳的无水乙醇：（6）-20°C放置30min；（7）12000rpm离心15-20min,弃上清,空气干燥;加入10|1L超纯水，-20°C保存；载体pUAST和目的基因的连接，连接的方法和比例参照1.1).(2);pUAST-目的基因连接子的转化，方法同1.1).(3);pUAST-目的基因阳性克隆的筛选和鉴定，方法同1.1).(4);pUAST-目的基因质粒的大量制备挑取连接正确的菌种加入500niL的液体培养基中，放入37°C摇床培养约16小时；EP管中加50mL菌液，6000rpm离心2min,弃上清，重复一次；加入溶液I4mL,重悬打散；加入溶液II8mL,颠倒5-10次，冰上放置小于5min；加入溶液III6mL,颠倒5-10次，冰上放置5T0null；4000rpm离心10mm4°C吸上清转管，加入等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1),混匀，4000ipm离心5inin:吸上清转管，加入等体积三氯甲烷，混匀，4000rpm离心5min：重复一次；吸上清转管，加入0.7倍体枳的异丙醇沉淀，6000rpm离心15nwi;弃上清，加入1mL70%酒精，4000rpm离心5min；弃上清，干燥2h；加入500匹灭菌ddH2Oo放入65笆水浴锅中30min使DNA酶失活加入RNase放入37°C培养箱中消化过夜；点样2卜(L检查浓度。2.胚胎的制备受体果蝇系是yw(yellowwhite-通常用yDf(1)"和为，一*个不能自动恢复的缺少白色的品系)°在注射前的至少2d收集约200只羽化的果蝇(2〜3d)到笼子里；用有酵母糊的葡萄汁板封闭敞开的一端，按时间规律饲养果蝇，至少一天换两次葡萄汁板。用小皿来收集胚胎；当收集用来注射的胚胎时，每30nun换一次平板。丢弃前两次的收集物，以消除陈旧胚胎的污染；将带有胚胎的葡萄汁平板自然风干5nun,同时，准备几个用来注射的盖玻片；在盖玻片的一端边缘贴一块大约1cm宽的双面胶；用毛笔或小铁幺幺轻轻地将葡萄汁平板上的果蝇胚胎排到盖玻片的双面胶上；用细尖银子轻推胚胎的腹部或侧部，使胚胎按照固定的方向整齐排列。排列时,胚胎的后端向外，前端向内。如下图所示。

针头方向后面前面盖玻片针头方向后囱卤姓油前面盖玻片图41-2胚胎在盖玻片上的排列。等胚胎干燥后，在上而覆盖一层卤燃油，厚度要适中。针头方向后面前面盖玻片针头方向后囱卤姓油前面盖玻片要保证在玻片上排列胚胎的时间最多2.3min,然后继续干燥和注射，因为如果时间过长，胚胎脱水将变化太大。8）胚胎排列到玻片上后，须经室温干燥胚胎，然后用卤燃油覆盖（如图41-2）。干燥可能是影响成活率的关键因素。在注射开始时，要测定几块玻片的胚胎材料来确定它的干燥时间（如3,4或5min,这时间要依据环境的温度和湿度而定）。如果卵黄膜被注射针尖推凹，不能立即返回到它的起始形状，是胚胎太干燥了。如果针尖很顺利的刺入胚胎，但是细胞质在针尖进入后立即流出，表明胚胎太湿了。干燥时间似乎与温度更加有关，一般是25°（2下4〜51皿或24°C下5〜6min.针头的准备1）可用任何型号的拉针仪，用1O-|1L的玻璃毛细管加热拉制针头。也可以买拉好的针头；2）在正常情况下，需要将针头尖折断，使口径达到2〜4Fun,具体做法是：用一根精细的钙针将其折断，或者在针头安到显微操作仪上后，将针头在显微镜盖玻片的边上压，以此折断针头；3）要将针头灌液时，可以将一小滴注射液滴在固定于载玻片上的石蜡膜上，靠毛吸作用充满针头。也可以在针头的大口接上一个吸头；4）灌注好的针头可以将其针尖插入到油中保存起来。注射因为注射必须在极细胞形成之前，所以最好用收集一个小时的胚胎。也可以用一个半小时后的，但通常有很多老胚胎，这些老胚胎在注射过程中通常会被针尖破坏。为了避免胚胎体阻碍针尖，要记录过期胚胎的位置并在注射后用银子移开它们。1）拉针：针头应该要提前准备，需要准确调整微移。插入的毛细管必须足够小以致小到用肉眼看不见。针头的延伸部分（插入后的一半）应该有1cm长。用拉针仪拉制大小和长度均合适的注射针；2）目的DNA溶液的转移：用微量移液器将目的DNA溶液转移至注射玻璃针内。3）破针：简单的方法是将玻璃注射针的的针尖贴在盖玻片的边缘，轻轻移动，直到看到液滴出现。液滴大小合适，说明针尖大小合适：4）把玻璃注射针的末端与程控注射仪相连，以保证针管内的溶液可以通过压力被推进胚胎。同时，玻璃注射针必须固定在显微操纵器上，以便它能够三维移动;5）装上排有去卵壳的胚胎玻片，使胚胎后部朝向针头；6）在显微镜下聚焦，然后移动平台使胚胎的边缘刚好与针尖接触，注射；胚胎盖玻片（边缘）图41-2图示为果蝇胚胎注射。注意要赶走气泡，以免细胞质从胚胎里漏出来。7）在注射过程中，针头应该很顺利的插入。在大部分装置上，是移动平台而不是显微操纵器。然而为了在垂直水平排列有胚胎的针头，要上下移动显微操纵器。针头应该插入背部尾端，那里是极细胞形成的地方；8）把胚胎放到针头（针端应该在聚焦区）来确定针头接触哪里，如必要的话，用显微操纵器调整针头的高度；9）当针头接触到预期的点，稍微快速稳定地移动平台来插入针头，使针头快速顺利插入；10）拉回胚胎使针尖尽可能接近卵黄膜，然后释放压力注射DNAo注射足够多以致于在细胞质中流动，但不要太多而在拔出针头时细胞质流出。通过移动平台再重复一次。有时，针头从注射的胚胎中拔出时被残骸堵塞。就必须对针头进行疏通，可以通过在玻片的边缘接触，也可■以通过利用压力和观察溶液的出现测试恢复端。当然，再次破坏可能会导致针尖太宽影响注射成功，需要用新针头。11）注射后，胚胎应该保存在湿环境，25°C下22h以上或18°C下3611以上；12）胚胎孵化后，用解剖针收集，把它们轻轻地放入食物小瓶的表面。当用琼脂食物时，表面应该是软的湿润的，用解剖针在上面划线再加一滴水。4.杂交1）分离在1天中涌现的成虫果蝇，阻止它们自交。为了建立独立的转基因品系，高效的方法是用含有四个标记性状的双平衡品系与注射过的成虫做单对杂交（如w/w：CyO/Sco：TM3,D）；2）观察下一代的w+转化珠。尽管出现隐性致死染色体，这种杂交也不会明显减少与野生型相关的能繁殖的转基因果蝇的产生；3）每个转化果蝇与单个的平衡系（如yw/yw：CyO/Sco；+/+：或yw/yw；+/+：TM3/D）杂交，根据与显性有关的眼色的分离来确定转基因在哪条染色体上。这种杂交也促进独立系的建立。例如，如果转基因被证明是在第二条染色体上，P[w+]/CyO平衡系是因为CyO系的杂交的结果。对于这种杂交，雄性转基因果蝇更可取，因为它们通常产生更多的后代而不必从同胞中分离出来，仍然是原始的。如果许多转基因系来自小瓶，就有可能从单个注射的母本中得到不止一种的独立系。然而，如果是这样的话，在个体中就会增加多个插入的可能性，这是不期望的；4）从单个注射母本中取三个转基因个体，分别与单个平衡系交配，通常就能确保有可育系，尤其当它们是雄性时。所以，一旦从瓶中得到了三个转基因果蝇，一般就不用再搜索了。5.成功率1）得到转基因果蝇的效率与注射的质粒大小有关。得到类似的转化效率所用的质粒大小范围是12〜22kb。平均孵化率是40〜70%,羽化（从孵化的胚胎）率是60〜80%,然而产生转基因果蝇（从注射过的胚胎）的效率是5〜20%。通常注射40〜50个胚胎，可以得到5个或更多的独立转基因系。2）在不同的系里，眼色表现型依据转基因在染色体上的插入位点而变化：眼色从微黄到橘黄或红色。这些小白眼表达的不同水平经常与临近的转基因表达水平有关。3）有时转化效率比预期的要低好多。实际上，在一些构建体中尽管注射了大量的胚胎，但没有得到转基因果蝇。这可•能是注射的转基因的显性影响，使可能的转基因果蝇致死或引起不育。有时，只要减少注射的质粒的浓度就能解决这个问题，可能是因为插入前的转基因的表达是致死或不育的主要原因。4）如果用低浓度（约20pg/niL）注射，问题还存在的话，在这种条件下平行注射其他构建体。或者用GAL4系，在这个系里，转基因放在GAL4UAS以下，导致开始建立的转基因系不会表达。这个转基因然后通过与激活GAL4表达的另一转基因品系杂交来诱导。5）另外一种策略是放一个含有poly-A信号的FRT盒于转基因的启动子和开放阅读框中。得到转基因果蝇后，FRT盒能够通过介入表达FLPase（催化两个FRT序列的连接，因此移开起抑制作用的poly-A信号）的转基因而除去。6）如果具有转基因的转化效率低，这种转基因的蛋白产物起抑制作用（如LacZ报告基因），这可能是转基因的调控序列抑制附近的小白眼基因，导致转基因果蝇看不到白眼。如果重新得到转基因品系，它们一般有非常明显的眼色，整合位点可能接近于小白眼和转基因扩增表达的地方。发现这个问题可以通过在小白眼可选择标记基因的启动子上游的Glass结合位点来克服。Glass位点增加白眼的表达，是因为Glass蛋白在眼触角盘状物（其它含光受体的组织脑内的一些细胞）的感应现象，因此尽管有抑制效应也会观察到转基因果蝇。然而，这种方法也可能增加转基因插入到异染色或其它抑制DNA中的可■能性，这会导致转基因的抑制表达。41.4注意事项几种可供选择的收集胚胎的处方。另外一种是用2%的琼脂，冰醋酸（每100niL2滴）和酒精（每100niL2滴）。当琼脂溶液沸腾再冷却后加入醋酸和酒精。在使用前，每个平板加一些烘干的酵母，冰醋酸大部分用Kimwipe擦干；当注射过的胚胎在培养时，油要注意扩散，使胚胎露出脱水。用油笔在双面胶上划圈阻止扩散。然而，厚层油会使胚胎致死，所以用适量的油是胚胎稍微露出直到孵化。用更轻的400系列卤炷油，来减少厚层油的可能性，但要保持油流动就更加困难了；用CsCl梯度或购买的柱状物纯化的质粒DNA可用来注射。然而，这些方法有时产生粘性DNA溶液在针头形成气泡，导致注射过程的障碍。没必要用高纯度的DNA；高于500pg/niL的DNA浓度会极大地减少幼虫的成活率。用低至20pg/mL浓度的DNA,转基因效率高；磷酸缓冲注射液（如，5niMKC1,0.1mMPO『+,pH7.8）通常用来稀释注射的DNA。然而，用无菌去离子水稀释DNA到终浓度为lOOpg/mL,这不会明显地影响幼虫的成活率和转化的效率；不要将葡萄汁培养皿烘太干，因为果蝇要得到湿气才行，太干了果蝇也不能躺到上面。酵母糊应该是新鲜配制，在培养皿上延伸约1/4的面积，为收集的果蝇提供食物。笼子每4〜5d要换，因为笼子干了，果蝇就躺到了表面而不是在收集皿中了。大于12d的就不收集：胚胎收集也可用不含食物的能颠倒的1/2-品脱的玻璃或塑料牛奶瓶，但是要接近收集培养皿（盖子上有从35nun的培养皿中粘有琼脂/酵母）。然后，在收集前，100〜200条2〜10d的成虫转移到新食物中；一般用次氯酸钠去卵壳。将水移到平板上，用漆刷轻轻刷表面（刷子是#3,骆驼毛的），将胚胎倒入一个小收集篮里。用水冲洗再转移到50%次氯酸钠中2.5mm,断断续续的搅动。用水冲洗在用刷子将胚胎转移到琼脂糖块（2%琼脂，25%糖蜜；用剃刀剪一部分）上。用镣子将去了卵壳的胚胎排列在琼脂糖块上，卵孔挨着糖块。然后，用纸片的胶端收集胚胎：在前面的注射方法中，建议在18°C下培育。然而，在25°C下不会降低孵化率和整个效率。（梁淑媛袁婺州吴秀山）主要参考文献■MarindiaDepra;LeniraMariaNunesSepel;ElgionLuciodaSilvaLoretoV.Alow-costappaiatusfbrtransformingDrosophilaanddetectinggreenfluorescentprotein(GFP)geneticmarkers.Genet.Mol.Biol.vol.27no.1SaoPaulo2004.Thumiel,C.S.,Boulet,A.M.,andLipshitz,H.D.VectorsforDrosopliilaP-element-mediatedtransformationandtissuecultuietiansfection.Gene,1988,74,445-456.Sainbrook,J.,Fritsch,E.F・,andManiatis,T.MolecularClonmg:ALaboratoiyManual.2nded.ColdSpringHarborLaboratoiyPress,ColdSpringHaiboi;NewYork.1989.Brand,A.H.andPeniinon,N.Targetedgeneexpressionasameansofalteringcellfatesandgeneratingdominantphenotypes.Development1993,118,401-415.Baslei;K.andStnihl,G.CompailmentboundariesandthecontrolofDrosopliilalimbpatternbyhedgehogprotem.Nature,1994,368,208-214.Buenzow,D.E.andHohugen,R.ExpressionoftheDrosopliilagooseberrylocusdefinesasubsetofneitoblastlineagesinthecentralnervoussystem.Devel.Bool.1995,170.338-349.Ellis.M.C.,O'Neill,E.M.,andRubin,G.M.Expressi