基因工程药物之干扰素的制备流程课件

基因工程药物--干扰素的制备

1什么是干扰素概念(interferon,IFN)：机体免疫细胞产生的一类细胞因子，是机体受到病毒感染时，免疫细胞通过抗病毒应答反应而产生的一组结构类似、功能接近的生物调节蛋白。根据分子结构和抗原性的差异分为α、β、γ、ω等4个类型。1.1天然干扰素的分类

1.

根据来源、基因序列和氨基酸组成分类

◆

I型干扰素：IFNα、IFNβ、IFNτ、IFNω

来源：白细胞、成纤维细胞、病毒感染的组织细胞等功能：抗病毒感染、抗肿瘤生长、免疫调节(较弱）

其中IFN-α为多基因产物，有23种以上的亚型。

◆

II型干扰素：干扰素γ（IFN)

来源：活化的T细胞和NK细胞产生功能：免疫调节

提高单核巨噬细胞、树突状细胞的抗原提呈能力

增强Tc细胞和NK细胞的杀伤活性

抑制TH2细胞形成，下调体液免疫应答

趋化作用

抗病毒和抗肿瘤作用（次要）

2.

根据动物来源确定分类

人干扰素（HuIFN），小鼠干扰素（MuIFN）。

不同来源的干扰素1.2重组干扰素的临床应用广谱抗病毒活性（rhuIFNα）慢性乙型、丙型、丁型肝炎；疱疹、病毒性角膜炎。直接抗肿瘤活性（rhuIFNα）毛细胞和慢性髓样白血病、Kaposi肉瘤、非霍奇金淋巴瘤。免疫调节活性——治疗慢性肉芽肿瘤（rhuIFNγ）多发性硬化症rhuIFNβ2基因工程大肠杆菌发酵生产工艺干扰素生产工艺路线上市产品：重组人干扰素rhuIFN1986，rhuIFNα-2a，rhuIFNα-2b；

1990，rhuIFNγ-1b；1993，rhuIFNβ-1b；

2001－2002：PEG化IFN，PEG-Intron,Pegasys

表达产物：无糖基化，N-met，无活性包涵体工艺特点：发酵过程，随后变性、复性过程。基因工程大肠杆菌发酵生产工艺:目的基因的分离克隆载体目的基因与克隆载体的体外重组→重组体导入大肠杆菌K12→受体菌的培养及筛选→从受体菌中获取目的基因表达载体重组质粒导入大肠杆菌受体菌的筛选，表达性、稳定性等检测工程菌→基因工程菌的制备一、目的基因的分离与扩增1.破碎细胞，用Trizol法提取总的RNA2.将生产干扰素的人白细胞的mRNA分级分离然后进行凝胶电泳切取目的基因片段3.用逆转录试剂盒逆转录，把总mRNA逆转录成cDNA4.以cDNA为模板、干扰素引物为引物，PCR，得到完全的干扰素基因的PCR产物5.人工加尾形成“粘性末端”二、构建重重组质粒1.提取载体（（质粒、病病毒等），，双酶切，，再把干扰扰素基因的的PCR产物用相应应的酶酶切切，用连接接酶连接EcoRIBamHIEcoRIBamHI2.连接完成后后分离纯化化，测序，，与原干扰扰素序列比比对。3.鉴定序列无无误后，导导入受体细细胞，筛选选三、重组体体引入宿主主细胞将cDNA克隆到含有有四环素、、氨苄青霉霉素抗性基基因的质粒粒中，转化化到大肠杆杆菌，重组组的载体DNA分子在一定定条件下转转化入大肠肠杆菌，形形成携带质质粒的菌株株。四、受体菌菌的筛选由于质粒重重组时有3种基本方式式，即：目目的基因与与克隆载体体重组，目目的基因片片段与目的的基因片段段重组，克克隆载体与与克隆载体体重组；另另外重组过过程可能会会发生基因因突变情况况五、分析保保存对基因工程程大肠杆菌菌进行评价价分析，并并保存菌种种。干扰素的发发酵工艺过过程启开种子制制备种子液液发发酵培养粗粗提提精提半半成品品制备半半成品检检定分分装冻干成成品品检定成成品包装1．菌种培养养取－70℃下保存的甘甘油管菌种种（工作种种子批），，于室温下下融化。然然后，接入入摇瓶，培培养温度30℃，pH7.0，250r/min活化培养18±2小时后，进进行吸光值值测定和发发酵液杂菌菌检查。2．种子罐培培养将已活化的的菌种接入入装有30L培养基的种种子罐中，，接种量10%，培养温度度30℃，pH7.0，级联调节节通气量和和搅拌转速速，控制溶溶解氧为30%，培养3～4小时，转入入发酵罐中中，同时取取样发酵液液进行显微微镜检查和和LB培养基划线线检查，控控制杂菌3.发酵罐培养养将种子液通通入300L培养基的发发酵罐中，，接种量10%，培养温度度30℃，pH7.0。级联调节节通气量和和搅拌转速速，控制溶溶解氧30%，培养4小时。然后后控制培养养温度20℃，pH6.0，溶解氧60%，继续培养养5～6.5小时。同时时进行发酵酵液杂菌检检查，当OD值达9.0±1.0后，用5℃冷却水快速速降温至15℃以下，以减减缓细胞衰衰老。或者者将发酵液液转入收集集罐中，加加入冰块使使温度迅速速降至10℃以下。4.菌体收集将已降温的的发酵液转转入连续流流离心机，，16000r/min离心收集。。进行干扰扰素含量、、菌体蛋白白含量、菌菌体干燥失失重、质粒粒结构一致致性、质粒粒稳定性等等项目的检检测。菌体体于－20℃冰柜中保存存时，不得得超过12个月。每保保存3个月，检查查一次活性性。3.干扰素的分分离纯化工工艺过程3.1、干扰素分分离工艺过过程3.2、干扰素的的纯化工艺艺过程3.1干扰素分离离工艺过程程菌体裂解预处理初级分离(1)菌体裂解裂解缓冲液液：纯化水水配制，2℃～10℃（pH7.5）使用保护剂剂：EDTA，PMSF。破碎菌体：：2厘米以下的的碎块搅拌：加裂裂解缓冲液液，2℃～10℃，2hr冻融:细胞完全破破裂，释放放干扰素。。(2)预处理-沉淀加絮凝剂聚聚乙烯亚胺胺:2℃～10℃，搅拌45min，对菌体碎碎片进行絮絮凝。加凝聚剂醋醋酸钙溶液液:2℃～10℃,搅拌15min，对菌体碎碎片、DNA等进行沉淀淀。(3)离心连续流离心心机：2℃～10℃，16000r/min收集上清液液：含有重重组干扰素素蛋白质杂质沉淀：：121℃、30min蒸汽灭菌,焚烧处理。。（4）初级分离离盐析:硫酸铵，2℃～10℃，搅匀,静置过夜。。离心：连续续流离心机机，16000r/min保存：收集集沉淀，粗粗干扰素，，4℃保存。3.2、干扰素纯纯化工艺过过程溶解粗干扰扰素沉淀与疏水水层析阴离子交换换层析与浓浓缩阳离子交换换层析与浓浓缩凝胶过滤层层析无菌过滤分分装(1)溶解粗干扰扰素配制纯化缓缓冲液：超纯水，pH7.5磷酸缓冲液液，0.45μμm滤器和10ku超滤系统，，百级层流流下收集。。冷却至2℃～10℃。检查:缓冲液的pH值和电导值值。溶解：2℃～10℃，匀浆，完完全溶解。。(2)沉淀与疏水水层析等电点沉淀淀（1）：磷酸调调节至pH5.0，沉淀杂蛋蛋白，离心心收集上清清液。疏水层析：：干扰素吸吸附在疏水水层析柱中中除非疏水性性蛋白洗脱与收集集：0.01M磷酸缓冲液液（pH8.0）等电点沉淀淀（2）：磷酸调调节pH4.5，调节电导导值40ms/cm，2℃～10℃，静置过夜夜超滤：1000ku超滤膜过滤滤，除去大大蛋白。透析除盐：：调整溶液液pH8.0，电导值，，10ku超滤膜，0.005M缓冲液。(3)无菌过滤分分装0.22μμm滤膜过滤干干扰素溶液液分装－20℃以下的冰箱箱中保存。。(4)检测项目干扰素素鉴别别试验验干扰素素效价价测定定蛋白质质含量量，纯纯度测测定，，分子子量宿主残残余蛋蛋白、、残余余DNA干扰素素结构构鉴定定：紫紫外光光谱，，肽谱谱，N端序列列其他：：热原原，内内毒素素，残残留抗抗生素素半成品品检定定（1）效价测测定用细胞胞病变变抑制制法，，以Wish细胞、、VSV病毒为为基本本检测测系统统，测测定中中必须须用国国家或或国际际参考考品校校准为为国际际单位位。（2）蛋白质质含量量测定定福林-酚法，，以中中国药药品生生物制制品检检定所所提供供的标标准蛋蛋白为为标准准。（3）比活性性效价的的国际际单位位与蛋蛋白质质含量量的毫毫克数数之比比。（4）纯度电泳纯纯度用用非还还原型型SDS法，银银染显显色应应为单单一区区带，，经扫扫描仪仪测定定纯度度应在在95%以上。。（5）相对对分子子量测测定还原型型SDS，加样样量不不地域域微克克，同同时用用已知知相对对分子子量的的蛋白白标准准系列列做对对照，，以迁迁移率率为横横坐标标，相相对分分子量量的对对数为为纵坐坐标作作图，，计算算相对对分子子量。。与理理论值值比较较，误误差不不得高高于10%。（6）残余余外源源性DNA含量测测定用放射射性核核素或或生物物素探探针法法测定定，每每剂量量中残残余外外源性性DNA应低于于100pg。（7）残余余血清清IgG含量测测定在应用用抗体体亲和和层析析法作作为纯纯化方方法时时必须须进行行此项项检定定。（8）残余余抗生生素活活性测测定半成品品中不不应有有抗生生素活活性存存在。。（9）紫外光光谱扫扫描检查半半成品品的光光谱吸吸收值值，最最大吸吸收值值应在在280±2纳米。。（10）肽图测测定用CNBr裂解法法，测测定结结果应应符合合干扰扰素的的结构构，且且批与与批之之间应应一致致。（11）等电点点测定定等电聚聚焦电电泳。。（12）除菌半半成品品应做做干扰扰素效效价测测定、、无菌菌试验验和热热源质质试验验。成品检检定（1）物理性性状冻干品品白色色或微微黄色色疏松松体，，加入入注射射水后后不得得含有有肉眼眼可见见不溶溶物。。（2）鉴别试试验应用ELISA或中和和试验验检定定。（3）水分测测定用卡氏氏法，，应低低于3%。（4）无菌试试验同半成成品。。（5）热原质质试验验同半成成品检检定。。（6）干扰素素效价价测定定同半成成品检检定，，效价价不应应低于于标示示量。。（7）安全试试验取体重重为350-400克豚鼠鼠3只，每每只腹腹侧皮皮下注注射量量为成成人每每千克克体重重临床床使用用最大大量的的3倍，观观察7天，若若豚鼠鼠局部部无红红肿、、坏死死、总总体重重不下下降，，说明明成品品合格格。取取体重重18-20克小鼠鼠5只，每每只尾尾静脉脉注射射剂量量按人人每千千克体体重临临床使使用最最大量量的3倍，观观察7天，若若动物物