感染性疾病的分子诊断课件

DNAmRNA蛋白质转录反转录

翻译

核酸分子杂交

基因结构异常基因表达异常PCR

DNA测序

核酸分子杂交

实时荧光定量PCR

反转录PCR

蛋白质芯片

ELISA

蛋白组织化学染色Western-blot基因芯片

基因诊断的技术和方法DNAmRNA蛋白质转录反转录翻译核酸分子杂交基因结构1感染性疾病的分子诊断课件2

第四代：分子诊断（1978年始）－－病因学诊断

分子诊断第四代：分子诊断（1978年始）分子诊断3感染性疾病的分子诊断课件4基因病类型1、感染性疾病：病原生物的侵入如流感、肝炎、艾滋病2、遗传性疾病：如苯丙酮尿症、血友病等3、复杂性疾病，如肿瘤、原发性高血压

基因病类型1、感染性疾病：5感染性疾病的分子诊断课件6感染性疾病的分子诊断严永敏基础医学与医学技术学院感染性疾病的分子诊断严永敏7第一节诊断策略及诊断方法标本处理病毒的基因检测病原菌的基因检测第一节诊断策略及诊断方法8一般性检出策略和方法

针对特异性的核酸序列进行核酸分子探针杂交，或者利用常规PCR技术直接检出微生物的DNA/RNA，判断有无感染和是何种病原体感染。完整检出策略和方法

按照诊断→分型→亚型→耐药性检测的思路，利用多种基因诊断手段对感染性病原体进行分析。一、分子诊断策略一般性检出策略和方法针对特异性的核酸序列进行9二、分子诊断方法1.信号放大技术（bDNA\杂交捕获系统）支链DNA（bDNA）技术二、分子诊断方法1.信号放大技术（bDNA\杂交捕获系统）支10杂交捕获系统特点：稳定性、重复性、特异性好杂交捕获系统特点：11二、分子诊断方法2.靶分子扩增技术（PCR/TAS/LCR）转录依赖的扩增系统（TAS）二、分子诊断方法2.靶分子扩增技术（PCR/TAS/LCR）12连接酶链反应（LCR）特点：简单、快速、灵敏度高连接酶链反应（LCR）特点：131.标本选择选择原则：符合疾病的发病机制，反映病程标本类型：血浆、血清、全血或白细胞核酸类型：DNA\RNA\miRNA三、标本处理2.标本量、抗凝剂3.标本保存、传送4.标本预处理1.标本选择选择原则：符合疾病的发病机制，反映病程三、标本处141.阴性结果注意：灵敏度,核酸提取及扩增效率.四、结果解释2.阳性结果3.定性检测结果4.疾病状况的判断注意：特异性,可能的污染.注意：病情缓解患者.1.阴性结果注意：灵敏度,核酸提取及扩增效率.四、结果解释2151.弥补血清学诊断缺陷注意：窗口期,灵敏度,部分特殊病例.五、应用及评价2.不能培养或生长缓慢微生物3.监测疾病状态4.耐药性及分型检测1.弥补血清学诊断缺陷注意：窗口期,灵敏度,部分特殊病例.五16第二节病毒基因检测乙型肝炎病毒（HBV）、人乳头瘤病毒（HPV）：其DNA可以使用点杂交、PCR方法直接检出。丙型肝炎病毒（HCV）、人免疫缺陷病毒（HIV）：其RNA可以使用RT-PCR方法直接检出。第二节病毒基因检测乙型肝炎病毒（HBV）、人乳头瘤病毒（17HBV基因组结构pre-s1pre-s2SPCpre-cX乙肝pre-S1pre-S1蛋白pre-S2pre-S2蛋白SHBsAgpre-CHBeAgCHBcAgPDNAPXHBxAg乙型肝炎病毒基因结构模式分子诊断：信号放大技术；PCR法；耐药性检测HBV基因组结构pre-s1pre-s2SPCpre-cX乙181.弥补血清学检测结果,诊断HBV临床意义2.缩小窗口期,快速诊断3.定量检测,指导病情4.检测耐药,指导用药1.弥补血清学检测结果,诊断HBV临床意义2.缩小窗口期,快19丙型肝炎(HCV)基因诊断实例丙型肝炎为RNA病毒，9500mer，编码3011-3033个氨基酸，具有高变异性。基因组组成：E1NS2NS3NS43’-NCRCNS1/E2NS5B5’-NCR高变异区（编码衣壳和包膜蛋白）（NCR:非编码区）

5’-NCR为保守的区域，将引物设计在该区域，进行RT-PCR,可特异性的扩增HCV。丙型肝炎(HCV)基因诊断实例丙型肝炎为RNA病毒，950020分子检测方法：1.HCV的RNA定性及定量检测RT-PCR,巢式PCR,定量PCR,转录依赖的扩增系统（如TAS）,分支DNA(bDNA)2.HCV基因分型鉴定测序、real-timePCR等

分子检测方法：21感染性疾病的分子诊断课件22感染性疾病的分子诊断课件231.监测临床疗效临床意义2.缩小窗口期,快速诊断3.定量检测4.免疫缺陷补充检测1.监测临床疗效临床意义2.缩小窗口期,快速诊断3.定量检测24H1N1甲型流感H1N1甲型流感25实验室检查外周血象：白细胞总数一般不高或降低。重症患者多有白细胞总数及淋巴细胞减少，并有血小板降低；血清学诊断：可使用间接ELISA、抗原捕捉ELISA、荧光免疫法等；分子诊断？实验室检查外周血象：白细胞总数一般不高或降低。重症患者26分子诊断策略分子诊断策略27第三节病原菌的基因检测耐药菌株的监测:结核分支杆菌耐药基因rpoB金黄色葡萄球菌耐药基因MRSA第三节病原菌的基因检测耐药菌株的监测:28确认的归于此次暴发的最早病例：2008年9月1日至2009年2月22日，发现651例，来自43个州，死亡8例病例-对照调查：与花生酱相关，尤其某些花生酱饼干流行病学和实验室调查发现源头为一个工厂生产的花生酱和花生糊，这些产品同时也是多家食品生产厂家的中间材料。花生酱污染导致的鼠伤寒沙门菌沙门菌暴发，美国，2008-2009确认的归于此次暴发的最早病例：2008年9月1日花生酱污染导29确认的归于此次暴发的最早病例：2008年9月1日至2009年2月22日，发现651例，来自43个州，死亡8例病例-对照调查：与花生酱相关，尤其某些花生酱饼干流行病学和实验室调查发现源头为一个工厂生产的花生酱和花生糊，这些产品同时也是多家食品生产厂家的中间材料。花生酱污染导致的鼠伤寒沙门菌沙门菌暴发，美国，2008-2009确认的归于此次暴发的最早病例：2008年9月1日花生酱污染导30冻肉、蛋品、乳品及其他加工食品鲜肉、鲜蛋、鲜乳或其他未经加工的食品前增菌法25g＋BPW225mL36℃±1℃一般4h，干蛋品18h～24h10mL＋MM（或TTB）100mL10mL＋SC100mL直接增菌法25g＋灭菌生理盐水25mL检样匀液25mL＋MM（或TTB）100mL检样匀液25mL＋SC100mLBSDHL（或HE、WS、SS）TSI（排除A/AH2S－结果），靛基质，尿素，KCN，赖氨酸沙门氏菌血清学试验甘露醇山梨醇H2S＋靛＋尿－KCN－赖＋H2S－靛－尿－KCN－赖＋/－非如左述的各种反应结果沙门氏菌血清学试验ONPG－沙门氏菌非沙门氏菌42℃18h～24h36℃±1℃18h～24h42℃18h～24h36℃±1℃18h～24h36℃±1℃40h～48h36℃±1℃18h～24h

微生物学检验沙门氏菌检验中华人民共和国国家标准GB/T4789.4-2003冻肉、蛋品、乳品及其他加工食品鲜肉、鲜蛋、鲜乳或其他未经加工31样品增菌直接处理选择性培养基增菌DNA提取PCRPCR快速检测致食物中毒的细菌样品增菌直接处理选择性培养基增菌DNA提取PCRPC32MM33DNAmRNA蛋白质转录反转录

翻译

核酸分子杂交

基因结构异常基因表达异常PCR

DNA测序

核酸分子杂交

实时荧光定量PCR

反转录PCR

蛋白质芯片

ELISA

蛋白组织化学染色Western-blot基因芯片

基因诊断的技术和方法DNAmRNA蛋白质转录反转录翻译核酸分子杂交基因结构34感染性疾病的分子诊断课件35

第四代：分子诊断（1978年始）－－病因学诊断

分子诊断第四代：分子诊断（1978年始）分子诊断36感染性疾病的分子诊断课件37基因病类型1、感染性疾病：病原生物的侵入如流感、肝炎、艾滋病2、遗传性疾病：如苯丙酮尿症、血友病等3、复杂性疾病，如肿瘤、原发性高血压

基因病类型1、感染性疾病：38感染性疾病的分子诊断课件39感染性疾病的分子诊断严永敏基础医学与医学技术学院感染性疾病的分子诊断严永敏40第一节诊断策略及诊断方法标本处理病毒的基因检测病原菌的基因检测第一节诊断策略及诊断方法41一般性检出策略和方法

针对特异性的核酸序列进行核酸分子探针杂交，或者利用常规PCR技术直接检出微生物的DNA/RNA，判断有无感染和是何种病原体感染。完整检出策略和方法

按照诊断→分型→亚型→耐药性检测的思路，利用多种基因诊断手段对感染性病原体进行分析。一、分子诊断策略一般性检出策略和方法针对特异性的核酸序列进行42二、分子诊断方法1.信号放大技术（bDNA\杂交捕获系统）支链DNA（bDNA）技术二、分子诊断方法1.信号放大技术（bDNA\杂交捕获系统）支43杂交捕获系统特点：稳定性、重复性、特异性好杂交捕获系统特点：44二、分子诊断方法2.靶分子扩增技术（PCR/TAS/LCR）转录依赖的扩增系统（TAS）二、分子诊断方法2.靶分子扩增技术（PCR/TAS/LCR）45连接酶链反应（LCR）特点：简单、快速、灵敏度高连接酶链反应（LCR）特点：461.标本选择选择原则：符合疾病的发病机制，反映病程标本类型：血浆、血清、全血或白细胞核酸类型：DNA\RNA\miRNA三、标本处理2.标本量、抗凝剂3.标本保存、传送4.标本预处理1.标本选择选择原则：符合疾病的发病机制，反映病程三、标本处471.阴性结果注意：灵敏度,核酸提取及扩增效率.四、结果解释2.阳性结果3.定性检测结果4.疾病状况的判断注意：特异性,可能的污染.注意：病情缓解患者.1.阴性结果注意：灵敏度,核酸提取及扩增效率.四、结果解释2481.弥补血清学诊断缺陷注意：窗口期,灵敏度,部分特殊病例.五、应用及评价2.不能培养或生长缓慢微生物3.监测疾病状态4.耐药性及分型检测1.弥补血清学诊断缺陷注意：窗口期,灵敏度,部分特殊病例.五49第二节病毒基因检测乙型肝炎病毒（HBV）、人乳头瘤病毒（HPV）：其DNA可以使用点杂交、PCR方法直接检出。丙型肝炎病毒（HCV）、人免疫缺陷病毒（HIV）：其RNA可以使用RT-PCR方法直接检出。第二节病毒基因检测乙型肝炎病毒（HBV）、人乳头瘤病毒（50HBV基因组结构pre-s1pre-s2SPCpre-cX乙肝pre-S1pre-S1蛋白pre-S2pre-S2蛋白SHBsAgpre-CHBeAgCHBcAgPDNAPXHBxAg乙型肝炎病毒基因结构模式分子诊断：信号放大技术；PCR法；耐药性检测HBV基因组结构pre-s1pre-s2SPCpre-cX乙511.弥补血清学检测结果,诊断HBV临床意义2.缩小窗口期,快速诊断3.定量检测,指导病情4.检测耐药,指导用药1.弥补血清学检测结果,诊断HBV临床意义2.缩小窗口期,快52丙型肝炎(HCV)基因诊断实例丙型肝炎为RNA病毒，9500mer，编码3011-3033个氨基酸，具有高变异性。基因组组成：E1NS2NS3NS43’-NCRCNS1/E2NS5B5’-NCR高变异区（编码衣壳和包膜蛋白）（NCR:非编码区）

5’-NCR为保守的区域，将引物设计在该区域，进行RT-PCR,可特异性的扩增HCV。丙型肝炎(HCV)基因诊断实例丙型肝炎为RNA病毒，950053分子检测方法：1.HCV的RNA定性及定量检测RT-PCR,巢式PCR,定量PCR,转录依赖的扩增系统（如TAS）,分支DNA(bDNA)2.HCV基因分型鉴定测序、real-timePCR等

分子检测方法：54感染性疾病的分子诊断课件55感染性疾病的分子诊断课件561.监测临床疗效临床意义2.缩小窗口期,快速诊断3.定量检测4.免疫缺陷补充检测1.监测临床疗效临床意义2.缩小窗口期,快速诊断3.定量检测57H1N1甲型流感H1N1甲型流感58实验室检查外周血象：白细胞总数一般不高或降低。重症患者多有白细胞总数及淋巴细胞减少，并有血小板降低；血清学诊断：可使用间接ELISA、抗原捕捉ELISA、荧光免疫法等；分子诊断？实验室检查外周血象：白细胞总数一般不高或降低。重症患者59分子诊断策略分子诊断策略60第三节病原菌的基因检测耐药菌株的监测:结核分支杆菌耐药基因rpoB金黄色葡萄球菌耐药基因MRSA第三节病原菌的基因检测耐药菌株的监测:61确认的归于此次暴发的最早病例：2008年9月1日至2009年2月22日，发现651例，来自43个州，死亡8例病例-对照调查：与花生酱相关，尤其某些花生酱饼干流行病学和实验室调查发现源头为一个工厂生产的花生酱和花生糊，这些产品同时也是多家食品生产厂家的中间材料。花生酱污染导致的鼠伤寒沙门菌沙门菌暴发，美国，2008-2009确认的归于此次暴发的最早病例：2008年9月1日花生酱污染导62确认的归于此次暴发的最早病例：2008年9月1日至2009年2月22日，发现651例，来自43个州，死亡8例病例-对照调查：与花生酱相关，尤其某些花生酱饼干流行病学和实验室调查发现源头为一个工厂生产的花生酱和花生糊，这些产品同时也是多家食品生产厂家的中间材料。花生酱污染导致的鼠