生命科学导论课件

第九章现代生命科学的革命-生物技术第九章现代生命科学的革命19.1生物技术定义、主要内容和发展概况9.2基因工程9.3蛋白质工程、发酵工程和细胞工程简介9.4分子诊断和基因治疗9.5克隆技术9.6生物芯片技术9.7生物技术的安全性和社会伦理问题9.1生物技术定义、主要内容和发展概况2生物科学成为当今世界自然科学的热点和重点，主要由于两方面的原因：

（1）二十世纪后叶，分子生物学领域一系列突破性成就，使生命科学在自然科学中的地位发生了革命性的变化；

（2）建立在实验室研究基础上的生物技术的发展为人类带来了巨大的利益和财富。生物技术将是未来经济发展的新动力 第一次技术革命 工业革命 解放人的双手 第二次技术革命 信息技术 扩展人的大脑 第三次技术革命 生物技术 改造生命本身生物科学成为当今世界自然科学的热点和重点，主要由于两方面的原3生物技术的显著特点

高技术（精细和密集的复杂技术）

高投入（尤其是前期科研投入高）

高利润生物技术的显著特点

高技术（精细和密集的复杂技术）

高投入（41982年，国际合作与发展组织的定义为：生物技术是应用自然科学及工程学的原理，依靠微生物、动物、植物体作为反应器将物料进行加工以提供产品为社会服务的技术。美国政府技术顾问委员会(OAT)的定义是：应用生物或来自生物体的物质制造或改进一种商品的技术，其还包括改良有重要经济价值的植物与动物和利用微生物改良环境的技术。该定义强调了生物技术的商品属性。克隆羊“多莉”9.1生物技术定义、主要内容和发展概况生物技术的定义1982年，国际合作与发展组织的定义为：生物技术是应用自然科5基因工程、细胞工程、发酵工程、蛋白质（酶）工程

此外还有基因诊断与基因治疗技术、克隆动物技术、生物芯片技术、生物材料技术、生物能源技术、利用生物降解环境中有毒有害化合物的技术直接相关联的学科：分子生物学、微生物学、生物化学、遗传学、细胞生物学、化学工程学、医药学等。对人类和社会生活各方面影响最大的生物技术领域：

农业生物技术、医药生物技术、环境生物技术、海洋生物技术生物技术的主要内容基因工程、细胞工程、发酵工程、蛋白质（酶）工程

此外还有基因6基因工程是指在微观领域（分子水平）中，根据分子生物学和遗传学原理，设计并实施一项把一个生物体中有用的目的DNA(遗传信息)转入另一个生物体中，使后者获得新的需要的遗传性状或表达所需要的产物，最终实现该技术的商业价值。9.2基因工程基因工程与建筑工程基因工程是指在微观领域（分子水平）中，根据分子生物学和遗传学7重组DNA技术的重大突破带动了现代生物技术的兴起，并很快产生了许多生命科学的高技术产业。重组DNA技术，又称为基因或分子克隆技术，是基因工程的核心技术。该技术包括了一系列的分子生物学操作步骤。基因工程的核心技术—重组DNA技术重组DNA技术的重大突破带动了现代生物技术的兴起，并很快产生8重组DNA操作一般步骤：（1）获得目的基因；（2）与克隆载体连接，形成新的重组DNA分子；（3）用重组DNA分子转化受体细胞，并能在受体细胞中复制和遗传；（4）对转化子筛选和鉴定；（5）对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。重组DNA操作一般步骤：（1）获得目的基因；9获得需要的目的基因（外源基因）获得需要的目的基因常用的方法：（1）直接从生物体中提取总DNA，构建基因文库(genelibrary)，从中调用目的基因；（2）以mRNA为模板，反转录合成互补的DNA片段；（3）利用聚合酶链式反应（PCR）特异性地扩增所需要的目的基因片段，等等。获得需要的目的基因（外源基因）获得需要的目的基因常用的方法：10

细胞内总DNA的提取分离与基因文库的构建细胞内总DNA的提取分离程序细胞内总DNA的提取分离与基因文库的构建细胞内总DN11紫外分光光度计测定DNA溶液的纯度和浓度。紫外分光光度计测定DNA溶液的纯度和浓度。12

基因文库的构建将总DNA包含的基因组各片段分别克隆在质粒或噬菌体载体上，便构成了该生物的基因文库。基因文库的构建13

反转录人工合成互补DNA构建基因文库获取目的基因存在的问题——

费时费事 内含子序列反转录人工合成互补DNA方法的优势——获取的DNA片段往往是具有特定功能的目的基因反转录人工合成互补DNA构建基因文库获取目的基因存在的问14

聚合酶链式反应（PCR）PCR技术就是在体外中通过酶促反应有选择地大量扩增（包括分离）一段目的基因的技术。加入4种物质：

（1）作为模板的DNA序列；

（2）与被分离的目的基因两条链各自5’端序列相互补的DNA引物（20个左右碱基的短DNA单链）；

（3）TaqDNA聚合酶；

（4）dNTP（dATP,dTTP,dGTP和dCTP）。聚合酶链式反应（PCR）PCR技术就是在体外中通过酶促反15变性、退火、延伸三步曲。变性：双链DNA解链成为单链DNA退火：部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合延伸：以目的基因为模板，合成互补的新DNA链变性、退火、延伸三步曲。变性：双链DNA解链成为单链DNA16每一轮聚合酶链式反应可使目的基因片段增加一倍。30轮循环可获得——230（1.07×109)个基因片段每一轮聚合酶链式反应可使目的基因片段增加一倍。30轮循环可获17PCR技术的发明PCR的发明是DNA操作技术的革命美国Mullis教授开汽车时的联想

逶迤崎岖的山路——DNA双螺旋行驶的汽车——一小段DNA引物……1988年发明了PCR技术1993年获得诺贝尔奖PCR技术的发明PCR的发明是DNA操作技术的革命逶迤18构建重组质粒和基因克隆基因重组和克隆操作最重要的工具是限制性内切酶、载体和宿主菌。微量的目的基因必须经过基因克隆获得大量的拷贝后，才能实现进一步的重组、转化和表达等操作。限制性内切酶限制性内切酶是从细菌中分离提纯的核酸内切酶，可以识别并切开核酸序列特定位点——分子手术刀Arber、Smith和Nathans因为在发现限制性内切酶方面开创性工作而共同获得了1978年的诺贝尔奖。构建重组质粒和基因克隆基因重组和克隆操作最重要的工具是限制性19已经发现和鉴定了200多种EcoRI特异识别GAATTC及其互补碱基组成的双链片段粘性末端T4连接酶已经发现和鉴定了200多种EcoRI特异识别GAATTC及其20载体载体是运送目的基因片段进入宿主细胞的工具，目前最常用的载体包括细菌质粒、l噬菌体、cosmid质粒等。质粒是细菌细胞中自然存在于染色体外可以自主复制的一段环状DNA分子。进入到宿主细胞中的一个质粒可以大量增加其拷贝数。载体载体是运送目的基因片段进入宿主细胞的工具，目前最常用211．该质粒比较小，可以插入一段较长的DNA片段。2．进入宿主细菌细胞后，pUC18在每个细胞中可复制形成大约500个拷贝。3．在pUC18中有一小段人为设计和插入的具有多种限制性酶切位点的序列，即多克隆位点细菌质粒pUC181．该质粒比较小，可以插入一段较长的DNA片段。细菌质粒p22

pUC118质粒的多克隆位点整合在lacZ基因中，该位点如果没有插入外源目的基因，lacZ基因便可表达出半乳糖苷酶，如果平板培养基中含有IPTG和X-gal，X-gal便会被半乳糖苷酶水解成兰色，大肠杆菌形成蓝色克隆。在多克隆位点插入外源目的基因，破坏了lacZ基因的结构，大肠杆菌形成白色的克隆4．利用lacZ基因的插入失活筛选重组质粒5．pUC18还携带了氨卞青霉素抗性基因，可筛选重组质粒。pUC118质粒的多克隆位点整合在lacZ23

以大肠杆菌为宿主菌进行基因的克隆将目的基因克隆到大肠杆菌细胞中的操作步骤：1．获得目的基因和质粒载体；2．形成重组质粒；3．制备感受态细胞，用重组质粒转化大肠杆菌细胞；4．培养大肠杆菌，让重组质粒及外源目的基因形成大量拷贝；5．筛选含重组质粒的大肠杆菌细胞，进行检查或鉴定。以大肠杆菌为宿主菌进行基因的克隆将目的基因克隆到大肠杆24

一般克隆基因的检查和鉴定方法琼脂糖凝胶电泳分离鉴定大小不等的酶解片段：磷酸基团带负电荷酶解片段向阳极移动电场驱动力和凝胶阻力——不同迁移率分子量标准参照物酶切和电泳方法一般克隆基因的检查和鉴定方法琼脂糖凝胶电泳分离鉴定大小2532P标记的DNA分子探针杂交放射自显影法DNA杂交直接鉴定32P标记的DNA分子探针DNA杂交直接鉴定26转化受体细胞和转化子的筛选基因克隆获得大量目的基因后，就要使其在合适的宿主细胞中表达，产生需要的基因表达产物或使宿主生物具备所需的性状，同时目的基因还能在宿主细胞中稳定遗传。这一过程就是遗传转化。若需要让克隆的基因表达和产生大量编码蛋白，可对转化的大肠杆菌进行培养使目的基因大量表达和积累。对表达产物分离纯化便可获得想要的产品。通过DNA体外重组技术构建的重组质粒还可以直接用以转化蓝藻等原核生物或其他一些原生生物。转化受体细胞和转化子的筛选基因克隆获得大量目的基因后，就要使27构建缺失chlL基因的蓝细菌突变株构建缺失chlL基因的蓝细菌突变株28遗传转化常用的方法载体法转化——农杆菌介导法基因的直接转移（1）高压电脉冲电激穿孔（2）基因枪法（3）微注射法遗传转化常用的方法载体法转化——农杆菌介导法29转化子的分析—Southern杂交纪念发明者EdwardSouthern（1）提取总DNA（2）酶解（3）电泳（4）转移到滤膜（5）变性解链（6）DNA探针及杂交（7）洗脱（8）放射自显影（9）比较分析转化子的分析—Southern杂交纪念发明者EdwardS30Southern杂交分析示例

A.DNA体外重组实验B.抗生素筛选转化子细胞C.培养突变株细胞D.Southern杂交实验结果显示，外源目的基因已经转入突变株细胞中1973年，由美国斯坦福大学教授Cohn和美国加州大学教授Boyer带领各自的研究组几乎同时分别完成了DNA体外重组，一举打开了基因工程学大门。Southern杂交分析示例A.DNA体外重组实验19731稀少珍贵的蛋白质药物1982年，美国食品与药物管理局批准了首例基因工程产品—人胰岛素投放市场——它标志了基因工程产品正式进入到商业化阶段。人生长激素、表皮生长因子、肿瘤坏死因子、a-干扰素、纤维素酶、抗血友病因子、红细胞生成素、尿激酶原、白细胞介素-2、集落刺激因子、乙肝疫苗等等。基因工程的应用稀少珍贵的蛋白质药物1982年，美国食品与药物管理局批准32畜牧业中的应用动物疫苗、生长激素等。例：从转基因羊的羊奶中提取出治疗心脏病的药物tPA。畜牧业中的应用动物疫苗、生长激素等。例：从转基因羊的羊奶33种植业中的应用用携带外源基因的农杆菌Ti质粒转化植物原生质体，使外源DNA与植物染色体DNA整合，通过原生质体的培养分化成愈伤组织，最后发育成具有新性状的完整植株—转基因植物种植业中的应用用携带外源基因的农杆菌Ti质粒转化植物原生34种植业中的应用抗化学除草剂基因转基因西红柿固氮酶基因人类DNA……环境保护等等种植业中的应用抗化学除草剂基因环境保护等等35“后基因组时代”将是“蛋白质组学时代”，即从对基因信息的研究转向对蛋白质信息的研究，包括研究蛋白质结构、功能与应用及蛋白质相互关系和作用。蛋白质工程就是在对蛋白质的化学、晶体学、动力学等结构与功能认识的基础上，对蛋白质人工改造与合成，最终获得商业化的产品。9.3蛋白质工程、发酵工程和细胞工程简介蛋白质工程“后基因组时代”将是“蛋白质组学时代”，即从对基因信息的研究36蛋白质工程的主要步骤通常包括：（1）从生物体中分离纯化目的蛋白；（2）测定其氨基酸序列；（3）借助核磁共振和X射线晶体衍射等手段，尽可能地了解蛋白质的二维重组和三维晶体结构;蛋白质工程（4）设计各种处理条件，了解蛋白质的结构变化，包括折叠与去折叠等对其活性与功能的影响；（5）设计编码该蛋白的基因改造方案，如点突变；（6）分离、纯化新蛋白，功能检测后投入实际使用。蛋白质工程的主要步骤通常包括：蛋白质工程（4）设计各种处理37现代发酵工程主要指利用微生物、包括利用DNA重组技术改造的微生物在全自动发酵罐或生物反应器中生产某种商品的技术。现代发酵工程是生物代谢、微生物生长动力学、大型发酵罐或生物反应器研制、化工原理等密切结合和应用的结果。发酵工程现代发酵工程主要指利用微生物、包括利用DNA重组技术改造的微38细胞工程是指通过细胞水平上的筛选或改造，获得有商业价值的细胞株或细胞系，再通过规模培养，获得特殊商品的技术与过程。细胞工程包括动物细胞工程和植物细胞工程，它们分别以动物细胞和植物细胞为主要生产对象，以细胞培养为主要过程和内容。细胞工程细胞工程是指通过细胞水平上的筛选或改造，获得有商业价值的细胞39动物细胞培养细胞工程动物细胞培养细胞工程40单细胞藻类培养细胞工程一些单细胞低等植物如单细胞藻类的大规模培养成为细胞工程的重要组成部分获得蛋白质资源、营养食品、精细化工产品等等单细胞藻类培养细胞工程一些单细胞低等植物如单细胞藻类的大规41高等植物细胞培养细胞工程高等植物细胞具有全能性。从高等植物的幼胚、根、茎、叶、花和果实等不同器官的组织中分离的单个细胞，经过特殊培养形成愈伤组织，并可进一步诱导生成完整的植株。高等植物细胞培养细胞工程高等植物细胞具有全能性。从高等植物42细胞融合、细胞重组、杂交瘤技术细胞工程细胞融合是将不同种类的两种细胞经过特殊处理后放在一起，在某些促融因子作用下发生融合，形成杂种细胞。细胞重组是把不同种类的细胞的部件重新组合装配，包括核的移植、叶绿体移植、核糖体重建及线粒体装配等。杂交瘤技术是通过细胞融合产生特异杂交瘤细胞。细胞融合、细胞重组、杂交瘤技术细胞工程细胞融合是将不同种类439.4分子诊断和基因治疗分子诊断利用PCR技术或PCR与分子杂交标记相结合，可以快速准确地检测出病原性物质。9.4分子诊断和基因治疗分子诊断利用PCR技术或PCR与44分子诊断遗传性疾病的诊断羊水和胎盘绒毛膜检测分子诊断遗传性疾病的诊断羊水和胎盘绒毛膜检测45分子诊断例：镰状红细胞贫血症的检测一种常染色体退化遗传病引起原因：基因的点突变，丢失了可被MstII或Cvnl切开的一个限制性内切酶位点。正常：三条带患病：一条带子女1：正常子女2：患病子女3：携带者分子诊断例：镰状红细胞贫血症的检测一种常染色体退化遗传病正46例：特异性互补寡核苷酸法检测镰状红细胞贫血症（1）提取DNA，热处理成为单链DNA；（2）以单链DNA为模板，仅对可能发生突变的核苷酸区域设计引物进行PCR扩增后转移到滤膜上，热变性成单链；（3）分别用两种特异性互补寡核苷酸分子探针（ASO）杂交。例：特异性互补寡核苷酸法检测镰状红细胞贫血症（1）提取DNA47基因治疗正常的人类基因可以克隆并引入遗传病患者的体细胞，以替代、修复或纠正有缺陷的基因。通常使用一种反转录病毒作为基因治疗的转移系统，重组载体可以感染人的组织和细胞，但不自我复制。基因治疗正常的人类基因可以克隆并引入遗传病患者的体细胞，以48例：重症综合性免疫缺乏症（SCID）1990年，转基因T淋巴细胞注射到人体骨髓组织中治疗SCID。例：重症综合性免疫缺乏症（SCID）1990年499.5克隆技术1997年2月23日苏格兰Roslin研究所 Wilmut和Campbell《Nature》杂志： 世界首例来源于哺乳动物体细胞的克隆羊“多莉”问世核移植，就是利用一个动物的体细胞的细胞核（供体核）来取代受精或未受精卵中的细胞核，形成一个重建的“合子”。克隆原意是无性繁殖系。克隆动物就是不经过生殖细胞的受精过程而直接由体细胞获得新的动物个体，这个新个体是原核供体动物的拷贝。9.5克隆技术1997年2月23日苏格兰Roslin研50277次乳腺细胞核移植实验；获得29个发育为8细胞的“胚”；13头代孕母亲；1996年7月5日，羊羔6LL3，被命名为“多莉”。277次乳腺细胞核移植实验；51（1）既然绵羊的体细胞可以被成功地克隆成一个新的个体，是否意味着人类也可以克隆自己呢？（2）是否应该允许进行克隆人的实验？（1）既然绵羊的体细胞可以被成功地克隆成一个新的个体，是否意529.6生物芯片技术生物芯片又称DNA芯片或基因芯片，它们是DNA杂交探针技术与半导体工业技术相结合的结晶。该技术系指将大量探针分子固定于支持物上后与带荧光标记的DNA样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。1996年底，美国Affymetrix结合照相平板印刷、计算机、半导体、寡核苷酸合成、荧光标记、核酸探针分子杂交和激光共聚扫描等高新技术，研制创造了世界第一块DNA芯片。生物芯片技术的一般原理9.6生物芯片技术生物芯片又称DNA芯片或基因芯片，它们是53A.用于微阵列芯片制作的点样仪。；B.封装在卡盒中的微阵列芯片;C.用于微阵列芯片荧光标记检测的激光共聚焦扫描器；D.微阵列芯片的局部放大；E.微阵列芯片上固定DNA探针的示意图。图中蓝色的DNA链是预先固定在芯片表面的捕获探针，红色的DNA链是与捕获探针互补的靶DNA分子。A.用于微阵列芯片制作的点样仪。；B.封装在卡盒中的微54DNA芯片可用于大规模筛查基因突变所引起的疾病；分析基因组及发现新基因等具有很大的优势； DNA芯片技术用于基因组分析时，具有样品用量小、信息量大、分析方法简易快速、自动化程度高等多项优点，特别适合于寻找新基因、基因表达检测、突变检测、基因组多态性分析和基因文库作图以及杂交测序等方面。医学、化学、新药开发、司法鉴定、农业技术和食品技术领域也具有广泛的应用；生物芯片技术的主要应用1998年底，美国科学促进会将基因芯片技术列为1998年度自然科学领域十大进展之一。一些科学家把基因芯片称为“可以随身携带的微型实验室”。DNA芯片可用于大规模筛查基因突变所引起的疾病；生物芯片技559.7生物技术的安全性和社会伦理问题基因一旦被改动，一方面可能引起生物体内一系列未知的结构与功能的变化；另一方面，转基因操作对生物体的影响会通过遗传传递。转基因技术的安全性问题外源基因引入后，是否会影响其他重要的调节基因，甚至会激活原癌基因？转基因技术的广泛应用是否会导致难以消灭的新病原物出现？是否会造成生态学灾难？人类摄食大量转基因食品是否会影响人类及其后代的健康？9.7生物技术的安全性和社会伦理问题基因一旦被改动，一方面56克隆人的伦理问题在克隆阶段，如果有关胚胎发育的基因重新编排或启动不完全，对新生儿可能产生什么严重后果呢？兄弟、姐妹、父母、子女？器官克隆和干细胞培养和分化器官，用于医学和临床治疗？个人基因信息的隐私权问题人类基因信息利用的伦理、法律和社会影响计划，称之为ELSI项目： （1）在应用和解释基因信息时的隐私权和公正性； （2）基因信息由实验室研究向实际医疗应用的转化； （3）人类基因组计划参与者相互协调和成果发布； （4）公众与专业教育。克隆人的伦理问题在克隆阶段，如果有关胚胎发育的基因重新编排57基因治疗的应用问题一个人有权决定另一个人的基因结构或未来命运吗？万一这种基因操作失败了或者造成了将来才能发现的不可挽回的缺陷和后果，谁承当责任呢？是否可以通过基因治疗操作来增加运动员的身高或短跑速度，这与运动员服用兴奋剂有什么本质区别？生物技术引发的其它问题生物技术费用高，在自身健康上的贫富差距？涉及人类自身发展的重要生物技术的垄断？生物武器？……基因治疗的应用问题一个人有权决定另一个人的基因结构或未来命58生物技术是“应用生物或来自生物体的物质制造或改进一种商品的技术，其还包括改良有重要经济价值的植物与动物和利用微生物改良环境的技术”，通常包括基因工程、细胞工程、发酵工程和蛋白质（酶）工程4个方面内容。高技术、高投入、高利润是生物技术的显著特点。

以重组DNA操作为核心技术的过程被称为基因工程。基因工程的发展带动和促进了蛋白质工程、发酵工程和细胞工程的发展，它们相互补充和相互渗透，形成了生物技术的上游与下游的关系。

分子诊断是利用分子生物学的手段如PCR、限制性酶切、克隆、核酸杂交等对多种疾病、特别是对遗传性疾病作出早期诊断的技术。利用基因工程技术来治疗人类遗传性疾病称为基因治疗。

克隆动物是不经过生殖细胞的受精过程而直接由体细胞获得新的动物个体。生物芯片又称DNA芯片或基因芯片，它们是DNA杂交探针技术与半导体工业技术相结合的结晶。

转基因技术的安全性问题、克隆人的伦理问题、个人基因信息的隐私权问题、等等都是当今人类面临的由生物技术引发的新问题。本章摘要生物技术是“应用生物或来自生物体的物质制造或改进一种商品的技59第九章现代生命科学的革命-生物技术第九章现代生命科学的革命609.1生物技术定义、主要内容和发展概况9.2基因工程9.3蛋白质工程、发酵工程和细胞工程简介9.4分子诊断和基因治疗9.5克隆技术9.6生物芯片技术9.7生物技术的安全性和社会伦理问题9.1生物技术定义、主要内容和发展概况61生物科学成为当今世界自然科学的热点和重点，主要由于两方面的原因：

（1）二十世纪后叶，分子生物学领域一系列突破性成就，使生命科学在自然科学中的地位发生了革命性的变化；

（2）建立在实验室研究基础上的生物技术的发展为人类带来了巨大的利益和财富。生物技术将是未来经济发展的新动力 第一次技术革命 工业革命 解放人的双手 第二次技术革命 信息技术 扩展人的大脑 第三次技术革命 生物技术 改造生命本身生物科学成为当今世界自然科学的热点和重点，主要由于两方面的原62生物技术的显著特点

高技术（精细和密集的复杂技术）

高投入（尤其是前期科研投入高）

高利润生物技术的显著特点

高技术（精细和密集的复杂技术）

高投入（631982年，国际合作与发展组织的定义为：生物技术是应用自然科学及工程学的原理，依靠微生物、动物、植物体作为反应器将物料进行加工以提供产品为社会服务的技术。美国政府技术顾问委员会(OAT)的定义是：应用生物或来自生物体的物质制造或改进一种商品的技术，其还包括改良有重要经济价值的植物与动物和利用微生物改良环境的技术。该定义强调了生物技术的商品属性。克隆羊“多莉”9.1生物技术定义、主要内容和发展概况生物技术的定义1982年，国际合作与发展组织的定义为：生物技术是应用自然科64基因工程、细胞工程、发酵工程、蛋白质（酶）工程

此外还有基因诊断与基因治疗技术、克隆动物技术、生物芯片技术、生物材料技术、生物能源技术、利用生物降解环境中有毒有害化合物的技术直接相关联的学科：分子生物学、微生物学、生物化学、遗传学、细胞生物学、化学工程学、医药学等。对人类和社会生活各方面影响最大的生物技术领域：

农业生物技术、医药生物技术、环境生物技术、海洋生物技术生物技术的主要内容基因工程、细胞工程、发酵工程、蛋白质（酶）工程

此外还有基因65基因工程是指在微观领域（分子水平）中，根据分子生物学和遗传学原理，设计并实施一项把一个生物体中有用的目的DNA(遗传信息)转入另一个生物体中，使后者获得新的需要的遗传性状或表达所需要的产物，最终实现该技术的商业价值。9.2基因工程基因工程与建筑工程基因工程是指在微观领域（分子水平）中，根据分子生物学和遗传学66重组DNA技术的重大突破带动了现代生物技术的兴起，并很快产生了许多生命科学的高技术产业。重组DNA技术，又称为基因或分子克隆技术，是基因工程的核心技术。该技术包括了一系列的分子生物学操作步骤。基因工程的核心技术—重组DNA技术重组DNA技术的重大突破带动了现代生物技术的兴起，并很快产生67重组DNA操作一般步骤：（1）获得目的基因；（2）与克隆载体连接，形成新的重组DNA分子；（3）用重组DNA分子转化受体细胞，并能在受体细胞中复制和遗传；（4）对转化子筛选和鉴定；（5）对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。重组DNA操作一般步骤：（1）获得目的基因；68获得需要的目的基因（外源基因）获得需要的目的基因常用的方法：（1）直接从生物体中提取总DNA，构建基因文库(genelibrary)，从中调用目的基因；（2）以mRNA为模板，反转录合成互补的DNA片段；（3）利用聚合酶链式反应（PCR）特异性地扩增所需要的目的基因片段，等等。获得需要的目的基因（外源基因）获得需要的目的基因常用的方法：69

细胞内总DNA的提取分离与基因文库的构建细胞内总DNA的提取分离程序细胞内总DNA的提取分离与基因文库的构建细胞内总DN70紫外分光光度计测定DNA溶液的纯度和浓度。紫外分光光度计测定DNA溶液的纯度和浓度。71

基因文库的构建将总DNA包含的基因组各片段分别克隆在质粒或噬菌体载体上，便构成了该生物的基因文库。基因文库的构建72

反转录人工合成互补DNA构建基因文库获取目的基因存在的问题——

费时费事 内含子序列反转录人工合成互补DNA方法的优势——获取的DNA片段往往是具有特定功能的目的基因反转录人工合成互补DNA构建基因文库获取目的基因存在的问73

聚合酶链式反应（PCR）PCR技术就是在体外中通过酶促反应有选择地大量扩增（包括分离）一段目的基因的技术。加入4种物质：

（1）作为模板的DNA序列；

（2）与被分离的目的基因两条链各自5’端序列相互补的DNA引物（20个左右碱基的短DNA单链）；

（3）TaqDNA聚合酶；

（4）dNTP（dATP,dTTP,dGTP和dCTP）。聚合酶链式反应（PCR）PCR技术就是在体外中通过酶促反74变性、退火、延伸三步曲。变性：双链DNA解链成为单链DNA退火：部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合延伸：以目的基因为模板，合成互补的新DNA链变性、退火、延伸三步曲。变性：双链DNA解链成为单链DNA75每一轮聚合酶链式反应可使目的基因片段增加一倍。30轮循环可获得——230（1.07×109)个基因片段每一轮聚合酶链式反应可使目的基因片段增加一倍。30轮循环可获76PCR技术的发明PCR的发明是DNA操作技术的革命美国Mullis教授开汽车时的联想

逶迤崎岖的山路——DNA双螺旋行驶的汽车——一小段DNA引物……1988年发明了PCR技术1993年获得诺贝尔奖PCR技术的发明PCR的发明是DNA操作技术的革命逶迤77构建重组质粒和基因克隆基因重组和克隆操作最重要的工具是限制性内切酶、载体和宿主菌。微量的目的基因必须经过基因克隆获得大量的拷贝后，才能实现进一步的重组、转化和表达等操作。限制性内切酶限制性内切酶是从细菌中分离提纯的核酸内切酶，可以识别并切开核酸序列特定位点——分子手术刀Arber、Smith和Nathans因为在发现限制性内切酶方面开创性工作而共同获得了1978年的诺贝尔奖。构建重组质粒和基因克隆基因重组和克隆操作最重要的工具是限制性78已经发现和鉴定了200多种EcoRI特异识别GAATTC及其互补碱基组成的双链片段粘性末端T4连接酶已经发现和鉴定了200多种EcoRI特异识别GAATTC及其79载体载体是运送目的基因片段进入宿主细胞的工具，目前最常用的载体包括细菌质粒、l噬菌体、cosmid质粒等。质粒是细菌细胞中自然存在于染色体外可以自主复制的一段环状DNA分子。进入到宿主细胞中的一个质粒可以大量增加其拷贝数。载体载体是运送目的基因片段进入宿主细胞的工具，目前最常用801．该质粒比较小，可以插入一段较长的DNA片段。2．进入宿主细菌细胞后，pUC18在每个细胞中可复制形成大约500个拷贝。3．在pUC18中有一小段人为设计和插入的具有多种限制性酶切位点的序列，即多克隆位点细菌质粒pUC181．该质粒比较小，可以插入一段较长的DNA片段。细菌质粒p81

pUC118质粒的多克隆位点整合在lacZ基因中，该位点如果没有插入外源目的基因，lacZ基因便可表达出半乳糖苷酶，如果平板培养基中含有IPTG和X-gal，X-gal便会被半乳糖苷酶水解成兰色，大肠杆菌形成蓝色克隆。在多克隆位点插入外源目的基因，破坏了lacZ基因的结构，大肠杆菌形成白色的克隆4．利用lacZ基因的插入失活筛选重组质粒5．pUC18还携带了氨卞青霉素抗性基因，可筛选重组质粒。pUC118质粒的多克隆位点整合在lacZ82

以大肠杆菌为宿主菌进行基因的克隆将目的基因克隆到大肠杆菌细胞中的操作步骤：1．获得目的基因和质粒载体；2．形成重组质粒；3．制备感受态细胞，用重组质粒转化大肠杆菌细胞；4．培养大肠杆菌，让重组质粒及外源目的基因形成大量拷贝；5．筛选含重组质粒的大肠杆菌细胞，进行检查或鉴定。以大肠杆菌为宿主菌进行基因的克隆将目的基因克隆到大肠杆83

一般克隆基因的检查和鉴定方法琼脂糖凝胶电泳分离鉴定大小不等的酶解片段：磷酸基团带负电荷酶解片段向阳极移动电场驱动力和凝胶阻力——不同迁移率分子量标准参照物酶切和电泳方法一般克隆基因的检查和鉴定方法琼脂糖凝胶电泳分离鉴定大小8432P标记的DNA分子探针杂交放射自显影法DNA杂交直接鉴定32P标记的DNA分子探针DNA杂交直接鉴定85转化受体细胞和转化子的筛选基因克隆获得大量目的基因后，就要使其在合适的宿主细胞中表达，产生需要的基因表达产物或使宿主生物具备所需的性状，同时目的基因还能在宿主细胞中稳定遗传。这一过程就是遗传转化。若需要让克隆的基因表达和产生大量编码蛋白，可对转化的大肠杆菌进行培养使目的基因大量表达和积累。对表达产物分离纯化便可获得想要的产品。通过DNA体外重组技术构建的重组质粒还可以直接用以转化蓝藻等原核生物或其他一些原生生物。转化受体细胞和转化子的筛选基因克隆获得大量目的基因后，就要使86构建缺失chlL基因的蓝细菌突变株构建缺失chlL基因的蓝细菌突变株87遗传转化常用的方法载体法转化——农杆菌介导法基因的直接转移（1）高压电脉冲电激穿孔（2）基因枪法（3）微注射法遗传转化常用的方法载体法转化——农杆菌介导法88转化子的分析—Southern杂交纪念发明者EdwardSouthern（1）提取总DNA（2）酶解（3）电泳（4）转移到滤膜（5）变性解链（6）DNA探针及杂交（7）洗脱（8）放射自显影（9）比较分析转化子的分析—Southern杂交纪念发明者EdwardS89Southern杂交分析示例

A.DNA体外重组实验B.抗生素筛选转化子细胞C.培养突变株细胞D.Southern杂交实验结果显示，外源目的基因已经转入突变株细胞中1973年，由美国斯坦福大学教授Cohn和美国加州大学教授Boyer带领各自的研究组几乎同时分别完成了DNA体外重组，一举打开了基因工程学大门。Southern杂交分析示例A.DNA体外重组实验19790稀少珍贵的蛋白质药物1982年，美国食品与药物管理局批准了首例基因工程产品—人胰岛素投放市场——它标志了基因工程产品正式进入到商业化阶段。人生长激素、表皮生长因子、肿瘤坏死因子、a-干扰素、纤维素酶、抗血友病因子、红细胞生成素、尿激酶原、白细胞介素-2、集落刺激因子、乙肝疫苗等等。基因工程的应用稀少珍贵的蛋白质药物1982年，美国食品与药物管理局批准91畜牧业中的应用动物疫苗、生长激素等。例：从转基因羊的羊奶中提取出治疗心脏病的药物tPA。畜牧业中的应用动物疫苗、生长激素等。例：从转基因羊的羊奶92种植业中的应用用携带外源基因的农杆菌Ti质粒转化植物原生质体，使外源DNA与植物染色体DNA整合，通过原生质体的培养分化成愈伤组织，最后发育成具有新性状的完整植株—转基因植物种植业中的应用用携带外源基因的农杆菌Ti质粒转化植物原生93种植业中的应用抗化学除草剂基因转基因西红柿固氮酶基因人类DNA……环境保护等等种植业中的应用抗化学除草剂基因环境保护等等94“后基因组时代”将是“蛋白质组学时代”，即从对基因信息的研究转向对蛋白质信息的研究，包括研究蛋白质结构、功能与应用及蛋白质相互关系和作用。蛋白质工程就是在对蛋白质的化学、晶体学、动力学等结构与功能认识的基础上，对蛋白质人工改造与合成，最终获得商业化的产品。9.3蛋白质工程、发酵工程和细胞工程简介蛋白质工程“后基因组时代”将是“蛋白质组学时代”，即从对基因信息的研究95蛋白质工程的主要步骤通常包括：（1）从生物体中分离纯化目的蛋白；（2）测定其氨基酸序列；（3）借助核磁共振和X射线晶体衍射等手段，尽可能地了解蛋白质的二维重组和三维晶体结构;蛋白质工程（4）设计各种处理条件，了解蛋白质的结构变化，包括折叠与去折叠等对其活性与功能的影响；（5）设计编码该蛋白的基因改造方案，如点突变；（6）分离、纯化新蛋白，功能检测后投入实际使用。蛋白质工程的主要步骤通常包括：蛋白质工程（4）设计各种处理96现代发酵工程主要指利用微生物、包括利用DNA重组技术改造的微生物在全自动发酵罐或生物反应器中生产某种商品的技术。现代发酵工程是生物代谢、微生物生长动力学、大型发酵罐或生物反应器研制、化工原理等密切结合和应用的结果。发酵工程现代发酵工程主要指利用微生物、包括利用DNA重组技术改造的微97细胞工程是指通过细胞水平上的筛选或改造，获得有商业价值的细胞株或细胞系，再通过规模培养，获得特殊商品的技术与过程。细胞工程包括动物细胞工程和植物细胞工程，它们分别以动物细胞和植物细胞为主要生产对象，以细胞培养为主要过程和内容。细胞工程细胞工程是指通过细胞水平上的筛选或改造，获得有商业价值的细胞98动物细胞培养细胞工程动物细胞培养细胞工程99单细胞藻类培养细胞工程一些单细胞低等植物如单细胞藻类的大规模培养成为细胞工程的重要组成部分获得蛋白质资源、营养食品、精细化工产品等等单细胞藻类培养细胞工程一些单细胞低等植物如单细胞藻类的大规100高等植物细胞培养细胞工程高等植物细胞具有全能性。从高等植物的幼胚、根、茎、叶、花和果实等不同器官的组织中分离的单个细胞，经过特殊培养形成愈伤组织，并可进一步诱导生成完整的植株。高等植物细胞培养细胞工程高等植物细胞具有全能性。从高等植物101细胞融合、细胞重组、杂交瘤技术细胞工程细胞融合是将不同种类的两种细胞经过特殊处理后放在一起，在某些促融因子作用下发生融合，形成杂种细胞。细胞重组是把不同种类的细胞的部件重新组合装配，包括核的移植、叶绿体移植、核糖体重建及线粒体装配等。杂交瘤技术是通过细胞融合产生特异杂交瘤细胞。细胞融合、细胞重组、杂交瘤技术细胞工程细胞融合是将不同种类1029.4分子诊断和基因治疗分子诊断利用PCR技术或PCR与分子杂交标记相结合，可以快速准确地检测出病原性物质。9.4分子诊断和基因治疗分子诊断利用PCR技术或PCR与103分子诊断遗传性疾病的诊断羊水和胎盘绒毛膜检测分子诊断遗传性疾病的诊断羊水和胎盘绒毛膜检测104分子诊断例：镰状红细胞贫血症的检测一种常染色体退化遗传病引起原因：基因的点突变，丢失了可被MstII或Cvnl切开的一个限制性内切酶位点。正常：三条带患病：一条带子女1：正常子女2：患病子女3：携带者分子诊断例：镰状红细胞贫血症的检测一种常染色体退化遗传病正105例：特异性互补寡核苷酸法检测镰状红细胞贫血症（1）提取DNA，热处理成为单链DNA；（2）以单链DNA为模板，仅对可能发生突变的核苷酸区域设计引物进行PCR扩增后转移到滤膜上，热变性成单链；（3）分别用两种特异性互补寡核苷酸分子探针（ASO）杂交。例：特异性互补寡核苷酸法检测镰状红细胞贫血症（1）提取DNA106基因治疗正常的人类基因可以克隆并引入遗传病患者的体细胞，以替代、修复或纠正有缺陷的基因。通常使用一种反转录病毒作为基因治疗的转移系统，重组载体可以感染人的组织和细胞，但不自我复制。基因治疗正常的人类基因可以克隆并引入遗传病患者的体细胞，以107例：重症综合性免疫缺乏症（SCID）1990年，转基因T淋巴细胞注射到人体骨髓组织中治疗SCID。例：重症综合性免疫缺乏症（SCID）1990年1089.5克隆技术1997年2月23日苏格兰Roslin研究所 Wilmut和Campbell《Nature》杂志： 世界首例来源于哺乳动物体细胞的克隆羊“多莉”问世核移植，就是利用一个动物的体细胞的细胞核（供体核）来取代受精或未受精卵中的细胞核，形成一个重建的“合子”。克隆原意是无性繁殖系。克隆动物就是不经过生殖细胞的受精过程而直接由体细胞获得新的动物个体，这个新个体是原核供体动物的拷贝。9.5克隆技术1997年2月23日苏格兰Roslin研109277次乳腺细胞核移植实验；获得29个发育为8细胞的“胚”；13头代孕母亲；1996年7月5日，羊羔6LL3，被命名为“多莉”。277次乳腺细胞核移植实验；110（1）既然绵羊的体细胞可以被成功地克隆成一个新的个体，是否意味着人类也可以克隆自己呢？（2）是否应该允许进行克隆人的实验？（1）既然绵羊的体细胞可以被成功地克隆成一个新的个体，是否意1119.6生物芯片技术生物芯片又称DNA芯片或基因芯片，它们是DNA杂交探针技术与半导体工业技术相结合的结晶。该技术系指将大量探针分子固定于支持物上后与带荧光标记的DNA样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号