肿瘤分子诊断课件

肿瘤分子诊断服务介绍2标准化用药个体化用药标准化用药个体化用药标准疗法1标准疗法2标准疗法3肿瘤药物与相关靶标目前的服务目前的平台目前的客户肿瘤TaqMan-ARMs医院感染性疾病测序健康管理公司新生儿筛查实时定量PCR研究所qPCR-HRM药厂循环肿瘤细胞（CTC）保险公司体细胞基因突变检测mRNA表达检测循环肿瘤细胞（CTC)检测基因多态性检测体细胞基因突变检测EGFR,K-RAS,B-RAF，C-KIT1、基因突变检测技术

8——qPCR-HRM（可用于血浆标本检测）——Taqman-ARMS（与国际获批的技术相当）——DNA测序（基因突变检测的金标准技术）突变检测技术之一

qPCR-HRM10qPCR-HRM技术是基于高效稳健的PCR上的高分辨熔解曲线分析（High-ResolutionMelting）技术，灵敏度可以达到1%-0.1%，既能检测已知突变，也能检测未知突变。

qPCR-HRM的突变检测已获国际多中心双盲实验验证（JournalofMolecularDiagnostics,Vol.11,No.6,November2009）。实例图：利用HRM技术对7个样本分别进行EGFR（左图）、KRAS（右图）突变检测，红色表示该样本发生突变，蓝色表示未突变，蓝色横直线为阴性对照。左图显示2个样本发生了EGFR突变；右图显示4个样本发生了KRAS突变。EGFRKRAS国际公认的分子检测金标准有明确的物价收费实验流程较复杂，需要大型仪器突变检测技术之一

DNA测序EGFR突变检测EGFRE19/E21敏感突变

适合使用TKI药物治疗耐药位点检测T790MK-RAS突变检测BRAFNCCN2010年NCCN《结直肠癌临床实践指南》指出：K-ras基因为野生型而同时具有BRAFV600E突变的患者，靶向EGFR抗体治疗无效。BRAF-V600E检测肿瘤学临床实践指南（中国版）2010第一版指导肿瘤靶向治疗的靶标药物名称检测靶标检测内容检测结果预测内容吉非替尼/厄洛替尼EGFR基因突变野生型耐药突变型敏感西妥昔单抗K-ras，B-raf基因突变野生型敏感突变型耐药伊马替尼C-Kit基因突变野生型耐药突变型敏感基因多态性检测与药物代谢毒性(UGT1A1,CYP,DPD)2022/12/1220为什么

SNPs重要?个体1个体2=SNPvariationsinDNASNP标志基因A基因B基因ASNP可能使基因B产生变异的蛋白质分子2022/12/1221个体的SNP谱SNP谱ASNP谱BSNP谱CSNP谱FSNP谱ESNP谱D药物代谢与SNP检测化疗药物在体内经过吸收、代谢、分布和清除，通过其活性物质对治疗靶点的直接攻击而发挥作用，整个过程需要多种蛋白质/酶的共同参与和协同作用。SNP主要是指在基因组水平上变异频率大于1%的单核苷酸变异所引起的DNA序列多态性，多态性会导致不同个体体内各种蛋白，酶活性的差异，因此导致药物使用情况的不同。胆红素尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶基因（UGT1A1）UGT1A1*27(C686A)或UGT1A1*28[(TA)7TAA]:

野生型：6个TA

UGT1A1*6(G211A)：使UGT1A1的转录活性下降了三分之二。导致对伊立替康的毒性增加。FDA提示：UGT1A1的多态性-伊立替康的毒性增加(6TA)此型的酶活性是野生型的49％

。基因表达检测（mRNA表达）(ERCC1\BRCA1\TUBB3\TS)基因表达检测指标（靶向药物）相关肿瘤药物名称检测靶标检测内容检测结果预测内容结直肠癌贝伐单抗VEGFRmRNA表达水平高疗效好低疗效差乳腺癌曲妥珠单抗HER-2FISH/mRNA表达水平高疗效好低疗效差肝癌索拉非尼pDGFRmRNA表达水平低疗效好高疗效差28靶向药物项目名称样本结果疗效关系曲妥珠单抗HER2乳腺癌（手术/穿刺）+阳性疗效好↑-↓HER2基因表达检测采用RT-PCR方法替代FISH或免疫组化方法，临床准确率达97%以上。主要特点：客观，不用人为观察。时间短，整个检测60分钟左右完成。高通量，一次可以检测6人份。贝伐单抗检测基因-VEGFR化疗药物与检测靶标药物名称检测靶标检测内容奥沙利铂/卡铂/顺铂ERCC1/BRCA1mRNA表达水平

5-FU/培美曲赛TSmRNA表达水平紫杉醇/多西紫杉醇/长春瑞滨STUBB3,STMN1mRNA表达水平替莫唑胺MGMTmRNA表达水平阿霉素/表柔比星TOPOⅡamRNA表达水平吉西他滨RRM1mRNA表达水平ERCC1表达与铂类药物疗效相关的临床数据ERCC1阴性患者，能从铂类辅助化疗中获益.BRCA1/2表达与铂类药物疗效相关的临床数据BRCA1过度表达铂类耐药的预测因子抗微管类药物的敏感因子34低TSmRNA水平的肿瘤患者接受氟类化疗的效果较好，中位生存期较长。

TS低表达的患者对培美曲赛的疗效好。TS高表达影响氟类和培美曲塞药效ShirotaYetal.JClinOncol.2001;19:4298-304化疗药物与检测靶标药物名称检测靶标检测内容检测结果预测内容奥沙利铂/卡铂/顺铂ERCC1/BRCA1mRNA表达水平

高疗效差低疗效好5-FU/培美曲赛TSmRNA表达水平高疗效差低疗效好紫杉醇/多西紫杉醇/长春瑞滨STUBB3,STMN1mRNA表达水平高疗效差低疗效好替莫唑胺MGMTmRNA表达水平高疗效差低疗效好阿霉素/表柔比星TOPOⅡamRNA表达水平高疗效好低疗效差吉西他滨RRM1mRNA表达水平高疗效差低疗效好小结药物名称靶标检测内容化疗药物铂类ERCC1，BRCA1mRNA水平，2项XRCC1，

GSTP1，

MRP2基因多态性，4项（女，6项）BRCA1(女)异环磷酰胺CYP2C9*3基因多态性，1项丝裂霉素NQO1基因多态性，1项依托泊苷TopoⅡαmRNA水平，1项CYP3A4*4,MDR1基因多态性，2项紫杉醇/多西紫杉醇/长春瑞滨TUBB3,STMN1mRNA水平，2项CYP8*3基因多态性，1项伊立替康UGT1A1*6,

UGT1A1*28基因多态性，2项吉西他滨RRM1mRNA水平，1项CDA基因多态性，1项培美曲赛TSmRNA水平，1项靶向药物吉非替尼/厄洛替尼EGFR(Exon19/20/21)基因突变，3项西妥昔单抗K-ras,B-raf基因突变，3项EGFRmRNA水平，1项贝伐单抗VEGFRmRNA水平，1项NSCLC个体化用药系统方案

遗传性非息肉性结直肠癌（HNPCC)是由DNA错配修复基因（MMR)发生基因突变导致的一种单基因的显性遗传疾病，又称lynch综合症，发生基因异常的个体其患发结直肠癌的风险约为60%。HNPCC实验室检测流程

1背景介绍之HNPCC与MMRMSI目前已发现的导致人类HNPCC发生的MMR有MSH2、MLH1、MSH6、PMS1、PMS2，其中MSH2和MLH1基因的功能最重要，其突变占已发现突变的90%左右。391背景介绍之HNPCC与MMRMSI研究显示，

约有86%-95%的HNPCC具有MSI特征，

而散发型大肠癌中只有16%。MSI所产生的遗传不稳定性将加速恶性肿瘤的发生。1997年美国NCI(nationalcancerinstitution)将MSI确定为检测和筛选HNPCC的重要方法之一，并推荐将BAT26、BAT25、D2S123、D5S346和D17S2505个位点作为检测HNPCC的位点。40实验室检测流程HNPCC检测项目检测名称检测技术临床意义MSI（5个位点）PCR+片段分析法HNPCC风险评估明确是否检测MMR突变MLH1,MSH2,MSH6基因突变检测（35个外显子）DNA测序HNPCC鉴别诊断确定突变位点，评估家族中高危个体风险热点突变检测DNA测序确定家族中是否存在已知的突变标本要求检测名称标本要求MSI检测病理蜡块一份（或白片10片），外加5ml抗凝外周血，4度运达MLH1,MSH2,MSH6基因突变检测病理蜡块一份（或白片10片），常温运达热点突变检测5ml抗凝外周血，4度运达肿瘤在变"WecanlookattumorsforchangesattheDNA,RNAandproteinlevels.Itcertainlygivesusawayoflookingatwhatishappeninginsideatumor,andthat'sveryexciting."

Dr.GordonMillsChairSystemsBiologyMDAndersonCancerCenterHouston,TxAsreportedin“TheCancerTest”–TIME

(June

14,2007)/time/magazine/article/0,9171,1633070,00.html循环肿瘤细胞1869年AustMedJ，Ashworth最早在转移性癌症患者血液中观察到。2005年NEnglJMed，Cristofanilli证实治疗前CTC数目是转移性乳腺癌患者无进展生存期和总生存期的独立预测因子。循环肿瘤细胞指从实体瘤中脱离出来并进入外周血液循环的肿瘤细胞。原发肿瘤血管生成侵润侵入血管内侵入血管外

(CTC)血管内增殖

(CTM)转移转移播散肿瘤细胞（DTC）微转移休眠灶循环肿瘤细胞（CTC）循环肿瘤

微栓（CTM）凋亡的CTC侵润肿瘤细胞

扩增血管生成上皮－间质转化（EMT）间质－上皮转化（MET）转移到骨髓和其他器官获取CTC需要解决的技术问题从红细胞和白细胞中富集恶性肿瘤细胞

将恶性肿瘤细胞与红细胞、白细胞、正常上皮细胞、造血干细胞等区分开来每10mL血液中可能仅含有几个到几十个循环肿瘤细胞，而10mL血液中含有的白细胞约有1亿个，红细胞有500亿个。三种技术过滤法ISET:

IsolationbySizeofEpithelialTumorcells8μm孔径过滤膜，漏检体积较小的肿瘤细胞敏感性低梯度密度法肿瘤细胞和单核细胞密度小于1.077g/mlCTC纯度低，混入较多白细胞肿瘤细胞会迁移至血浆层，而聚集后容易下沉聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)对细胞有毒性免疫磁珠法肿瘤细胞表面抗原EpCAM与包绕着磁珠的特异性单抗相结合CellSearch细胞保存方法长达96小时实验室室间差异小EpCAM的假阳性和假阴性CellSearch是全球第一也是唯一经FDA批准可用于临床的循环肿瘤细胞（CTC）产品1983磁流体白细胞Anti-CD45CD45NucleusDAPI如何