食品毒理学第四章课件

第四章毒性机制刘明启MechanismsofToxicity基本概念终毒物（ultimatetoxicant）是指与内源靶分子（如受体、酶、DNA、微丝蛋白、脂质）反应或严重地改变生物学（微）环境、启动结构和（或）功能而表现出毒性的物质。终毒物可为机体所暴露的原化学物（母化合物）；而另外一些毒物的毒性主要是由于其代谢物引起，生物转化为有害产物的过程称为增毒（toxication）或代谢活化（metabolicactivation）。基本概念增毒使外源化学物转变为：亲电子、自由基、亲核物、氧化还原性反应物。毒效应的强度主要取决于终毒物在其作用位点的浓度及持续时间。第一节：化学毒物对生物膜的损害作用对生物膜组分的影响对生物膜生物物理性质的影响一、对生物膜组分的影响膜蛋白质的影响对膜脂质的影响对膜糖的影响一、对生物膜组分的影响多种环境化学物可引起生物膜成分的变化（一）对膜蛋白质的影响膜蛋白依其在膜结构的位置可分为两类：一是大部分在膜外侧，其功能是作为特别的受体位点或作为细胞的标志。例如：B淋巴细胞表而的免疫球蛋白受体。二是大部分在胞内，如Na+，K+-ATPase。目前已测出质膜上有30多种酶。膜的大部分功能是由膜蛋白完成的运输蛋白，转运特殊的分子和离子出入细胞；酶，催化与膜相关的代谢反应；连接蛋白，把细胞骨架与相邻细胞或细胞外基质相联结；抗原，与细胞间识别有关；受体，接受和转导细胞外的化学信号。功能愈复杂的膜，其上蛋白质含量愈高对膜蛋白质的影响（作用机制）①农药DDT与膜脂结合，使膜流动性增高，影响细胞膜上的Na+，K+-ATPase，表现为神经细胞膜Na+，K+离子通透性改变。②有机磷化合物对红细胞膜乙酰胆碱酯酶(AchE)的抑制作用，是直接作用于酶，磷原子与酶催化活性中心丝氨酸分子的-OH发生不可逆的结合，从而抑制AchE的催化活性。③对膜结构破坏，使膜结合酶改变，如Cd2+（镉）对肾脏损伤，表现为碱性磷酸酶和γ-谷氨酰转移酶活性明显上升。一、对生物膜组分的影响(二)对膜脂质的影响

膜脂质由磷脂、胆固醇和糖脂组成。

一个动物细胞的质膜含有109个脂质分子，由于不同的细胞及细胞器的功能不同，其所含磷脂种类与比例也不尽相同。(二)对膜脂质的影响对大多数细胞来说，脂类约占50％，蛋白质约占40%－50％，糖类约占1%－10％。神经髓鞘膜(主要起绝缘作用)，75％为脂类，线粒体内膜（主要参与能量转换），75％为蛋白质。不同生物膜的脂质成分（以占脂质总重量的百分比计）肝细胞质膜红细胞质膜髓鞘线粒体内、外膜内质网大肠杆菌胆固醇172322360磷脂酰乙醇胺71815251770磷脂酰丝氨酸47925微量磷脂酰胆碱24171039400鞘磷脂19188050糖脂7328微量微量0其他22138212730(二)对膜脂质的影响（作用机制）②膜脂质与化学毒物结合，改变膜结构的性质

SiO2与巨噬细胞一起培养，巨噬细胞负电性增加，经清洗变化不大。说明二氧化硅与膜固有结构的某基团发生结合。③膜脂质过氧化指由自由基作用于膜脂质，引起膜脂质中多不饱和脂肪酸的过氧化反应，即多不饱和脂肪酸的氧化破坏。一、对生物膜组分的影响(三)对膜糖的影响真核细胞表面都有糖类，总量占膜重量的1%-10%。存在于膜上的单糖及衍生物只有9种，动物细胞膜上的主要是以下7种：半乳糖、甘露糖、岩藻糖、半乳糖胺、葡萄糖、葡萄糖胺和唾液酸，全部在膜的非胞质面。

(三)对膜糖的影响

膜糖不是单独存在，往往与脂质和蛋白质组成糖脂和糖蛋白。

膜糖类的功能之一是形成细胞外衣。细胞外衣可能主要起保护作用，即保护细胞免受机械和化学的损伤，保持细胞与外界物质和其他细胞存在一定距离，阻止不需要的蛋白－蛋白相互作用。

（一）对膜通透性的影响影响膜通透性的因素：①脂／水分配系数是膜通透性的决定因素。②通过调节膜上原有通透途径而改变通透性。如汞、铅等重金属可抑制肾脏有机酸转运系统。③通过在原来膜上建造新的通透途径而改变通透性。

environmentcytoplasmIFMucosaofSkin（粘膜）CapillaryMembrane（毛细血管）TargetcellmembraneCELLMEMBRANEPlasmA血浆SubcellularorganellemembraneIFIF=Interstitialfluid（二）对膜流动性的影响多种化学毒物可以影响膜脂流动性。如：溴氰菊酯可使人工膜的脂质流动性升高。突触体膜，其易与脂质双层分子极性头部和膜蛋白分子极性基团相互作用，增加脂质双层极性基团活动程度，可能削弱了膜脂和膜蛋白相互作用，而导致膜脂流动性降低。在进行模拟小肠吸收试验之前，必须对Caco-2细胞模型进行评估。第二节化学毒物对细胞钙稳态的影响一、细胞内钙稳态

Ca2+是体内第二信使：负责将激动刺激信号传给细胞内各种酶反应系统或功能蛋白。

当细胞处于兴奋状态，第一信使转递信息，则细胞内游离Ca2+迅速增多可达10-5mol／L，此后再降低至10-7mol/L，完成信息转递循环。胞内钙稳态调控由细胞膜上的Ca2+转移酶和细胞内钙隔离室系统共同完成．

转运系统：钙通道；钙泵转运系统：钙通道；钙泵钙通道：胞外钙进入胞内，（顺离子浓度）。钙泵，钙移位酶：胞内钙逆浓度转移到胞外。调节途径：

Ca2+与钙结合蛋白:钙调蛋白(CaM)。Ca2+与cAMP：激活腺苷酸环化酶和磷酸二酯酶，Ca2+与蛋白激酶C(PKC)、磷脂酶C(PLC)：Ca2+与离子通道：Ca2+与钙结合蛋白:如钙调蛋白(CaM)在非刺激的细胞中钙调蛋白与Ca2+结合的亲和力很低；如果由于刺激使细胞中Ca2+浓度升高时,Ca2+同钙调蛋白结合形成钙-钙调蛋白复合物(calcium-calmodulincomplex),就会引起钙调蛋白构型的变化，增强了钙调蛋白与许多效应物结合的亲和力。Ca2+与cAMP激活腺苷酸环化酶和磷酸二酯酶，“钙能够把得于细胞表面的信号传递给细胞内各过程，从而在动物的细胞里起着一种几乎是全能的离子信使的作用。钙离子作为细胞内的调节剂而充当第二信使的作用”。－－霍华德（耶鲁大学医学院教授）Ca2+与蛋白激酶C(PKC)、磷脂酶C(PLC)：

蛋白激酶C(PKC)、磷脂酶C(PLC)：G蛋白偶联受体系统中的效应物,在非活性状态下是水溶性的，游离存在于胞质溶胶中，激活后成为膜结合的酶。PKC的活化倚赖DAG(二脂酰甘油）和Ca2+。当DAG在质膜中出现时，胞质溶胶中的PKC被结合到质膜上，然后在高浓度Ca2+的作用下被激活。PKC能激活细胞质中的靶酶参与生化反应的调控,同时也能作用于细胞核中的转录因子,参与基因表达的调控。Ca2+与蛋白激酶C(PKC)、磷脂酶C(PLC)G蛋白偶联受体的信号转导途径由四部分组成：

a细胞膜受体

bG蛋白

c第二信使

d效应物

G蛋白偶联受体的信号转导组成：a细胞膜受体；bG蛋白；c第二信使；d效应物

G蛋白（Gprotein）：在细胞内信号传导途径中起着重要作用的GTP结合蛋白，由α，β，γ三个不同亚基组成。激素与激素受体结合激活位于信号传导途径中下游的腺苷酸环化酶。G蛋白将细胞外的第一信使肾上腺素等激素和细胞内的腺苷酸环化酶催化的腺苷酸环化生成的第二信使cAMP联系起来。G蛋白具有内源GTP酶活性。G蛋白偶联受体的信号转导途径形成受体-Gs复合体后，Gsα亚基构象改变，排斥GDP，结合了GTP而活化，α亚基与βγ亚基解离，暴露出与环化酶结合位点；α亚基与环化酶结合而使后者活化，cAMP与蛋白激酶（PKA）的调节亚基结合，并使PKA的调节亚基和催化亚基分离，活化催化亚基靶蛋白中的丝氨酸或苏氨酸残基磷酸化，将其激活或钝化α亚基具有GTPase活性Ca2+与蛋白激酶C(PKC)、磷脂酶C(PLC)信号传导的终止是依赖于cAMP信号的减少完成。在G蛋白活化一段时间后，α亚基上的GTP酶活性使结合的GTP水解为GDP,亚基恢复最初构象，从而与环化酶分离，环化酶活化终止，α亚基从新与βγ亚基复合体结合。

cAMP的产生减少了，同时cAMP的磷酸二酯酶（PDE）的催化下降解生成5‘-AMP。当cAMP信号终止后，靶蛋白的活性则在蛋白质脱磷酸化作用下恢复原状。Ca2+与离子通道：

细胞内钙离子主要贮存于胞内钙库和线粒体中。细胞质膜两铡[Ca2+]跨膜梯度：细胞外液>>胞浆。胞浆内[Ca2+]的调节通过(质膜和钙库膜上的)钙离子通道(进入)和钙泵(出)

Ca2+与离子通道：钙通道开放的条件：①质膜或钙库膜去极化(可兴奋细胞)；②IP3介导钙库膜上钙通道开放(任何细胞)。

IP3通过作用于内质网膜上特异的受体使其内部Ca2+释放，引起胞内Ca2+水平的增加，从而启动胞内Ca2+信号系统，通过依赖Ca2+、CaM的酶类活性变化来调节和控制一系列的生理过程。水溶性信号分子（如神经递质）不能穿过靶细胞膜，只能经膜上的信号转换机制实现信号传递，所以这类信号分子又称为第一信使（primarymessenger）。第二信使（secondarymessenger）主要有：cAMP、cGMP、IP3、DG、Ca2+。第二信使的作用：信号转换、信号放大。一般具有以下三个特点：

(1)多为小分子，且不位于能量代谢途径的中心；

(2)在细胞中的浓度或分布可以迅速地改变；

(3)作为变构效应剂可作用于相应的靶分子，已知的靶分子主要为各种蛋白激酶。

第一信使、第二信使四、蛋白激酶是一类磷酸转移酶，能将ATP的γ磷酸基转移到底物特定的氨基酸残基上，使蛋白质磷酸化。分为5类，其中了解较多的是蛋白酪氨酸激酶、蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶。作用：通过磷酸化调节蛋白质的活性；通过蛋白质的逐级磷酸化，使信号逐级放大，引起细胞反应。蛋白激酶补充几个重要的概念刺激使细胞的内外环境发生改变因素。兴奋性

在刺激因素作用下，细胞具有产生膜电位变化的能力或特性。兴奋性越高，所需刺激强度越小，膜电位变化速度越快，神经细胞兴奋性最高。补充几个重要的概念静息电位

细胞未收到刺激时，膜两侧的电位差（外正内负的极化状态）动作电位

可兴奋细胞收到刺激，细胞膜原来极化状态消失，膜内外两侧发生一系列电位变化补充几个重要的概念动作电位的过程

去极化：内负外正消失，极化状态消失反极化：内正外负复极化：膜内电位达到最大值后，下降，恢复原来的的极化状态二、细胞钙稳态的紊乱与细胞毒性化学毒物对钙稳态的影响：1.重金属离子

镉可使CaM含量减少。表现为免疫系统、雄性生殖系统以及心肌等改变，有的可用钙调素拮抗剂来预防或减轻损伤作用。二、细胞钙稳态的紊乱与细胞毒性2.农药

菊酯为神经毒化合物，可使神经细胞内游离钙浓度增高，可能与其抑制Ca2+-ATPase、CaM和磷酸二酯酶(PEE)有关。三、钙稳态失调的机制钙稳态失调学说

细胞内钙稳态失调或紊乱，将完全破坏正常生命活动所必需的由激素和生长因子刺激而产生的短暂的Ca2+瞬变，危及

（1）细胞器的功能（2）细胞骨架结构，（3）激活不可逆的细胞成分的分解代谢。三、钙稳态失调的机制1.影响细胞器的功能a:线粒体中钙离子的积累使膜两侧的能势降低，ATP合成酶驱动力降低，ATP合成能力下降；三、钙稳态失调的机制b:

呼吸加速，电子传递加快，生成自由基，对生物膜造成过氧化损伤。线粒体基质是液态的，它含有TCA和脂肪酸氧化的绝大部分酶。TCA中只有琥珀酸脱氢酶是在线粒体内膜上。三、钙稳态失调的机制2.影响细胞骨架结构

损伤细胞骨架，主要通过改变肌动蛋白与肌动蛋白结合蛋白之间联系；水解Ca2+依赖的细胞骨架蛋白；是细胞膜容易破例。

三、钙稳态失调的机制3、不可逆的细胞成分的分解代谢

钙依赖性降解酶的活化，包括蛋白酶、磷脂酶和核酸内切酶。Ca2+是参与多种蛋白质、磷脂和核酸分解酶的激活因子，

Ca2+持续增高必然导致维持细胞结构和功能的重要大分子的破坏。第三节机体内生物大分子氧化损伤机体内生物大分子氧化损伤活性氧族(reactiveoxygen,ROS)对生物大分子的损伤。一、自由基的来源与类型1.概念自由基(freeradicals)指能够独立存在的含一个或一个以上不成对电子的任何分子或离子。一个不成对电子是指单独在一个轨道里的电子。特点：顺磁性，化学反应性极高，作用半径短，半衰期极短，一般仅能以μs计。2.类型最主要的是氧中心自由基3.来源自由基在生物体内来源有二：细胞正常生理过程产生－－参与生物学功能，对机体没有损害化学毒物在体内代谢过程产生－－主要通过氧化还原反应

氧化还原反应通过加入一个单电子使化学物还原为不稳定的中间产物，随后这个电子转移给分子氧而形成超氧阴离子自由基(O2-·)，而中间产物则再生为原化学物。主要反应类型细胞产生的freeradicals主要有以下：①酶反应可催化生成ROS。包括胞浆酶：黄嘌呤氧化酶膜结合酶：脂肪氧合酶②内源性物质的氧化反应，抗坏血酸和儿茶酚胺。③内质网膜或线粒体，正常时ROS产生较少。二、机体对氧化损伤的防御系统自由基产生只有超过抗氧化能力或机体抗氧化能力降低时，才会造成损害作用。机体相应的防御系统，1.酶性抗氧化系统需氧生物存在防御过氧化损害的酶系统，即消除自由基的酶系统。

超氧化物歧化酶过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)及谷胱甘肽还原酶等。SOD测定黄嘌呤氧化酶法（羟胺法）测定超氧化物歧化酶SOD活力。黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子自由基（O2.－），后者氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂的作用下呈紫红色，用可见光分光光度计测其吸光度。当被测样品中含SOD时，则对超氧阴离子自由基有专一性的作用，使形成的亚硝酸盐减少，比色时测定管的吸光度值低于对照组的吸光度值，通过公式计算可求出被测样品中的SOD活力。不同锌水平对大鼠ALP、Cu-ZnSOD和MT含量的影响（Cu-Zn