抗hu抗体相关pns患者外周血单个核细胞的增殖反应及对sclc细胞的抑制作用课件

抗-Hu抗体相关PNS患者外周血单个核细胞的增殖反应及对SCLC细胞的抑制作用

抗-Hu抗体相关PNS患者外周血单个核细胞的增殖反应及对SC1研究背景研究背景2副肿瘤性神经系统综合征(paraneoplasticneurologicalsyndromes，PNS)是与肿瘤有关的神经系统综合征,既非肿瘤的直接侵犯,也不是由于癌肿导致的代谢障碍、恶病质及放疗和化疗等并发症引起的。小细胞肺癌（SCLC）最常见。发病机制尚未明确。副肿瘤性神经系统综合征(paraneoplasticneu3副肿瘤综合征相关抗体anti-Hu抗体

anti-Amphiphysin抗体

anti-VGCC抗体anti-Yo抗体anti-Ri抗体副肿瘤综合征相关抗体4发现某些可以检测出低滴度anti-Hu抗体的小细胞肺癌（SCLC）患者肿瘤预后优于anti-Hu抗体阴性的患者

部分PNS患者的肿瘤病灶较局限且只播散至局部淋巴结

发现某些可以检测出低滴度anti-Hu抗体的小细胞肺癌（SC5

肿瘤细胞

神经细胞共同抗原神经细胞

肿瘤细胞共同抗体致敏抗原特异性T细胞肿瘤细胞神经细胞共同抗原神经细胞肿瘤细胞共同6既往研究在体液免疫方面取得一定进展。发现了大量抗体，包括细胞核抗体，和细胞膜抗体。细胞免疫研究较少。既往研究在体液免疫方面取得一定进展。发现了大量抗体，包括细胞7研究目的研究目的8观察PNS患者PBMC能否抑制肿瘤细胞的增殖。PNS患者的PBMC中是否存在针对肿瘤抗原致敏的特异性淋巴细胞特异性致敏淋巴细胞以那种T细胞亚群为主观察经肿瘤细胞刺激后CD4+细胞CD8+细胞比例的变化PBMC与H446混合培养PNS患者的PBMC中是否存在针对肿瘤抗原致敏的特异性淋巴9实验流程实验流程10共同培养T亚群染色PBMC分离培养

H446细胞培养CFSE染色CellQuest分析亚群比例ModFit分析各细胞增殖指数ABC、Westernblot筛选Hu抗体阳性PNS患者共同培养T亚群染色PBMC分离培养H446细胞培养CFS11结果结果12抗hu抗体相关pns患者外周血单个核细胞的增殖反应及对sclc细胞的抑制作用课件13抗hu抗体相关pns患者外周血单个核细胞的增殖反应及对sclc细胞的抑制作用课件14抗hu抗体相关pns患者外周血单个核细胞的增殖反应及对sclc细胞的抑制作用课件15CFSE原理羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)是非极性分子,扩散进入细胞与赖氨酸发生偶联,形成稳定的大分子荧光结合物。当细胞分裂时,荧光结合物平均分配到两个子细胞中,而荧光强度为亲代细胞的一半。在一个增殖细胞群体中,连续各代细胞的荧光强度表现为二倍递减的特征CFSE原理羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)是非16CFSE测增殖原理示意图1100502521001001225505050255012100502525CFSE测增殖原理示意图11005025210010012217CD4+T细胞增殖动力学CD8+T细胞增殖动力学CD4+T细胞增殖动力学CD8+T细胞增殖动力学18H446单独增殖动力学H446混合增殖动力学H446单独增殖动力学H446混合增殖动力学19总PBMC增殖动力学总PBMC增殖动力学20CD4+T细胞亚群点阵图CD8+T细胞亚群点阵图CD4+T细胞亚群点阵图C21正常组组内比较培养方式增殖指数NCI-H446总PBMCCD4+细胞CD8+细胞单独培养8.56±3.348.05±5.517.43±4.637.69±5.84混合培养6.97±2.528.90±5.678.60±4.838.93±5.73正常组组内比较培养方式增殖指数NCI-H446总PBMCC22PNS组以及SCLC组PBMC单独培养和混合培养增殖指数无显著差异PNS组以及SCLC组H446单独培养和混合培养增殖指数无显著差异PNS组以及SCLC组PBMC单独培养和混合培养增殖指数无显23三组间混合培养后比较

组别培养后亚群比例CD4+T细胞CD8+T细胞CD4/CD8正常组51.75±17.336.02±18.712.15±1.88PNS组76.54±3.9617.41±7.314.74±2.42SCLC组89.36±3.777.91±1.5611.61±1.95三组间混合培养后比较组别培养后亚群比24讨论讨论25H446细胞能使正常组总PBMC、CD4+T细胞、CD8+T细胞细胞增殖加快，同时正常组PBMC能抑制H446细胞生长。SCLC患者和PNS患者均未出现类似情况。提示体外共同培养时PNS患者PBMC不能抑制NCI-H446细胞的生长。一.增殖与抑制作用H446细胞能使正常组总PBMC、CD4+T细胞、CD8+26肺癌患者外周血中CD4+T细胞减少,CD4+/CD8+下降，肺癌患者免疫功能处于抑制状态。本课题的另一研究显示PNS患者外周血也存在CD4+T细胞减少，CD4+/CD8+下降，PNS患者免疫功能也有一定程度的抑制。肺癌患者外周血中CD4+T细胞减少,CD4+/CD8+27PNS患者外周血中存在针对肿瘤抗原的致敏的特异性T淋巴细胞。但其总体免疫功能仍处于低下状态，细胞增殖能力较差。体外培养时不能对肿瘤细胞产生明显的抑制作用。PNS患者外周血中存在针对肿瘤抗原的致敏的特异性T淋巴细胞。28二、培养后CD4+CD8+比例变化如果存在致敏的抗原特异性T淋巴细胞，这部分细胞体外经刺激后可能会优先克隆扩增，H446混合培养，PNS患者培养后CD4+T细胞比例明显高于正常人。提示PNS患者体内致敏的特异T细胞以CD4+T细胞为主。二、培养后CD4+CD8+比例变化如果存在致敏的抗原特异性T29抗-Hu抗体与PNS发病密切相关。且研究提示HuD蛋白是自身反应性的CD4+T细胞的抗原性靶目标。提示CD4+T细胞在抗肿瘤免疫的同时直接参与了细胞介导的神经系统的损伤。抗hu抗体相关pns患者外周血单个核细胞的增殖反应及对sclc细胞的抑制作用课件30病理显示，PNS患者脑干、脊髓大量炎性淋巴细胞在血管周围呈袖套样浸润。Dalmau等发现血管周围的炎性淋巴细胞主要为CD19+B细胞和CD4+T细胞。和我们的研究结果相似，提示PNS患者中枢神经系统和周围神经系统中抗原特异性T细胞均以CD4+T细胞为主。病理显示，PNS患者脑干、脊髓大量炎性淋巴细胞在血管周围呈袖31CD4+T细胞分泌IL-2、TNF和INF等多种细胞因子、具有特定的杀伤功能、能维持免疫记忆而成为体内免疫调节的核心。

目前研究认为CD4+T细胞在抗肿瘤免疫中起重要作用。CD4+T细胞分泌IL-2、TNF和INF等多种细胞因32本次实验显示PNS患者体内致敏的特异T细胞以CD4+T细胞为主。CD4+T细胞在抑制肿瘤的生长、改善PNS患者预后以及攻击神经元产生各种PNS症状方面起了重要作用。抗hu抗体相关pns患者外周血单个核细胞的增殖反应及对sclc细胞的抑制作用课件33★PNS患者PBMC对H446细胞生长无抑制作用。提示PNS患者总体免疫功能处于抑制状态。结论一★PNS患者PBMC对H446细胞生长无抑制作用。结论一34PNS患者体内致敏的特异性的T细胞以CD4+T细胞为主。

结论二结论二35谢谢谢谢36抗-Hu抗体相关PNS患者外周血单个核细胞的增殖反应及对SCLC细胞的抑制作用

抗-Hu抗体相关PNS患者外周血单个核细胞的增殖反应及对SC37研究背景研究背景38副肿瘤性神经系统综合征(paraneoplasticneurologicalsyndromes，PNS)是与肿瘤有关的神经系统综合征,既非肿瘤的直接侵犯,也不是由于癌肿导致的代谢障碍、恶病质及放疗和化疗等并发症引起的。小细胞肺癌（SCLC）最常见。发病机制尚未明确。副肿瘤性神经系统综合征(paraneoplasticneu39副肿瘤综合征相关抗体anti-Hu抗体

anti-Amphiphysin抗体

anti-VGCC抗体anti-Yo抗体anti-Ri抗体副肿瘤综合征相关抗体40发现某些可以检测出低滴度anti-Hu抗体的小细胞肺癌（SCLC）患者肿瘤预后优于anti-Hu抗体阴性的患者

部分PNS患者的肿瘤病灶较局限且只播散至局部淋巴结

发现某些可以检测出低滴度anti-Hu抗体的小细胞肺癌（SC41

肿瘤细胞

神经细胞共同抗原神经细胞

肿瘤细胞共同抗体致敏抗原特异性T细胞肿瘤细胞神经细胞共同抗原神经细胞肿瘤细胞共同42既往研究在体液免疫方面取得一定进展。发现了大量抗体，包括细胞核抗体，和细胞膜抗体。细胞免疫研究较少。既往研究在体液免疫方面取得一定进展。发现了大量抗体，包括细胞43研究目的研究目的44观察PNS患者PBMC能否抑制肿瘤细胞的增殖。PNS患者的PBMC中是否存在针对肿瘤抗原致敏的特异性淋巴细胞特异性致敏淋巴细胞以那种T细胞亚群为主观察经肿瘤细胞刺激后CD4+细胞CD8+细胞比例的变化PBMC与H446混合培养PNS患者的PBMC中是否存在针对肿瘤抗原致敏的特异性淋巴45实验流程实验流程46共同培养T亚群染色PBMC分离培养

H446细胞培养CFSE染色CellQuest分析亚群比例ModFit分析各细胞增殖指数ABC、Westernblot筛选Hu抗体阳性PNS患者共同培养T亚群染色PBMC分离培养H446细胞培养CFS47结果结果48抗hu抗体相关pns患者外周血单个核细胞的增殖反应及对sclc细胞的抑制作用课件49抗hu抗体相关pns患者外周血单个核细胞的增殖反应及对sclc细胞的抑制作用课件50抗hu抗体相关pns患者外周血单个核细胞的增殖反应及对sclc细胞的抑制作用课件51CFSE原理羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)是非极性分子,扩散进入细胞与赖氨酸发生偶联,形成稳定的大分子荧光结合物。当细胞分裂时,荧光结合物平均分配到两个子细胞中,而荧光强度为亲代细胞的一半。在一个增殖细胞群体中,连续各代细胞的荧光强度表现为二倍递减的特征CFSE原理羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)是非52CFSE测增殖原理示意图1100502521001001225505050255012100502525CFSE测增殖原理示意图11005025210010012253CD4+T细胞增殖动力学CD8+T细胞增殖动力学CD4+T细胞增殖动力学CD8+T细胞增殖动力学54H446单独增殖动力学H446混合增殖动力学H446单独增殖动力学H446混合增殖动力学55总PBMC增殖动力学总PBMC增殖动力学56CD4+T细胞亚群点阵图CD8+T细胞亚群点阵图CD4+T细胞亚群点阵图C57正常组组内比较培养方式增殖指数NCI-H446总PBMCCD4+细胞CD8+细胞单独培养8.56±3.348.05±5.517.43±4.637.69±5.84混合培养6.97±2.528.90±5.678.60±4.838.93±5.73正常组组内比较培养方式增殖指数NCI-H446总PBMCC58PNS组以及SCLC组PBMC单独培养和混合培养增殖指数无显著差异PNS组以及SCLC组H446单独培养和混合培养增殖指数无显著差异PNS组以及SCLC组PBMC单独培养和混合培养增殖指数无显59三组间混合培养后比较

组别培养后亚群比例CD4+T细胞CD8+T细胞CD4/CD8正常组51.75±17.336.02±18.712.15±1.88PNS组76.54±3.9617.41±7.314.74±2.42SCLC组89.36±3.777.91±1.5611.61±1.95三组间混合培养后比较组别培养后亚群比60讨论讨论61H446细胞能使正常组总PBMC、CD4+T细胞、CD8+T细胞细胞增殖加快，同时正常组PBMC能抑制H446细胞生长。SCLC患者和PNS患者均未出现类似情况。提示体外共同培养时PNS患者PBMC不能抑制NCI-H446细胞的生长。一.增殖与抑制作用H446细胞能使正常组总PBMC、CD4+T细胞、CD8+62肺癌患者外周血中CD4+T细胞减少,CD4+/CD8+下降，肺癌患者免疫功能处于抑制状态。本课题的另一研究显示PNS患者外周血也存在CD4+T细胞减少，CD4+/CD8+下降，PNS患者免疫功能也有一定程度的抑制。肺癌患者外周血中CD4+T细胞减少,CD4+/CD8+63PNS患者外周血中存在针对肿瘤抗原的致敏的特异性T淋巴细胞。但其总体免疫功能仍处于低下状态，细胞增殖能力较差。体外培养时不能对肿瘤细胞产生明显的抑制作用。PNS患者外周血中存在针对肿瘤抗原的致敏的特异性T淋巴细胞。64二、培养后CD4+CD8+比例变化如果存在致敏的抗原特异性T淋巴细胞，这部分细胞体外经刺激后可能会优先克隆扩增，H446混合培养，PNS患者培养后CD4+T细胞比例明显高于正常人。提示PNS患者体内致敏的特异T细胞以CD4+T细胞为主。二、培养后CD4+CD8+比例变化如果存在致敏的抗原特异性T65抗-Hu抗体与PNS发病密切相关。且研