微生物细胞计数及染色操作

微生物细胞计数及染色操作

河南师范大学环境科学与工程实验教学中心一、目的要求学会血球计数板的使用方法了解革兰氏染色的原理学习并掌握革兰氏染色的方法二酵母细胞计数原理

微生物常用的计数方法有两种，即直接计数法和间接计数法。前者利用血球计数板在显微镜下直接计数，能立即得到数值，但死活细胞都计数在内。后者是在乎板上长成菌落后再计数，反应较真实，但费时太长。本实验是利用血球计数板进行直接计数。计数前需对样品做适当稀释，按照规定方法及计算公式运算后，即可得出实际数值。

细菌染色基本原理革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。它是1884年由丹麦医师Gram创立的。革兰氏染色法（Gramstain）不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。肽聚糖(peptidoglycan)革兰阳性菌肽聚糖—聚糖骨架、四肽侧链、五肽交联桥青霉素作用点溶菌酶作用点N-乙酰葡糖胺N-乙酰胞壁酸革兰阴性菌肽聚糖—聚糖骨架、四肽侧链肽聚糖(peptidoglycan)革兰阳性菌细胞壁特殊组分壁磷壁酸膜磷壁酸革兰阴性菌细胞壁特殊组分革兰阳性菌与阴性菌细胞壁结构比较细胞壁革兰阳性菌革兰阴性菌强度较坚韧较疏松厚度20-80nm10-15nm肽聚糖层数可多达50层1-2层肽聚糖含量占细胞壁干重50%-80%占细胞壁干重5%-20%磷壁酸+—外膜—+脂蛋白—+脂多糖—+革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料（basicdye）初染液；媒染剂（mordant）；脱色剂（decolorisingagent）和复染液（counterstain）。碱性染料初染液——结晶紫（crystalviolet）媒染剂——碘（iodine）脱色剂——95％的酒精（ethanol）复染液——番红三、、实实验验器器材材大肠肠杆杆菌菌，，枯枯草草芽芽孢孢杆杆菌菌、、未未知知菌菌；；草酸酸铵铵结结晶晶紫紫，，番番水水水水溶溶液液，，碘碘液液，，95%乙乙醇醇，，载载玻玻片片，，显显微微镜镜等等。。显微微镜镜、、物物镜镜测测微微尺尺、、目目镜镜测测微微尺尺、、血血球球计计数数板板、、载载玻玻片片等等。。麦芽芽汁汁培培养养基基、、酵酵母母菌菌。。吸管管、、吸吸水水纸纸等等。。四、、实实验验步步骤骤1．．涂涂片片：：将将培培养养24小小时时的的大大肠肠杆杆菌菌和和未未知知菌菌，，培培养养12-18小小时时的的枯枯草草芽芽孢孢杆杆球球菌菌、、分分别别作作涂涂片片（（注注意意涂涂片片切切不不可可过过于于浓浓厚厚）），，干干燥燥、、固固定定。。固固定定时时通通过过火火焰焰1～～2次次即即可可，，不不可可过过热热，，以以载载玻玻片片不不烫烫手手为为宜宜。。（一一））染染色色实实验验2．．染染色色（1））初初染染：：加加草草酸酸铵铵结结晶晶紫紫一一滴滴，，约约一一分分钟钟，，水水洗洗。。（2））媒媒染染：：滴滴加加碘碘液液冲冲去去残残水水，，并并覆覆盖盖约约一一分分钟钟，，水水洗洗。。（3））脱脱色色：：将将载载玻玻片片上上面面的的水水甩甩净净，，并并衬衬以以白白背背景景，，用用95％％酒酒精精滴滴洗洗至至流流出出酒酒精精刚刚刚刚不不出出现现紫紫色色时时为为止止，，约约20～～30秒秒钟钟，，立立即即用用水水冲冲净净酒酒精精。。（4））复复染染：：用用番番红红液液染染1～～2分分钟钟，，水水洗洗。。（5））干干燥燥和和镜镜检检：：干干燥燥后后，，置置油油镜镜观观察察。。革革兰兰氏氏阴阴性性菌菌呈呈红红色色，，革革兰兰氏氏阳阳性性菌菌呈呈紫紫色色。。以以分分散散开开的的细细菌菌的的革革兰兰氏氏染染色色反反应应为为准准，，过过于于密密集集的的细细菌菌，，常常常常呈呈假假阳阳性性。。（6））同同法法在在一一载载玻玻片片上上以以大大肠肠杆杆菌菌与与枯枯草草芽芽孢孢杆杆菌菌混混合合制制片片，，作作革革兰兰氏氏染染色色对对比比。。革兰氏氏染色色的关关键在在于严严格掌掌握酒酒精脱脱色程程度，，如脱脱色过过度，，则阳阳性菌菌可被被误染染为阴阴性菌菌；而而脱色色不够够时，，阴性性菌可可被误误染为为阳性性菌。。此外外，菌菌龄也也影响响染色色结果果，如如阳性性菌培培养时时间过过长，，或已已死亡亡及部部分菌菌自行行溶解解了，，都常常呈阴阴性反反应。。大肠杆杆菌革革兰氏氏染色色炭疽芽胞杆菌(二)酵母母细胞胞数的的测定定操作作方法法1.血球计计数板板的构构造血球计计数板板是由由一块块比普普通载载玻片片厚的的特制制玻片片制成成的。。玻片片中有有四条条下凹凹的槽槽，构构成三三个平平台。。中间间的平平台较较宽，，其中中间又又被一一短横横槽隔隔为两两半，，每半半边上上面个个刻有有一个个方格格网。。方格格网上上刻有有9个大方方格，，其中中只有有中间间的一一个大大方格格为计计数室室，供供微生生物计计数用用。这这一大大方格格的长长和宽宽各为为1m，深度度为，，其体体积为为0.1mm3。计数室室通常常有两两种规规格。。一种种是大大方格格内分分为16中中格，，每一一中格格又分分为25小小格；；另一一种是是大方方格内内分为为25中格格，每每一中中格又又分为为16小格格。但但是不不管计计数室室是哪哪一种种构造造；它它们都都有一一个共共同的的特点点，即即每一一大方方格都都是由由16×25=25×16=400个个小方方格组组成，，见图图。2.血血球计计数板板的使使用(1)用血血球计计数板板计数数酵母母菌悬悬液的的酵母母菌个个数。。(2)样品稀稀释的的目的的是便便于酵酵母菌菌悬液液的计计数，，以每每小方方格内内含有有4-5个酵母母细胞胞为宜宜，一一般稀稀释10倍即可可。(3)将血血球计计数板板用擦擦镜纸纸擦净净，在在中央央的计计数室室上加加盖专专用的的厚玻玻片。。(4)将稀稀释后后的酵酵母菌菌悬液液，用用吸管管吸取取一滴滴置于于盖玻玻片的的边缘缘，使使菌液液缓缓缓渗入入，多多余的的菌液液用吸吸水纸纸吸取取，捎捎待片片刻，，使酵酵母菌菌全部部沉降降到血血球计计数室室内。。(5)计数时时，如如果使使用16格×25格规格格的计计数室室，要要按对对角线线位，，取左左上、、右上上、左左下、、右下下4个中格格（即即100个小格格）的的酵母母菌数数。如如果规格为25格×16格的计数数板，除了取取其4个对角方方位外，，还需再数中央央的一个个中格(即80个小方格格)的酵母菌菌数。4.血球球计数板板的清洁洁血球汁数数板使用用后，用用自来水水冲洗，，切勿用用硬物洗洗刷，洗洗后自行行晾干或或用吹风风机吹干干，或用用95％的乙醇醇、无水水乙醇、、丙酮等等有机溶溶剂脱水水使其干干燥。通通过镜检检观察每每小格内内是否残残留菌体体或其他他沉淀物物。若不不干净，，则必须须重复清清洗直到到干净为为止。1．结果果列表比较较大肠杆杆菌、枯枯草芽孢孢杆菌和和未知菌菌的染色色反应，，并判断断它们分分别是G-或G+.2．思考考题（1）作作革兰氏氏染色涂涂片为什什么不能能过于浓浓厚？其其染色成成败的关关键一步步是什