基因的体外重组和转化课件

基因的体外重组和转化课件1外源DNA载体DNA重组分子原核细胞真核细胞扩增或表达表达连接转化或转导电穿孔或显微注射受体细胞7基因的体外重组与转化外源DNA载体DNA重组分子原核细胞真核细胞扩增或表达表达连27基因的体外重组与转化1DNA片段的体外连接2重组体导入细菌细胞3重组噬菌体DNA的体外包装与转导4重组克隆载体导入哺乳动物细胞的转染7基因的体外重组与转化1DNA片段的体外连接23重组过程中，需要考虑的因素：（1）连接效率高、易于筛选；（2）便于回收外源基因；（3）在载体的启动子控制之下，并置于正确的阅读框之中，以便表达。基因的重组是依赖于限制性内切酶、DNA连接酶和修饰酶的作用，分别对外源基因和载体进行适当切割和修饰后，将外源基因和载体巧妙地连接在一起。重组过程中，需要考虑的因素：基因的重组是依赖于限制性内切酶、41DNA片段的体外连接一、粘性末端的连接二、平末端的连接三、PCR产物的连接四、体外连接应注意的事项五、体外连接的结果体外连接1DNA片段的体外连接一、粘性末端的连接二、平末端的连接5DNA连接酶：由大肠杆菌基因组DNA编码，以NAD+作为能源辅助因子。；只能连接粘性末端T4DNA连接酶：

由大肠杆菌T4噬菌体DNA编码，以ATP作为能源辅助因子。1970年：容易制备，而且可以连接平末端DNA分子及单链DNA(RNA)分子，所以在基因克隆中应用广泛。DNA连接酶：由大肠杆菌基因组DNA编码，以NAD+作为能6ＤＮＡ连接酶ＤＮＡ连接酶7基因的体外重组和转化课件8一、粘性末端的连接利用粘性末端单链间的碱基互补，并用DNA连接酶把相互靠近的5’端磷酸与3’-OH连到一起。一、粘性末端的连接利用粘性末端单链间的碱基互补，并用DNA连91.两段DNA的连接依靠粘性末端1.两段DNA的连接依靠粘性末端102.DNA片断与载体的连接依靠粘性末端2.DNA片断与载体的连接依靠粘性末端113.载体与载体的连接3.载体与载体的连接12二、平末端（bluntend）的连接5’端与3’端并列靠近的时间太短，不容易被连接酶连接。1.直接连接T4DNA连接酶虽然能连接平末端，但效率很低，只有粘性末端的1%。5’

5’

5’

5’

3’

3’

3’

3’

-OH-OH-P-PP-P-HO-HO-5’

3’

-OH-PP-HO-5’

3’

二、平末端（bluntend）的连接5’端与3’端并列靠近131972年，斯坦福大学的P.Labban和P.Kaiser提出。（1）同聚物加尾法

2.人工加尾形成“粘性末端”

末端脱氧核苷酸转移酶能在没有模板的情况下给DNA的3’-OH端加上脱氧核苷酸。①原理：分别给载体和插入片断加上互补的核苷酸。②加尾—碱基互补1972年，斯坦福大学的P.Labban和P.Kaise14④缺点：③优点：能把任何片段连接起来不能把插入片段再切下来。非酶切位点④缺点：③优点：能把任何片段连接起来不能把插入片段再切下来。15用T4DNA连接酶连到平端DNA上，然后再用酶切，形成一个人工粘性末端。（2）衔接物(linker)连接①linker用化学合成法合成的一段10-12bp的特定限制性内切酶识别位点序列的平端双链。GGAATTCCCCTTAAGGEcoRIlinker：②linker的作用用T4DNA连接酶连到平端DNA上，然后再用酶切，形成一个16

17

18④缺点：1）可以用内切酶把插入片段切下来。如果插入片段内部也有该酶位点，不能切下完整的插入片段2）能给载体连接上Polylinker:③优点：④缺点：1）可以用内切酶把插入片段切下来。如果插入片段内部也19（3）DNA接头(adapter)连接法1978年康内尔大学的吴瑞教授发明。5‘p-GATCCCGG-OH3’

GGCC-p5’

BamHIadapter用T4DNA连接酶连到DNA分子的两端，直接成为人工粘性末端。①adapter一头平末端、另一头粘性末端（某种酶切位点序列）。②adapter的作用（3）DNA接头(adapter)连接法1978年康内尔大20Blunt-endedDNA5’p-GATCCCGG-OH3’

HO-GGCC-p5’

BamHIadapterP--P5‘p-GATCCCGG-GGCC--CCGG-GGCCCTAG-P5’

5‘p-GATCCCGG-GGCC-CCGGGGCCCTAG-P5’

CCGGGATCCCGG-OHGGCCCTAGGGCC-P5’

接头自我连接Blunt-endedDNA5’p-GATCCCGG-OH21基因的体外重组和转化课件22接头与接头会彼此以粘性末端接在一起，影响与DNA片段的连接。③优点：连上后就能用。④缺点：先用小牛肠碱性磷酸酶（CIP）处理接头，水解掉其5’端的磷酸，防止自我连接。（以后再用T4多核苷酸激酶加上磷酸。）⑤防止自我连接接头与接头会彼此以粘性末端接在一起，影响与DNA片段的连接。23碱性磷酸酶处理质粒载体为了提高连接效率，一般采取提高ＤＮＡ的浓度，增加重组子比例。这样就会出现ＤＮＡ自生连接问题，为此通常选择对质粒载体用碱性磷酸酶处理，除去其５’末端的磷酸基，防止环化，通过接反应后形成的缺口可在转化细胞后得以修复。碱性磷酸酶处理质粒载体为了提高连接效率，一般采取提高ＤＮＡ的24载体自连及去磷酸化示意图载体自连及去磷酸化示意图25常用碱性磷酸酶BAP（大肠杆菌）CIP(小牛肠)分子量80,000温度60℃—65℃最适PH8.0热稳定性好，100℃暂时性失活，室温放置可恢复活性，苯酚完全失活分子量100,000温度37℃最适PH10.0附近（高底物浓度）PH8.0附近（低底物浓度）65℃30分钟处理99％的活性不可逆失活，随具体条件改变有变动，完全失活苯酚处理常用碱性磷酸酶BAP（大肠杆菌）CIP(小牛肠)分子量80265‘p-GATCCCGG-OHHO-GGCC-PP-CCGG-OHHO-GGCCCTAG-P5’

CCGGGATCCCGG-OHHO-GGCCCTAGGGCC5’

接头之间不能形成磷酸二酯键自我连接！5‘GATCCCGG-OHHO-GGCC5’

5’CCGG-OHHO-GGCCCTAG5’

CIP处理-OHHO-5‘p-GATCCCGG-OHP-CCGG-OH27Blunt-endedDNA5’p-GATCCCGG-OH3’

HO-GGCC-p5’

BamHIadapterP--P5‘GATCCCGG-HO-GGCCCCGG-OH-GGCCCTAG5’

5’HO-GATCCCGG-OH3’

HO-GGCC5’

缺口缺口HO--OHCIP处理T4ligase虽然有缺口，但仍然能与DNA片断连接。Blunt-endedDNA5’p-GATCCCGG-OH28基因的体外重组和转化课件29连接体系载体DNA50ng0.5ul目的DNA19ng?ul双蒸水?ul5ul连接反应液（2×）5ul总体积10ul用加样器柔和吹打混匀,16℃连接2小时。附注：载体和目的基因的摩尔比为1:350ng:5.4kb=6.3ng:0.7kb6.3ng*3=19ng连接体系载体DNA301.载体和插入片段的摩尔浓度比载体：插入片段的摩尔数的变化范围可为8：1到1：16，但通常的变化范围是3：1到1：3。在最小的反应体积中，通常一个连接反应用10-50ng的载体DNA。2.平末端连接在22℃保温4-16小时，粘性末端在22℃保温3小时，或16℃保温16小时。大多数连接反应用T4DNA连接酶，但大肠杆菌的DNA连接酶可用于粘性末端的连接，平末端连接时用此酶，活力较低。3.载体和插入片段的纯度应较高，溶解的溶剂最好使用灭菌的双蒸水而不是TE，毕竟TE中含有离子，可能影响连接反应。连接反应中值得注意的几个问题1.载体和插入片段的摩尔浓度比载体：插入片段的摩尔数的变化31三、PCR产物的连接1.在引物的5’端设计酶切位点符合载体的多克隆位点；（1）设计原则（2）带酶切位点的引物的结构3’端15~20bp与模板互补；5’端6~10bp是某个内切酶的识别序列。（5’端多余的3~5bp属保护碱基）避免与所扩增的DNA片断内部酶切位点重复。三、PCR产物的连接1.在引物的5’端设计酶切位点符合载体32引物1GCAGAATTC

互补序列模板EcoRI位点5’--3’

GCAGAATTC

互补序列5’--3’

3’

模板GCAGAATTC

互补序列PCR产物5’--3’

3’

复性延伸模板模板3’

3’

引物1GCAGAATTC互补序列模板EcoRI位点5’--33GCTAGCCGG

互补序列模板BamHI位点-5’

3-’

5’

复性延伸模板模板3’

3’

GCTAGCCGG

互补序列-5’

3’-模板5’

GCTAGCCGG

PCR产物

互补序列-5’

3’-引物2GCTAGCCGG互补序列模板BamHI位点-5’334带酶切位点的PCR产物GCAGAATTC

PCR产物5’--3’

GCTAGCCGG

PCR产物-5’

3’-CGTCTTAAGCGATCGGCCEcoRI位点BamHI位点AATTC

PCR产物5’--3’

GCTAG

PCR产物-5’

3’-GCEcoRIBamHI两头各有一个粘性末端！带酶切位点的PCR产物GCAGAATTCPCR产物5’--352.与T载体直接连接（1）PCR产物两个3’端一般都有一个ATaqDNA聚合酶的特性：在DNA双链的3’端再加上一个多余的核苷酸（优先加A）。（2）T载体的两个3’端人为地各加一个T利用TaqDNA聚合酶，当原料中只有dTTP时，被迫在平端载体上添加T！2.与T载体直接连接（1）PCR产物两个3’端一般都有一个36AAdNTPTTdTTPTaqDNA聚合酶载体PCR产物TATAAAdNTPTTdTTPTaqDNA聚合酶载体PCR产物T37四、DNA体外连接应注意的事项插入片断与载体的酶切位点互补相同的粘性末端才能有效地连接。尽量避免平端连接。四、DNA体外连接应注意的事项插入片断与载体的酶切位点互补相38EcoRIEcoRIEcoRI（1）用相同的酶切（2）用同尾酶切BamHI、BclI、BglII、Sau3AI、XhoII都产生GATC4个碱基的粘性末端。EcoRIEcoRIEcoRI（1）用相同的酶切（2）用同尾392.DNA插入的方向正确（1）用双酶切由于产生的粘性末端不同，只能以固定方向连接。EcoRIBamHIEcoRIBamHIEcoRIBamHI2.DNA插入的方向正确（1）用双酶切由于产生的粘性末端不403.插入基因的开放阅读框（ORF）正确（1）DNA定向插入（2）起始密码尤其当载体上有ATG起始密码的时候，更要注意。ATGGAATTC载体ATGCGGAATTCT插入片断EcoRIEcoRIATGGAATTCT重组但移码突变！3.插入基因的开放阅读框（ORF）正确（1）DNA定向插入414.防止载体自身环化连接（1）提高插入片断的用量连接反应体系中，插入片断比载体多10倍以上。（2）用碱性磷酸酶处理载体载体切口的5’磷酸被除去，不能自我连接。但可以与插入片断以单链连接。5’

3’

载体插入片断4.防止载体自身环化连接（1）提高插入片断的用量连接反应体42五、载体和外源DNA插入片段的连接结果五、载体和外源DNA插入片段的连接结果431.载体自身环化连接2.载体之间互相连接3.插入片段互相连接4.一个载体与几个插入片段重组五、载体和外源DNA插入片段的连接结果5.几个载体与一个插入片段重组7（能存活）（能存活）（不能存活）（能存活）（能存活）1.载体自身环化连接2.载体之间互相连接3.插入片段互44

1972年，美国斯坦福大学的伯格（P.Berg）等人于把一种猿猴病毒的DNA与λ噬菌体DNA用同一种限制性内切酶切割后，再用DNA连接酶把这两种DNA分子连接起来，于是产生了一种新的重组DNA分子。1973年，科恩（S.Cohen）等人把一段外源DNA片段与质粒DNA连接起来，构成了一个重组质粒，并将该重组质粒转入大肠杆菌，第一次完整地建立起了基因克隆体系。1972年，美国斯坦福大学的伯格（P.Berg）等人45美国总统国家科学奖中国科学院爱因斯坦讲席教授、美国国家科学院院士、美国斯坦福大学教授斯坦利•科恩(StanleyN.Cohen)美国总统国家科学奖中国科学院爱因斯坦讲席教授、美国国家科学46StanleyCohen教授发明该专利时的笔记照片-重组DNA专利从批准该专利到该专利1997年12月2日失效的17年中，该专利一共许可了468家公司，两所大学共获得了许可费收入约2.55亿美元。

StanleyCohen教授发明该专利时的笔记照片-重组D472

重组体导入细菌细胞一、感受态大肠杆菌的制备二、重组DNA导入大肠杆菌1.热休克法2.电转化法4.体外包装的噬菌体的转导重组体导入细菌细胞3.农杆菌介导法2重组体导入细菌细胞一、感受态大肠杆菌的制备二、重组DN48重组体的转化受体细胞重组体的转化重组体的转化受体细胞重组体的转化49

由流动镶嵌模型发展而来的生物膜结构模型由流动镶嵌模型发展而来的生物膜结构模型50黑膜试验黑膜试验51不同分子通过无膜蛋白的人工脂双层不同分子通过无膜蛋白的人工脂双层521.目的增加受体菌细胞膜的通透性。一、感受态大肠杆菌的制备1.目的增加受体菌细胞膜的通透性。一、感受态大肠杆菌的制备53

原核细胞的转化（细菌转化）1)受体细胞的选择限制缺陷型:

避免修饰和降解重组缺陷型：

避免重组整合转化亲和型：

较高的可转化性遗传互补型：

利于筛选感染缺陷型：

防止感染实验中使用的受体细胞为大肠杆菌DH5alpha菌株。原核细胞的转化（细菌转化）1)受体细胞的选择限制缺陷型:54使用丧失了限制体系的大肠杆菌。如K12系列的大肠杆菌。2.菌种使用丧失了限制体系的大肠杆菌。如K12系列的大肠杆菌。2.55基因的体外重组和转化课件56用CaCl2处理大肠杆菌，能增加膜的通透性。3.制备原理用CaCl2处理大肠杆菌，能增加膜的通透性。3.制备原理57CaCl2诱导转化特殊处理受体细胞细胞膜特性改变CaCl2诱导转化特殊处理受体细胞细胞膜特性改变58CaCl2处理受体细菌50-100mmol/LCaCl2

感受态细菌重组体转入细菌CaCl2处理受体细菌50-100mmol/LCaCl2594.制备过程培养大肠杆菌OD600至0.5Onice5-10min4℃离心3000g10min收集菌用冰冷的50mMCaCl2重悬4℃离心收集菌4℃离心收集菌分装、-70℃冻存用冰冷的50mMCaCl2重悬Onice30min用冰冷的50mMCaCl2重悬（15%甘油）3离心3重悬2冰浴4.制备过程培养大肠杆菌OD600至0.5Onice560CaCl2法制备感受态细胞流程１．将宿主菌在琼脂培养基平板上划线，37℃培养16～20小时。２．挑取单菌落转入10mlLB培养基（100ml-胰蛋白胨1g，酵母提取液0.5g，NaCl1g，dH2O）中，37℃振荡培养过夜。３．从中吸取1ml转入50mlLB培养基中37℃振荡培养，测OD600达0.4～0.6。４．培养物在冰浴中放置10分钟。５．取1.5ml加入预冷的Eppendorf管中，于5000rpm下室温离心2--5分钟。６．弃上清，加入1ml用冰预冷的0.05MCaCl2，混匀，置冰上10分钟。７．5000rpm4℃离心10分钟，弃上清，加100ul0.05MCaCl2重悬，置冰浴备用或于4℃短期保存。８．若欲将制备的感受态细胞长期保存，将制备的细胞重悬于含有15％甘油的0.05MCaCl2中，放入-80℃冰箱或液氮中冻存。。CaCl2法制备感受态细胞流程１．将宿主菌在琼脂培养基平板上61转化-热激发取制备好的感受态细胞，置于冰浴上；向感受态细胞中加入连接产物（不超过转化体系的1/10体积），柔和混匀后冰浴上放置30min；将连接体系放入42℃水浴中热激90sec；迅速转入冰浴2min；加入0.8mlLB培养基，37℃振荡培养45min；取适量培养物涂布于Amp+LB固体培养基，放入37℃培养箱中培养。转化-热激发取制备好的感受态细胞，置于冰浴上；62转化示意图转化示意图631. 0℃的CaCl2低渗溶液中，使细胞膨胀，同时Ca2+使细胞膜磷脂层形成液晶结构，使得位于外膜与内膜间隙中的部分核酸酶离开所在区域，这就构成了大肠杆菌人工诱导的感受态；2.加入DNA，Ca2+又与DNA结合形成羟基-磷酸钙复合物，并粘附在细菌细胞膜的外表面上；3.经短暂的42℃热脉冲处理后，细菌细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，随之出现许多间隙，致使通透性增加，DNA分子便趁机进入细胞内。1. 0℃的CaCl2低渗溶液中，使细胞膨胀，同时Ca264二、重组DNA导入大肠杆菌（1）转化（transformation)大肠杆菌捕获质粒DNA的过程。（2）转染（transfection)大肠杆菌捕获噬菌体DNA的过程。1.外源DNA导入细菌的几种方法（3）转导（transduction)借助噬菌体把外源DNA导入细菌的过程。二、重组DNA导入大肠杆菌（1）转化（transformat65每gDNA转化成功的细菌克隆数。3.转化方法

2.转化率简单，但转化效率不高（1）热休克法（heatshock）转化效率高（2）电转化法每gDNA转化成功的细菌克隆数。3.转化方法2.6610ng载体DNA100L感受态菌Onice混合，静置10分钟42ºC1分钟加入1mLLB培养基37℃摇1小时10-100L转化液涂含抗菌素的平板吸附DNA摄入DNA（1）热休克法10ng载体DNA100L感受态菌Onice混合，静置67电击法(Genetransferbyelectroporation)（2）高压电穿孔转化法电击法(Genetransferbyelectrop68LB培养受体菌至OD600=0.5-0.6冰浴15分钟，2°C离心集菌冰冷的水重悬菌体2°C离心集菌冰冷的水重悬菌体2°C离心收集菌体少量冰冷的水重悬分装成50-300L

电转仪调为2.5kV,25F

脉冲控制器200-400

0.5g质粒DNA

Onice混合加入1mLSOC培养液37°C中速震荡60分钟10-100L转化液涂含抗菌素的平板转化电转化法步骤：LB培养受体菌至OD600=0.5-0.6冰浴15分钟，2°694.平板培养基培养细菌10-100L转化液涂于含抗菌素的平板37℃过夜4.平板培养基培养细菌10-100L转化液涂于含抗菌素的70用氯化钙化学转化用氯化钙化学转化71环形重组质粒质粒自我连接:干扰因素②线性载体或DNA片断进入细菌会被降解。①环形质粒数（1）重组质粒

5.影响转化率的因素环形重组质粒②线性载体或DNA片断进入细菌会被降解。①环形72①生长状态制备感受态菌必须使用对数生长期的菌。②必须在冰冷的条件下制备。要充分，使细菌细胞膜失去一些蛋白。④储存感受态菌要在-70℃以下③CaCl2处理⑤使用感受态菌时必须迅速融化融化后一般不能再次冻存使用。（2）感受态细胞

（competentcells)①生长状态制备感受态菌必须使用对数生长期的菌。②必须在冰冷的73把重组的噬菌体DNA或Cosmid质粒DNA包装成具有感染能力的噬菌体颗粒。（1）体外包装（invitropackaging）

（2）转导（transduction）通过受体菌细胞表面的DNA接受器位点（receptorsite)，使带有外源基因的重组体DNA注入受体大肠杆菌进行扩增。3

重组噬菌体DNA的体外包装与转导把重组的噬菌体DNA或Cosmid质粒DNA包装成具有感染74基因的体外重组和转化课件75cI857基因是个温度敏感性阻遏蛋白基因，感染细菌后，在32℃下培养细菌时能够保持溶源性。

但当温度升高到44℃—45℃时，就会导致cI基因编码的阻遏蛋白失活，DNA复制、外壳蛋白合成。便于提取外壳蛋白。（3）cI857基因突变的噬菌体

但由于该噬菌体的S基因上有一个突变，所以细菌还不裂解。cI857基因是个温度敏感性阻遏蛋白基因，感染细菌后，在3276cI857其它基因溶源状态（DNA不转录、不翻译）DNA阻遏蛋白阻遏蛋白44℃—45℃DNA转录、翻译合成外壳蛋白32℃cI857其它基因溶源状态（DNA不转录、不翻译）DNA77噬菌体1外壳蛋白基因E发生了无义突变，不能合成头部蛋白，但能合成其它外壳蛋白（尾部蛋白）。在cI857基因突变的噬菌体的基础上，选择两种外壳蛋白的突变型噬菌体。（4）

互补型噬菌体

外壳蛋白基因D发生了无义突变，不能合成头部的包装识别蛋白，但能合成其它外壳蛋白（头部、尾部蛋白）。噬菌体2噬菌体1外壳蛋白基因E发生了无义突变，不能合成头部蛋白，但78(5)体外包装过程

(5)体外包装过程79体外包装好的重组噬菌体感染受体菌，使受体菌发生溶菌，形成噬菌斑。（每gDNA能形成106噬菌斑）。（6）

转导

7体外包装好的重组噬菌体感染受体菌，使受体菌发生溶菌，形成噬菌804重组克隆载体导入真核细胞一、导入酵母细胞二、导入植物细胞三、导入哺乳动物细胞外源基因导入真核细胞4重组克隆载体导入真核细胞一、导入酵母细胞二、导入植物细胞81转化率高的菌株；有突变的菌株（与导入的载体基因互补）；不育的菌株（不会与其他酵母接合）。一、导入酵母细胞1.菌株选择如：ura3-52,trp1-289,leu2-3,leu2-112,his31转化率高的菌株；一、导入酵母细胞1.菌株选择如：ura382（1）利用原生质球进行转化2.酵母的转化方法

酵母原生质球感受态酶去壁CaCl2、PEG插入外源基因的酵母载体PEG（聚乙二醇）使细胞壁具有通透性，允许DNA进入。CaCl2使细胞膜具有通透性，允许DNA进入。

转化（1）利用原生质球进行转化2.酵母的转化方法酵母原生质83原生质球(Spheroplast)指细胞壁未被全部去掉的细菌细胞，它呈圆球状，可以人为地通过溶菌酶或青霉素处理革兰氏阴性细菌而获得。该类菌细胞壁肽聚糖虽被除去，但外壁层中脂多糖、脂蛋白仍然保留，外壁的结构尚存。所以，原生质球较之原生质体对外界环境具一定抗性，并能在普通培养基上生长。原生质球(Spheroplast)指细胞壁未被全部去掉的84

酵母0.1mol/LLiCl处理插入外源基因的酵母载体感受态40%PEG4000（2）利用Li+盐进行转化酵母0.1mol/LLiCl处理插入外源基因的酵母载体感85叶盘消毒切取土壤农杆菌浸泡看护培养基愈伤组织分化幼苗二、导入植物细胞1.叶盘法（leafdisk)叶盘消毒切取土壤农杆菌浸泡看护培养基愈伤组织分化幼苗二、导入86植物细胞原生质体纤维素酶和果胶酶DNA混合入电击缓冲液电转仪1-2kV,3-25F电击愈伤组织幼苗分化2.电击法（electroporation)植物细胞原生质体纤维素酶和果胶酶DNA混合入电击缓冲液电转仪87又称高速微型子弹射击法（High-velocitymicroprojectiles)DNA1.2m钨弹头吸附特制手枪射击植物装入3.基因枪法（genegun）又称高速微型子弹射击法（High-velocitymicr88基因枪法(Biolistic-bombardment)支撑板基因枪法(Biolistic-bombardment)支撑板894.农杆菌（agrobacterium）介导4.农杆菌（agrobacterium）介导90基因的体外重组和转化课件91（1）原理：三、导入哺乳动物细胞1.磷酸钙沉淀法HEPES[4-羟乙基哌嗪乙磺酸;N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-2-乙烷磺酸]缓冲盐水（将1.6gNaCl、0.074gKCl、0.027gNa2HPO4.2H2O、0.2g葡聚糖(glucanordextran)和1gHEPES溶解在90ml的蒸馏水，用0.5MNaOH调节至所需pH值，再用蒸馏水定容至100ml即可。）与含有氯化钙和DNA的溶液缓慢混合，会形成含磷酸钙和DNA的沉淀。依据不同的细胞类型，平皿上最多能有10%的细胞能吸收DNA沉淀。（1）原理：三、导入哺乳动物细胞1.磷酸钙沉淀法HEPES92（2）特点：（2）特点：93脂质体有商业试剂盒（如LifeTechnologies）。2.脂质体（lipofectin）载体法脂类包埋DNA，通过细胞膜进入细胞。脂质体有商业试剂盒（如LifeTechnologies）。94直接把外源DNA注射到宿主细胞核里，使其整合到染色体上。3.显微注射法(microinjection)直接把外源DNA注射到宿主细胞核里，使其整合到染色体上。3.95二乙氨乙基（diethyl-aminoehtyl，DEAE）葡萄糖能促进哺乳动物细胞摄入外源DNA。4.DEAE---葡萄糖传染法葡聚糖葡聚糖+DNA吸附到细胞表面后被细胞吞入，部分DNA可以进入到细胞核里。二乙氨乙基（diethyl-aminoehtyl，DEAE）96DEAE-dextran细胞外源DNA预处理摄入DEAE-dextran外源DNA细胞混合DEAE-dextran对细胞有毒!5.病毒（virus）介导DEAE-dextran细胞外源DNA预处理摄入DEAE-d97外源基因导入细胞的方法7外源基因导入细胞的方法798演讲完毕，谢谢观看！演讲完毕，谢谢观看！99基因的体外重组和转化课件100外源DNA载体DNA重组分子原核细胞真核细胞扩增或表达表达连接转化或转导电穿孔或显微注射受体细胞7基因的体外重组与转化外源DNA载体DNA重组分子原核细胞真核细胞扩增或表达表达连1017基因的体外重组与转化1DNA片段的体外连接2重组体导入细菌细胞3重组噬菌体DNA的体外包装与转导4重组克隆载体导入哺乳动物细胞的转染7基因的体外重组与转化1DNA片段的体外连接2102重组过程中，需要考虑的因素：（1）连接效率高、易于筛选；（2）便于回收外源基因；（3）在载体的启动子控制之下，并置于正确的阅读框之中，以便表达。基因的重组是依赖于限制性内切酶、DNA连接酶和修饰酶的作用，分别对外源基因和载体进行适当切割和修饰后，将外源基因和载体巧妙地连接在一起。重组过程中，需要考虑的因素：基因的重组是依赖于限制性内切酶、1031DNA片段的体外连接一、粘性末端的连接二、平末端的连接三、PCR产物的连接四、体外连接应注意的事项五、体外连接的结果体外连接1DNA片段的体外连接一、粘性末端的连接二、平末端的连接104DNA连接酶：由大肠杆菌基因组DNA编码，以NAD+作为能源辅助因子。；只能连接粘性末端T4DNA连接酶：

由大肠杆菌T4噬菌体DNA编码，以ATP作为能源辅助因子。1970年：容易制备，而且可以连接平末端DNA分子及单链DNA(RNA)分子，所以在基因克隆中应用广泛。DNA连接酶：由大肠杆菌基因组DNA编码，以NAD+作为能105ＤＮＡ连接酶ＤＮＡ连接酶106基因的体外重组和转化课件107一、粘性末端的连接利用粘性末端单链间的碱基互补，并用DNA连接酶把相互靠近的5’端磷酸与3’-OH连到一起。一、粘性末端的连接利用粘性末端单链间的碱基互补，并用DNA连1081.两段DNA的连接依靠粘性末端1.两段DNA的连接依靠粘性末端1092.DNA片断与载体的连接依靠粘性末端2.DNA片断与载体的连接依靠粘性末端1103.载体与载体的连接3.载体与载体的连接111二、平末端（bluntend）的连接5’端与3’端并列靠近的时间太短，不容易被连接酶连接。1.直接连接T4DNA连接酶虽然能连接平末端，但效率很低，只有粘性末端的1%。5’

5’

5’

5’

3’

3’

3’

3’

-OH-OH-P-PP-P-HO-HO-5’

3’

-OH-PP-HO-5’

3’

二、平末端（bluntend）的连接5’端与3’端并列靠近1121972年，斯坦福大学的P.Labban和P.Kaiser提出。（1）同聚物加尾法

2.人工加尾形成“粘性末端”

末端脱氧核苷酸转移酶能在没有模板的情况下给DNA的3’-OH端加上脱氧核苷酸。①原理：分别给载体和插入片断加上互补的核苷酸。②加尾—碱基互补1972年，斯坦福大学的P.Labban和P.Kaise113④缺点：③优点：能把任何片段连接起来不能把插入片段再切下来。非酶切位点④缺点：③优点：能把任何片段连接起来不能把插入片段再切下来。114用T4DNA连接酶连到平端DNA上，然后再用酶切，形成一个人工粘性末端。（2）衔接物(linker)连接①linker用化学合成法合成的一段10-12bp的特定限制性内切酶识别位点序列的平端双链。GGAATTCCCCTTAAGGEcoRIlinker：②linker的作用用T4DNA连接酶连到平端DNA上，然后再用酶切，形成一个115

116

117④缺点：1）可以用内切酶把插入片段切下来。如果插入片段内部也有该酶位点，不能切下完整的插入片段2）能给载体连接上Polylinker:③优点：④缺点：1）可以用内切酶把插入片段切下来。如果插入片段内部也118（3）DNA接头(adapter)连接法1978年康内尔大学的吴瑞教授发明。5‘p-GATCCCGG-OH3’

GGCC-p5’

BamHIadapter用T4DNA连接酶连到DNA分子的两端，直接成为人工粘性末端。①adapter一头平末端、另一头粘性末端（某种酶切位点序列）。②adapter的作用（3）DNA接头(adapter)连接法1978年康内尔大119Blunt-endedDNA5’p-GATCCCGG-OH3’

HO-GGCC-p5’

BamHIadapterP--P5‘p-GATCCCGG-GGCC--CCGG-GGCCCTAG-P5’

5‘p-GATCCCGG-GGCC-CCGGGGCCCTAG-P5’

CCGGGATCCCGG-OHGGCCCTAGGGCC-P5’

接头自我连接Blunt-endedDNA5’p-GATCCCGG-OH120基因的体外重组和转化课件121接头与接头会彼此以粘性末端接在一起，影响与DNA片段的连接。③优点：连上后就能用。④缺点：先用小牛肠碱性磷酸酶（CIP）处理接头，水解掉其5’端的磷酸，防止自我连接。（以后再用T4多核苷酸激酶加上磷酸。）⑤防止自我连接接头与接头会彼此以粘性末端接在一起，影响与DNA片段的连接。122碱性磷酸酶处理质粒载体为了提高连接效率，一般采取提高ＤＮＡ的浓度，增加重组子比例。这样就会出现ＤＮＡ自生连接问题，为此通常选择对质粒载体用碱性磷酸酶处理，除去其５’末端的磷酸基，防止环化，通过接反应后形成的缺口可在转化细胞后得以修复。碱性磷酸酶处理质粒载体为了提高连接效率，一般采取提高ＤＮＡ的123载体自连及去磷酸化示意图载体自连及去磷酸化示意图124常用碱性磷酸酶BAP（大肠杆菌）CIP(小牛肠)分子量80,000温度60℃—65℃最适PH8.0热稳定性好，100℃暂时性失活，室温放置可恢复活性，苯酚完全失活分子量100,000温度37℃最适PH10.0附近（高底物浓度）PH8.0附近（低底物浓度）65℃30分钟处理99％的活性不可逆失活，随具体条件改变有变动，完全失活苯酚处理常用碱性磷酸酶BAP（大肠杆菌）CIP(小牛肠)分子量801255‘p-GATCCCGG-OHHO-GGCC-PP-CCGG-OHHO-GGCCCTAG-P5’

CCGGGATCCCGG-OHHO-GGCCCTAGGGCC5’

接头之间不能形成磷酸二酯键自我连接！5‘GATCCCGG-OHHO-GGCC5’

5’CCGG-OHHO-GGCCCTAG5’

CIP处理-OHHO-5‘p-GATCCCGG-OHP-CCGG-OH126Blunt-endedDNA5’p-GATCCCGG-OH3’

HO-GGCC-p5’

BamHIadapterP--P5‘GATCCCGG-HO-GGCCCCGG-OH-GGCCCTAG5’

5’HO-GATCCCGG-OH3’

HO-GGCC5’

缺口缺口HO--OHCIP处理T4ligase虽然有缺口，但仍然能与DNA片断连接。Blunt-endedDNA5’p-GATCCCGG-OH127基因的体外重组和转化课件128连接体系载体DNA50ng0.5ul目的DNA19ng?ul双蒸水?ul5ul连接反应液（2×）5ul总体积10ul用加样器柔和吹打混匀,16℃连接2小时。附注：载体和目的基因的摩尔比为1:350ng:5.4kb=6.3ng:0.7kb6.3ng*3=19ng连接体系载体DNA1291.载体和插入片段的摩尔浓度比载体：插入片段的摩尔数的变化范围可为8：1到1：16，但通常的变化范围是3：1到1：3。在最小的反应体积中，通常一个连接反应用10-50ng的载体DNA。2.平末端连接在22℃保温4-16小时，粘性末端在22℃保温3小时，或16℃保温16小时。大多数连接反应用T4DNA连接酶，但大肠杆菌的DNA连接酶可用于粘性末端的连接，平末端连接时用此酶，活力较低。3.载体和插入片段的纯度应较高，溶解的溶剂最好使用灭菌的双蒸水而不是TE，毕竟TE中含有离子，可能影响连接反应。连接反应中值得注意的几个问题1.载体和插入片段的摩尔浓度比载体：插入片段的摩尔数的变化130三、PCR产物的连接1.在引物的5’端设计酶切位点符合载体的多克隆位点；（1）设计原则（2）带酶切位点的引物的结构3’端15~20bp与模板互补；5’端6~10bp是某个内切酶的识别序列。（5’端多余的3~5bp属保护碱基）避免与所扩增的DNA片断内部酶切位点重复。三、PCR产物的连接1.在引物的5’端设计酶切位点符合载体131引物1GCAGAATTC

互补序列模板EcoRI位点5’--3’

GCAGAATTC

互补序列5’--3’

3’

模板GCAGAATTC

互补序列PCR产物5’--3’

3’

复性延伸模板模板3’

3’

引物1GCAGAATTC互补序列模板EcoRI位点5’--132GCTAGCCGG

互补序列模板BamHI位点-5’

3-’

5’

复性延伸模板模板3’

3’

GCTAGCCGG

互补序列-5’

3’-模板5’

GCTAGCCGG

PCR产物

互补序列-5’

3’-引物2GCTAGCCGG互补序列模板BamHI位点-5’3133带酶切位点的PCR产物GCAGAATTC

PCR产物5’--3’

GCTAGCCGG

PCR产物-5’

3’-CGTCTTAAGCGATCGGCCEcoRI位点BamHI位点AATTC

PCR产物5’--3’

GCTAG

PCR产物-5’

3’-GCEcoRIBamHI两头各有一个粘性末端！带酶切位点的PCR产物GCAGAATTCPCR产物5’--1342.与T载体直接连接（1）PCR产物两个3’端一般都有一个ATaqDNA聚合酶的特性：在DNA双链的3’端再加上一个多余的核苷酸（优先加A）。（2）T载体的两个3’端人为地各加一个T利用TaqDNA聚合酶，当原料中只有dTTP时，被迫在平端载体上添加T！2.与T载体直接连接（1）PCR产物两个3’端一般都有一个135AAdNTPTTdTTPTaqDNA聚合酶载体PCR产物TATAAAdNTPTTdTTPTaqDNA聚合酶载体PCR产物T136四、DNA体外连接应注意的事项插入片断与载体的酶切位点互补相同的粘性末端才能有效地连接。尽量避免平端连接。四、DNA体外连接应注意的事项插入片断与载体的酶切位点互补相137EcoRIEcoRIEcoRI（1）用相同的酶切（2）用同尾酶切BamHI、BclI、BglII、Sau3AI、XhoII都产生GATC4个碱基的粘性末端。EcoRIEcoRIEcoRI（1）用相同的酶切（2）用同尾1382.DNA插入的方向正确（1）用双酶切由于产生的粘性末端不同，只能以固定方向连接。EcoRIBamHIEcoRIBamHIEcoRIBamHI2.DNA插入的方向正确（1）用双酶切由于产生的粘性末端不1393.插入基因的开放阅读框（ORF）正确（1）DNA定向插入（2）起始密码尤其当载体上有ATG起始密码的时候，更要注意。ATGGAATTC载体ATGCGGAATTCT插入片断EcoRIEcoRIATGGAATTCT重组但移码突变！3.插入基因的开放阅读框（ORF）正确（1）DNA定向插入1404.防止载体自身环化连接（1）提高插入片断的用量连接反应体系中，插入片断比载体多10倍以上。（2）用碱性磷酸酶处理载体载体切口的5’磷酸被除去，不能自我连接。但可以与插入片断以单链连接。5’

3’

载体插入片断4.防止载体自身环化连接（1）提高插入片断的用量连接反应体141五、载体和外源DNA插入片段的连接结果五、载体和外源DNA插入片段的连接结果1421.载体自身环化连接2.载体之间互相连接3.插入片段互相连接4.一个载体与几个插入片段重组五、载体和外源DNA插入片段的连接结果5.几个载体与一个插入片段重组7（能存活）（能存活）（不能存活）（能存活）（能存活）1.载体自身环化连接2.载体之间互相连接3.插入片段互143

1972年，美国斯坦福大学的伯格（P.Berg）等人于把一种猿猴病毒的DNA与λ噬菌体DNA用同一种限制性内切酶切割后，再用DNA连接酶把这两种DNA分子连接起来，于是产生了一种新的重组DNA分子。1973年，科恩（S.Cohen）等人把一段外源DNA片段与质粒DNA连接起来，构成了一个重组质粒，并将该重组质粒转入大肠杆菌，第一次完整地建立起了基因克隆体系。1972年，美国斯坦福大学的伯格（P.Berg）等人144美国总统国家科学奖中国科学院爱因斯坦讲席教授、美国国家科学院院士、美国斯坦福大学教授斯坦利•科恩(StanleyN.Cohen)美国总统国家科学奖中国科学院爱因斯坦讲席教授、美国国家科学145StanleyCohen教授发明该专利时的笔记照片-重组DNA专利从批准该专利到该专利1997年12月2日失效的17年中，该专利一共许可了468家公司，两所大学共获得了许可费收入约2.55亿美元。

StanleyCohen教授发明该专利时的笔记照片-重组D1462

重组体导入细菌细胞一、感受态大肠杆菌的制备二、重组DNA导入大肠杆菌1.热休克法2.电转化法4.体外包装的噬菌体的转导重组体导入细菌细胞3.农杆菌介导法2重组体导入细菌细胞一、感受态大肠杆菌的制备二、重组DN147重组体的转化受体细胞重组体的转化重组体的转化受体细胞重组体的转化148

由流动镶嵌模型发展而来的生物膜结构模型由流动镶嵌模型发展而来的生物膜结构模型149黑膜试验黑膜试验150不同分子通过无膜蛋白的人工脂双层不同分子通过无膜蛋白的人工脂双层1511.目的增加受体菌细胞膜的通透性。一、感受态大肠杆菌的制备1.目的增加受体菌细胞膜的通透性。一、感受态大肠杆菌的制备152

原核细胞的转化（细菌转化）1)受体细胞的选择限制缺陷型:

避免修饰和降解重组缺陷型：

避免重组整合转化亲和型：

较高的可转化性遗传互补型：

利于筛选感染缺陷型：

防止感染实验中使用的受体细胞为大肠杆菌DH5alpha菌株。原核细胞的转化（细菌转化）1)受体细胞的选择限制缺陷型:153使用丧失了限制体系的大肠杆菌。如K12系列的大肠杆菌。2.菌种使用丧失了限制体系的大肠杆菌。如K12系列的大肠杆菌。2.154基因的体外重组和转化课件155用CaCl2处理大肠杆菌，能增加膜的通透性。3.制备原理用CaCl2处理大肠杆菌，能增加膜的通透性。3.制备原理156CaCl2诱导转化特殊处理受体细胞细胞膜特性改变CaCl2诱导转化特殊处理受体细胞细胞膜特性改变157CaCl2处理受体细菌50-100mmol/LCaCl2

感受态细菌重组体转入细菌CaCl2处理受体细菌50-100mmol/LCaCl21584.制备过程培养大肠杆菌OD600至0.5Onice5-10min4℃离心3000g10min收集菌用冰冷的50mMCaCl2重悬4℃离心收集菌4℃离心收集菌分装、-70℃冻存用冰冷的50mMCaCl2重悬Onice30min用冰冷的50mMCaCl2重悬（15%甘油）3离心3重悬2冰浴4.制备过程培养大肠杆菌OD600至0.5Onice5159CaCl2法制备感受态细胞流程１．将宿主菌在琼脂培养基平板上划线，37℃培养16～20小时。２．挑取单菌落转入10mlLB培养基（100ml-胰蛋白胨1g，酵母提取液0.5g，NaCl1g，dH2O）中，37℃振荡培养过夜。３．从中吸取1ml转入50mlLB培养基中37℃振荡培养，测OD600达0.4～0.6。４．培养物在冰浴中放置10分钟。５．取1.5ml加入预冷的Eppendorf管中，于5000rpm下室温离心2--5分钟。６．弃上清，加入1ml用冰预冷的0.05MCaCl2，混匀，置冰上10分钟。７．5000rpm4℃离心10分钟，弃上清，加100ul0.05MCaCl2重悬，置冰浴备用或于4℃短期保存。８．若欲将制备的感受态细胞长期保存，将制备的细胞重悬于含有15％甘油的0.05MCaCl2中，放入-80℃冰箱或液氮中冻存。。CaCl2法制备感受态细胞流程１．将宿主菌在琼脂培养基平板上160转化-热激发取制备好的感受态细胞，置于冰浴上；向感受态细胞中加入连接产物（不超过转化体系的1/10体积），柔和混匀后冰浴上放置30min；将连接体系放入42℃水浴中热激90sec；迅速转入冰浴2min；加入0.8mlLB培养基，37℃振荡培养45min；取适量培养物涂布于Amp+LB固体培养基，放入37℃培养箱中培养。转化-热激发取制备好的感受态细胞，置于冰浴上；161转化示意图转化示意图1621. 0℃的CaCl2低渗溶液中，使细胞膨胀，同时Ca2+使细胞膜磷脂层形成液晶结构，使得位于外膜与内膜间隙中的部分核酸酶离开所在区域，这就构成了大肠杆菌人工诱导的感受态；2.加入DNA，Ca2+又与DNA结合形成羟基-磷酸钙复合物，并粘附在细菌细胞膜的外表面上；3.经短暂的42℃热脉冲处理后，细菌细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，随之出现许多间隙，致使通透性增加，DNA分子便趁机进入细胞内。1. 0℃的CaCl2低渗溶液中，使细胞膨胀，同时Ca2163二、重组DNA导入大肠杆菌（1）转化（transformation)大肠杆菌捕获质粒DNA的过程。（2）转染（transfection)大肠杆菌捕获噬菌体DNA的过程。1.外源DNA导入细菌的几种方法（3）转导（transduction)借助噬菌体把外源DNA导入细菌的过程。二、重组DNA导入大肠杆菌（1）转化（transformat164每gDNA转化成功的细菌克隆数。3.转化方法

2.转化率简单，但转化效率不高（1）热休克法（heatshock）转化效率高（2）电转化法每gDNA转化成功的细菌克隆数。3.转化方法2.16510ng载体DNA100L感受态菌Onice混合，静置10分钟42ºC1分钟加入1mLLB培养基37℃摇1小时10-100L转化液涂含抗菌素的平板吸附DNA摄入DNA（1）热休克法10ng载体DNA100L感受态菌Onice混合，静置166电击法(Genetransferbyelectroporation)（2）高压电穿孔转化法电击法(Genetransferbyelectrop167LB培养受体菌至OD600=0.5-0.6冰浴15分钟，2°C离心集菌冰冷的水重悬菌体2°C离心集菌冰冷的水重悬菌体2°C离心收集菌体少量冰冷的水重悬分装成50-300L

电转仪调为2.5kV,25F

脉冲控制器200-400

0.5g质粒DNA

Onice混合加入1mLSOC培养液37°C中速震荡60分钟10-100L转化液涂含抗菌素的平板转化电转化法步骤：LB培养受体菌至OD600=0.5-0.6冰浴15分钟，2°1684.平板培养基培养细菌10-100L转化液涂于含抗菌素的平板37℃过夜4.平板培养基培养细菌10-100L转化液涂于含抗菌素的169用氯化钙化学转化用氯化钙化学转化170环形重组质粒质粒自我连接:干扰因素②线性载体或DNA片断进入细菌会被降解。①环形质粒数（1）重组质粒

5.影响转化率的因素环形重组质粒②线性载体或DNA片断进入细菌会被降解。①环形171①生长状态制备感受态菌必须使用对数生长期的菌。②必须在冰冷的条件下制备。要充分，使细菌细胞膜失去一些蛋白。④储存感受态菌要在-70℃以下③CaCl2处理⑤使用感受态菌时必须迅速融化融化后一般不能再次冻存使用。（2）感受态细胞

（competentcells)①生长状态制备感受态菌必须使用对数生长期的菌。②必须在冰冷的172把重组的噬菌体DNA或Cosmid质粒DNA包装成具有感染能力的噬菌体颗粒。（1）体外包装（invitropackaging）

（2）转导（transduction）通过受体菌细胞表面的DNA接受器位点（receptorsite)，使带有外源基因的重组体DNA注入受体大肠杆菌进行扩增。3

重组噬菌体DNA的体外包装与转导把重组的噬菌体DNA或Cosmid质粒DNA包装成具有感染173基因的体外重组和转化课件174cI857基因是个温度敏感性阻遏蛋白基因，感染细菌后，在32℃下培养细菌时能够保持溶源性。

但当温度升高到44℃—45℃时，就会导致cI基因编码的阻遏蛋白失活，DNA复制、外壳蛋白合成。便于提取外壳蛋白。（3）cI857基因突变的噬菌体

但由于该噬菌体的S基因上有一个突变，所以细菌还不裂解。cI857基因是个温度敏感性阻遏蛋白基因，感染细菌后，在32175cI857其它基因溶源状态