时间分辨荧光免疫分析技术课件

时间分辨荧光免疫分析技术王征达瑞抗体1a时间分辨荧光免疫分析技术1a标记免疫学分析技术发展历程免疫荧光分析(Coons,1941)放射免疫分析(Berson和Yalow,1960)酶免ELISA(Engvall,1971)金标免疫分析(Faulk和Taylor,1971)化学发光免疫分析(Arakawa，1977)时间分辨荧光免疫分析(Soini和Hemmila，1979)电化学发光免疫分析(Leland,1990)液相芯片(美国Luminex公司,1997)2a标记免疫学分析技术发展历程2a①免疫荧光②放射免疫④化学发光⑥电化学发光

⑤时间分辨荧光③酶联免疫3a①免疫荧光②放射免疫④化学发光⑥电化学发光⑤时间分辨荧光③标记免疫技术的理论检测灵敏度放射免疫 10-10-10-12mol酶联免疫 10-9-10-10mol化学发光 10-15mol时间分辨荧光10-18mol电化学发光 10-18mol4a标记免疫技术的理论检测灵敏度放射免疫 10-10-1一、时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）

（Time-resolvedfluorescenceimmunoassay）

背景介绍基本原理技术特点反应模式5a一、时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）

（Time-reso背景介绍1979年，芬兰Wallac公司研发部的Soini和Hemmila首次提出了建立稀土离子标记物的“时间分辨荧光免疫分析”理论1983年，Soini和Kojola首先开发出以镧系元素为示踪物的时间分辨荧光测量仪，建立了新的非放射性微量分析检测技术。同一年，Pettersson等人运用此仪器首次对人绒膜促性腺激素

(hCG)进行了时间分辨荧光免疫分析1984年，Hemmila确定了DELFIA(DissociationEnhancedLanthanideFluoroimmunoassay)这种时间分辨免疫分析技术方案,从而使DELFIA成为Wallac的专利技术1988年，加拿大CyberFluor公司的Diamandis创立了一种不同于DELFIA的时间分辨荧光免疫分析，即FIAgen2003年，时间分辨荧光分析技术获国家科技进步二等奖6a背景介绍1979年，芬兰Wallac公司研发部的Soini基本原理三价稀土离子包括有铕(Eu)，钐（Sm)，铽

(Tb)，镝

(Dy)等，它们的荧光光谱具有特异性强﹑Stokes位移大﹑寿命长的特点DELFIA采用异硫氰酸苄基二亚乙基三胺四乙酸铕(DTTA-Eu)为双功能螯合试剂，其一端螯合Eu3+，另一端可与蛋白质的-NH2连接。在中性或接近中性pH条件下，DTTA与Eu3+具有足够的螯合稳定性，而在增强液（呈酸性）作用下，DTTA-Eu又能将螯合的Eu3+迅速、彻底地释放出来并与增强液中的配体螯合﹑进入胶束的疏水内核，使Eu3+荧光得以成千万倍地放大FIAgen采用的是以Eu3+螯合物配基BCPDA为标记物，通过检测其与过量Eu3+形成的螯合物荧光进行定量。由于BCPDA的可检测性不够理想，FIAgen需要利用生物素-亲合素信号放大来弥补BCPDA检测灵敏度的不足7a基本原理三价稀土离子包括有铕(Eu)，钐（Sm)，铽(TbDELFIA标记技术碱性8aDELFIA标记技术碱性8a时间:(µs）04008001000340nm激发光第二个循环荧光短寿命荧光613nm长寿命荧光延迟时间测值时间通过时间延迟，将特异性荧光与非特异性荧光分辨开来，使理论本底达到09a时间:(µs）04008001000340nm激发光第二个循300400500600荧光强度激发光发射光波长(nm)10a300400500600荧光强度激发光发射光波长(nm)10TbDyEuSm500发射光强度2004000延迟时间(µs)600发射光波长(nm)500发射光强度0延迟时间(µs)11aTbDyEuSm500发射光强度2004000延迟时间(µsTRFIA技术特点极长的荧光衰退时间

铕：730000ns

Stokes位移大

铕：激发光340nm，发射光613nm狭窄的发射峰解离-增强技术可使其荧光性提高100万倍12aTRFIA技术特点极长的荧光衰退时间12a固相包被抗体铕标记抗体孵育Eu待测抗原++EuEu+增强液+Eu双抗体夹心法示意图13a固相包被抗体铕标记抗体孵育Eu待测抗原++EuEu+增强液+双抗原夹心法示意图Eu++孵育+Eu孵育增强液+Eu固相包被抗原待测抗体铕标记抗原14a双抗原夹心法示意图Eu++孵育+Eu孵育增强液+Eu固相包被中和法示意图(回滴定法)++孵育+Eu孵育EuEu增强液++Eu待测抗体铕标记抗体中和抗原15a中和法示意图(回滴定法)++孵育+Eu孵育EuEu增强液++小分子抗原竞争抑制示意图固相包被二抗+孵育++Eu孵育Eu待测抗原铕标抗原Eu增强液++Eu一抗16a小分子抗原竞争抑制示意图固相包被二抗+孵育++Eu孵育Eu待时间分辨技术重点和难点固定相（96孔板）标准品铕标记物17a时间分辨技术重点和难点固定相（96孔板）17a二、时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）

测试仪18a二、时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）

测试仪18a目前的TRFIA测试仪：国外仪器（Wallac公司<PerkinElmer>）国内其他公司生产的仪器(上海新波、广州丰华等)达瑞抗体公司自主研发的仪器及软件（DR-M6601）19a目前的TRFIA测试仪：国外仪器（Wallac公司<PerkWallacAutoDELFIA123520aWallacAutoDELFIA123520a半自动VICTOR2142021a半自动VICTOR2142021a半自动ANYTEST200022a半自动ANYTEST200022aDR-M6601时间分辨荧光免疫分析仪【粤食药管械（准）字2005第2400226】23aDR-M6601时间分辨荧光免疫分析仪【粤食药管械（准）字2达瑞公司开发的系列TRF试剂内分泌科检查甲状腺系列：T3、T4、FT3、FT4、TSH、TBG、TG、TGAb、TPoAb糖尿病系列：insulin、C-Peptide

生长激素：hGH

其他：Cortisol肿瘤科检查AFP、CEA、tPSA、β2-MG

、hTG、CA-242、CA-724、CA-50

、

fPSA、NSE、cyfra211、CA-199、CA-125、CA153传染病检查乙肝系列：HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb其他：HCV、HIV妇产科检查FSH、LH、hCG、Prolactin、Progesterone、SHBG、β-hCG、PAPP-A、Testosterone

、uE3、E2血液科检查贫血检查：（Ferritin、VitB12、叶酸）遗传科检查产前筛查：hAFP/Freeβ-hCG新生儿筛查：Neo.hTSH、Neo.T4、Neo.17α-OH-Prog24a达瑞公司开发的系列TRF试剂内分泌科检查甲状腺系列：T3、T标准品铕标记物25a标准品铕标记物25aThanks26aThanks26a时间分辨荧光免疫分析技术王征达瑞抗体27a时间分辨荧光免疫分析技术1a标记免疫学分析技术发展历程免疫荧光分析(Coons,1941)放射免疫分析(Berson和Yalow,1960)酶免ELISA(Engvall,1971)金标免疫分析(Faulk和Taylor,1971)化学发光免疫分析(Arakawa，1977)时间分辨荧光免疫分析(Soini和Hemmila，1979)电化学发光免疫分析(Leland,1990)液相芯片(美国Luminex公司,1997)28a标记免疫学分析技术发展历程2a①免疫荧光②放射免疫④化学发光⑥电化学发光

⑤时间分辨荧光③酶联免疫29a①免疫荧光②放射免疫④化学发光⑥电化学发光⑤时间分辨荧光③标记免疫技术的理论检测灵敏度放射免疫 10-10-10-12mol酶联免疫 10-9-10-10mol化学发光 10-15mol时间分辨荧光10-18mol电化学发光 10-18mol30a标记免疫技术的理论检测灵敏度放射免疫 10-10-1一、时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）

（Time-resolvedfluorescenceimmunoassay）

背景介绍基本原理技术特点反应模式31a一、时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）

（Time-reso背景介绍1979年，芬兰Wallac公司研发部的Soini和Hemmila首次提出了建立稀土离子标记物的“时间分辨荧光免疫分析”理论1983年，Soini和Kojola首先开发出以镧系元素为示踪物的时间分辨荧光测量仪，建立了新的非放射性微量分析检测技术。同一年，Pettersson等人运用此仪器首次对人绒膜促性腺激素

(hCG)进行了时间分辨荧光免疫分析1984年，Hemmila确定了DELFIA(DissociationEnhancedLanthanideFluoroimmunoassay)这种时间分辨免疫分析技术方案,从而使DELFIA成为Wallac的专利技术1988年，加拿大CyberFluor公司的Diamandis创立了一种不同于DELFIA的时间分辨荧光免疫分析，即FIAgen2003年，时间分辨荧光分析技术获国家科技进步二等奖32a背景介绍1979年，芬兰Wallac公司研发部的Soini基本原理三价稀土离子包括有铕(Eu)，钐（Sm)，铽

(Tb)，镝

(Dy)等，它们的荧光光谱具有特异性强﹑Stokes位移大﹑寿命长的特点DELFIA采用异硫氰酸苄基二亚乙基三胺四乙酸铕(DTTA-Eu)为双功能螯合试剂，其一端螯合Eu3+，另一端可与蛋白质的-NH2连接。在中性或接近中性pH条件下，DTTA与Eu3+具有足够的螯合稳定性，而在增强液（呈酸性）作用下，DTTA-Eu又能将螯合的Eu3+迅速、彻底地释放出来并与增强液中的配体螯合﹑进入胶束的疏水内核，使Eu3+荧光得以成千万倍地放大FIAgen采用的是以Eu3+螯合物配基BCPDA为标记物，通过检测其与过量Eu3+形成的螯合物荧光进行定量。由于BCPDA的可检测性不够理想，FIAgen需要利用生物素-亲合素信号放大来弥补BCPDA检测灵敏度的不足33a基本原理三价稀土离子包括有铕(Eu)，钐（Sm)，铽(TbDELFIA标记技术碱性34aDELFIA标记技术碱性8a时间:(µs）04008001000340nm激发光第二个循环荧光短寿命荧光613nm长寿命荧光延迟时间测值时间通过时间延迟，将特异性荧光与非特异性荧光分辨开来，使理论本底达到035a时间:(µs）04008001000340nm激发光第二个循300400500600荧光强度激发光发射光波长(nm)36a300400500600荧光强度激发光发射光波长(nm)10TbDyEuSm500发射光强度2004000延迟时间(µs)600发射光波长(nm)500发射光强度0延迟时间(µs)37aTbDyEuSm500发射光强度2004000延迟时间(µsTRFIA技术特点极长的荧光衰退时间

铕：730000ns

Stokes位移大

铕：激发光340nm，发射光613nm狭窄的发射峰解离-增强技术可使其荧光性提高100万倍38aTRFIA技术特点极长的荧光衰退时间12a固相包被抗体铕标记抗体孵育Eu待测抗原++EuEu+增强液+Eu双抗体夹心法示意图39a固相包被抗体铕标记抗体孵育Eu待测抗原++EuEu+增强液+双抗原夹心法示意图Eu++孵育+Eu孵育增强液+Eu固相包被抗原待测抗体铕标记抗原40a双抗原夹心法示意图Eu++孵育+Eu孵育增强液+Eu固相包被中和法示意图(回滴定法)++孵育+Eu孵育EuEu增强液++Eu待测抗体铕标记抗体中和抗原41a中和法示意图(回滴定法)++孵育+Eu孵育EuEu增强液++小分子抗原竞争抑制示意图固相包被二抗+孵育++Eu孵育Eu待测抗原铕标抗原Eu增强液++Eu一抗42a小分子抗原竞争抑制示意图固相包被二抗+孵育++Eu孵育Eu待时间分辨技术重点和难点固定相（96孔板）标准品铕标记物43a时间分辨技术重点和难点固定相（96孔板）17a二、时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）

测试仪44a二、时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）

测试仪18a目前的TRFIA测试仪：国外仪器（Wallac公司<PerkinElmer>）国内其他公司生产的仪器(上海新波、广州丰华等)达瑞抗体公司自主研发的仪器及软件（DR-M6601）45a目前的TRFIA测试仪：国外仪器（Wallac公司<PerkWallacAutoDELFIA123546aWallacAutoDELFIA123520a半自动VICTOR2142047a半自动VIC