基因工程药物-促红细胞生成素课件

基因工程药物

——促红细胞生成素（EPO）

基因工程药物

——促红细胞生成素（EPO）

1基因工程药物——促红细胞生成素课件2什么是EPO？EPO：是促红细胞生成素（Erythropoietin）的英文简称。促红细胞生成素：最初是从肾脏中分离出来能刺激前体红细胞增生、分化的一种细胞因子。人体血液中的促红细胞生成素：是由肾脏和肝脏分泌的一种激素样物质，能够促进红细胞生成。它与其受体(EPO-R)结合后共同介导缺氧的生理反应。什么是EPO？EPO：是促红细胞生成素（Erythropoi3EPO的用途医疗用途：增加红血球的数目，用于贫血、组织断离、早产儿，用在癌学和血液学方面。体育用途(兴奋剂)：增加训练耐力和训练负荷，属于国际奥委会规定的违禁药物。在2008年北京奥运会中第一例的兴奋剂。EPO的用途医疗用途：增加红血球的数目，用于贫血、组织断离、4EPO的疗效1、肾性贫血患者EPO水平较低，在进行治疗过程中，往往通过注射EPO来提高体内EPO水平进行治疗，从而帮助病人增加红细胞数量，此时EPO水平有所上升。2、其他贫血如缺铁性贫血、巨细胞性贫血患者EPO水平不降低，但也可以使用EPO治疗，此时浓度也会有所升高。3、再生障碍性贫血和骨髓造血功能不全患者EPO水平升高。EPO的疗效1、肾性贫血患者EPO水平较低，在进行治疗过程5EPO的纯化历史1、Miyake的七步法：纯化步骤太多，对设备及操作要求也较高，不适合工业生产的特点。2、Spivik利用凝集素亲和层析纯化EPO：由于凝集素亲和层析凝胶易被杂蛋白不可逆吸附，使得分离效果降低，成本增高，也不利于大规模生产。3、近年来则利用三步层析法三步纯化基本流程等。EPO的纯化历史1、Miyake的七步法：纯化步骤太多，对设6EPO的工艺流程

——①三步层析法1、染料配基亲和层析→反相疏水层析→离子交换层析;2、染料配基亲和层析→反相疏水层析→分子筛层析;3、反相疏水层析→离子交换层析→分子筛层析。EPO的工艺流程

——①三步层析法1、染料配基亲和层析→反7EPO的工艺流程

——②三步纯化基本流程第一步：反相柱色谱样品浓缩约96.7%透析第二步：DEAE-离子交换色谱第三步：分子筛色谱

总回收率〉30%

比活1.5*108U/g蛋白EPO的工艺流程

——②三步纯化基本流程第一步：反相柱色谱8第一步：反相色谱C6

反相柱（2cm*2cm）（创新生物技术公司）流程：上样50ml/min（柱结合量约5mg蛋白/ml介质)

去离子水平衡至检测基线

10%~80%乙醇胍线性梯度洗脱检测并收集含EPO主峰

ELISA测定结果：60%乙醇-1mol/L盐酸胍洗出EPO第一步：反相色谱C6反相柱（2cm*2cm）（创新生9透析透析液：10倍体积的10mmol/LTris.HCl(pH7.5)-2%蔗糖缓冲液透析次数：2时间：5~6h透析透析液：10倍体积的10mmol/LTris.HCl10第二步：离子交换柱DEAE型离子交换柱流程：

10mmol/LTris.HCl(pH7.5)缓冲液平上样20ml/min（柱结合量20mg/ml）

10mmol/LTris.HCl(pH7.5)缓冲液平衡至基线添加NaCl入缓冲液，进行截状梯度洗脱（NaCl浓度分别为：50，70，125mmol/L）结果：ELISA检测盒表明75mmol/L洗脱峰中含EPO第二步：离子交换柱DEAE型离子交换柱11第三步：分子筛色谱SephacrylS-200色谱分析流程：上样体积80ml

流速2ml/min

流动相20mmol/L柠檬酸钠-100mmol/LNaCl缓冲液结果：收集的rHuEPO保留时间约为45min比活性约为1.5*108U/g蛋白；纯度〉98%（SDS检测）免疫原性检测：Westernblot第三步：分子筛色谱SephacrylS-200色谱分析12EPO的销售情况重组促红细胞生成素，也称超级“重磅炸弹”基因药物。1985年科学家应用基因重组技术，在实验室获得重组人EPO（rhEPO），1989年安进（Amgen）公司的第一个基因重组药物Epogen获得FDA的批准，适应症为慢性肾功能衰竭导致的贫血、恶性肿瘤或化疗导致的贫血、失血后贫血等，其市场表现不俗，1999年销售值达到17.6亿美元，2000年19.6亿美元，2002年22.6亿美元，2003年24.4亿美元，成为名副其实的“重磅炸弹”基因药物。

EPO的销售情况重组促红细胞生成素，也称超级“重磅炸弹”基因13安进（Amgen）开发的用于治疗恶性贫血症的第二代促红细胞生成素新产品Arnesp2001年得到FDA的批准，Arnesp2002年初正式上市。Arnesp：是一种“高糖基化”促红素产品。其促进红细胞生成的能力大大优于第一代EPO（促红细胞生成素）产品。第一年上市即大获全胜，赢得开们红，Arnesp2002年全年销售额为4.2亿美元，2003年全年销售额为15.4亿美元。估计在今后3年内，Arnesp将创造10亿~15亿美元的市场销售额并夺取现有EPO生产商的部分市场，其市场前景不可估量。安进（Amgen）开发的用于治疗恶性贫血症的第二代促红细胞生142001年，EPO（包括Arnesp）的全球销售额达21.1亿美元，2002年达26.8亿美元，2003年全世界EPO的年销售额超过50亿美元。创下生物工程药品单个品种之最，是当今最成功的基因工程药物。强生（Johnson&Johnson）公司的促红细胞生成素Procrit/Eprex更是表现不俗，2001年销售额34.42亿美元，2002年销售额42.69亿美元，2003年销售收入达到39.84亿美元。

2001年，EPO（包括Arnesp）的全球销售额达21.115目前，国内已有10多家单位获准生产红细胞生成素。沈阳三生和上海麒麟鲲鹏（中国）生物药业的产品在国内医院的销售额独领风骚，2001年EPO的国内医院销售总额约为47449万元，2002年为49508万元，2003年上半年为28606万元。估计国内的年市场容量在20到30亿元左右，但目前年销售额只有区区5亿元左右。综上所述，EPO的市场前景非常可观。EPO的市场前景目前，国内已有10多家单位获准生产红细胞生成素。沈阳三生和上16THANKYOU!THANKYOU!17

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18基因工程药物——促红细胞生成素课件19什么是EPO？EPO：是促红细胞生成素（Erythropoietin）的英文简称。促红细胞生成素：最初是从肾脏中分离出来能刺激前体红细胞增生、分化的一种细胞因子。人体血液中的促红细胞生成素：是由肾脏和肝脏分泌的一种激素样物质，能够促进红细胞生成。它与其受体(EPO-R)结合后共同介导缺氧的生理反应。什么是EPO？EPO：是促红细胞生成素（Erythropoi20EPO的用途医疗用途：增加红血球的数目，用于贫血、组织断离、早产儿，用在癌学和血液学方面。体育用途(兴奋剂)：增加训练耐力和训练负荷，属于国际奥委会规定的违禁药物。在2008年北京奥运会中第一例的兴奋剂。EPO的用途医疗用途：增加红血球的数目，用于贫血、组织断离、21EPO的疗效1、肾性贫血患者EPO水平较低，在进行治疗过程中，往往通过注射EPO来提高体内EPO水平进行治疗，从而帮助病人增加红细胞数量，此时EPO水平有所上升。2、其他贫血如缺铁性贫血、巨细胞性贫血患者EPO水平不降低，但也可以使用EPO治疗，此时浓度也会有所升高。3、再生障碍性贫血和骨髓造血功能不全患者EPO水平升高。EPO的疗效1、肾性贫血患者EPO水平较低，在进行治疗过程22EPO的纯化历史1、Miyake的七步法：纯化步骤太多，对设备及操作要求也较高，不适合工业生产的特点。2、Spivik利用凝集素亲和层析纯化EPO：由于凝集素亲和层析凝胶易被杂蛋白不可逆吸附，使得分离效果降低，成本增高，也不利于大规模生产。3、近年来则利用三步层析法三步纯化基本流程等。EPO的纯化历史1、Miyake的七步法：纯化步骤太多，对设23EPO的工艺流程

——①三步层析法1、染料配基亲和层析→反相疏水层析→离子交换层析;2、染料配基亲和层析→反相疏水层析→分子筛层析;3、反相疏水层析→离子交换层析→分子筛层析。EPO的工艺流程

——①三步层析法1、染料配基亲和层析→反24EPO的工艺流程

——②三步纯化基本流程第一步：反相柱色谱样品浓缩约96.7%透析第二步：DEAE-离子交换色谱第三步：分子筛色谱

总回收率〉30%

比活1.5*108U/g蛋白EPO的工艺流程

——②三步纯化基本流程第一步：反相柱色谱25第一步：反相色谱C6

反相柱（2cm*2cm）（创新生物技术公司）流程：上样50ml/min（柱结合量约5mg蛋白/ml介质)

去离子水平衡至检测基线

10%~80%乙醇胍线性梯度洗脱检测并收集含EPO主峰

ELISA测定结果：60%乙醇-1mol/L盐酸胍洗出EPO第一步：反相色谱C6反相柱（2cm*2cm）（创新生26透析透析液：10倍体积的10mmol/LTris.HCl(pH7.5)-2%蔗糖缓冲液透析次数：2时间：5~6h透析透析液：10倍体积的10mmol/LTris.HCl27第二步：离子交换柱DEAE型离子交换柱流程：

10mmol/LTris.HCl(pH7.5)缓冲液平上样20ml/min（柱结合量20mg/ml）

10mmol/LTris.HCl(pH7.5)缓冲液平衡至基线添加NaCl入缓冲液，进行截状梯度洗脱（NaCl浓度分别为：50，70，125mmol/L）结果：ELISA检测盒表明75mmol/L洗脱峰中含EPO第二步：离子交换柱DEAE型离子交换柱28第三步：分子筛色谱SephacrylS-200色谱分析流程：上样体积80ml

流速2ml/min

流动相20mmol/L柠檬酸钠-100mmol/LNaCl缓冲液结果：收集的rHuEPO保留时间约为45min比活性约为1.5*108U/g蛋白；纯度〉98%（SDS检测）免疫原性检测：Westernblot第三步：分子筛色谱SephacrylS-200色谱分析29EPO的销售情况重组促红细胞生成素，也称超级“重磅炸弹”基因药物。1985年科学家应用基因重组技术，在实验室获得重组人EPO（rhEPO），1989年安进（Amgen）公司的第一个基因重组药物Epogen获得FDA的批准，适应症为慢性肾功能衰竭导致的贫血、恶性肿瘤或化疗导致的贫血、失血后贫血等，其市场表现不俗，1999年销售值达到17.6亿美元，2000年19.6亿美元，2002年22.6亿美元，2003年24.4亿美元，成为名副其实的“重磅炸弹”基因药物。

EPO的销售情况重组促红细胞生成素，也称超级“重磅炸弹”基因30安进（Amgen）开发的用于治疗恶性贫血症的第二代促红细胞生成素新产品Arnesp2001年得到FDA的批准，Arnesp2002年初正式上市。Arnesp：是一种“高糖基化”促红素产品。其促进红细胞生成的能力大大优于第一代EPO（促红细胞生成素）产品。第一年上市即大获全胜，赢得开们红，Arnesp2002年全年销售额为4.2亿美元，2003年全年销售额为15.4亿美元。估计在今后3年内