《菌株的选育》课件

第三节抗噬菌体菌株的选育第三节抗噬菌体菌株的选育1（一）噬菌体的分布广泛存在于土壤、肥料、粪便和污水中。有寄主细胞的地方，易找到其噬菌体。病人外科疮口脓液：金黄色葡萄球菌噬菌体；受细菌病害植株细菌发酵工厂污水和土壤（情况严重时，甚至从空气中亦能分离到噬菌体）。（一）噬菌体的分布2（1）抗噬菌体菌株选育方法

a自然突变以噬菌体为筛子，敏感菌株孢子自然突变为抗性菌株（抗性突变频率低）。

（二）抗噬菌体菌株的选育（1）抗噬菌体菌株选育方法（二）抗噬菌体菌株的选育3

b诱发突变诱变处理过的敏感菌株孢子液分离在高浓度噬菌体平板上，长出的菌落为抗性变异株；生长速度一般与正常菌落相近。诱变后敏感菌孢子接入种子培养基，菌丝长浓后加入高浓度噬菌体再培养几天，加入噬菌体反复感染，敏感菌裂解，平板分离抗性株。b诱发突变4（2）抗噬菌体菌株的特性试验

a抗噬菌体性状稳定性试验抗性菌株分别在孢子培养、种子培养和发酵培养过程中用点滴法或双层琼脂法测定噬菌斑。如都不出现噬菌斑，说明该菌株对此噬菌体具有抗性。还可观察抗性菌株经多次传代后对噬菌体的抗性是否稳定。（2）抗噬菌体菌株的特性试验5

b抗性菌株产量试验

抗噬菌体菌株生产能力不低于原敏感株。

一般抗性菌株与原敏感菌株在某些发酵特性方面会有些改变。因此，要考察它对碳源、氮源、通气量、无机磷添加量及其他培养条件的要求等。b抗性菌株产量试验6

c抗性与溶源性的区别试验菌株的抗噬菌体特性具有相对遗传稳定性

抗性机理：改变细胞壁结构阻止噬菌体吸附侵入，改变生理代谢使噬菌体不能侵染，即使侵染后也不能增殖释放，这些菌株具有真正的抗性。溶源性菌株不是真正抗性菌（原噬菌体）？？c抗性与溶源性的区别试验7（三）噬菌体的防治

感染噬菌体后的表观现象：畸形菌丝，菌体迅速消失，pH值上升，发酵产物停止积累，甚至下降等现象。链霉素、红霉素、万古霉素、金霉素、林可霉素、谷氨酸、丙酮丁醇、山梨糖、碱性蛋白酶发酵过程中都会遭到噬菌体侵染。

（三）噬菌体的防治8（1）正确判断根据发酵中出现的异常现象。（2）普及有关噬菌体知识（3）选育抗噬菌体菌株（1）正确判断9（4）消灭噬菌体在感染噬菌体的发酵罐排气口及下水道喷洒药剂，防止噬菌体扩散。车间内外定期喷洒药物。常用药物有漂白粉、甲醛、石灰水等。种子室尽量与外界减少接触，严格执行无菌操作，检查空气中有无噬菌体存在。在噬菌体感染期间，车间内定时检查噬菌体分布情况，采取有效措施直至消灭为止。（4）消灭噬菌体10（5）收集和保存噬菌体将生产上出现噬菌体收集保藏起来用作选育抗性菌株及研究防治措施的材料和依据。

噬菌体以预防为主，筛选抗性菌株，保持环境卫生，杜绝噬菌体滋生。（5）收集和保存噬菌体11

第四节杂交育种第四节杂交育种12概念：将两个基因型不同的菌株接合使遗传物质重新组合，从中分离和筛选具有新性状的菌株。概念：13杂交育种目的：①不同菌株的遗传物质进行交换和重组，获得杂种菌株；②不同菌株的优良性能集中于重组体中，克服长期用诱变剂处理造成的菌株生活能力下降等缺陷；③通过杂交扩大变异范围，改变产品质量和产量，甚至出现新品种；④分析杂交结果，总结遗传物质转移和传递规律，促进遗传学理论的发展。杂交育种目的：14互补的两种营养缺陷型菌株的混合培养中将会有不再需要两种物质的重组子出现。据此，1946年第一次在大肠杆菌中发现杂交行为。（一）细菌杂交细菌存在杂交行为的实验证明：互补的两种营养缺陷型菌株的混合培养中将会有15实验证明，把上述两种菌株分别接种到一个特制的U形管的两端培养，中间放一片烧结玻璃，培养液可流通但把细菌隔开，MM上不会出现菌落，说明细胞接触是基因重组的必要条件。细菌可通过F因子转移、转化和转导等发生基因重组（杂交）。细胞接触是基因重组的必要条件实验证明，把上述两种菌株分别接种到一个特制的16放线菌杂交是在细菌杂交基础上发展起来的。基因重组过程近似细菌，育种方法有许多与霉菌相似。（二）放线菌杂交育种放线菌杂交是在细菌杂交基础上发展起来的。（二）17放线菌只有一条环状染色体，基因重组过程类似于大肠杆菌，大体上有以下四种遗传体系。1、放线菌杂交原理放线菌只有一条环状染色体，基因重组过程类似18混合培养营养缺陷型，菌丝间接触、融合形成异核体。异核体：

在同一个细胞质里，存在两种遗传上不同的细胞核，在营养上互补。菌落表型是原养型。基因型分别与亲本之一相同，无重组体出现。没有发生遗传信息交换。

（1）异核现象混合培养营养缺陷型，菌丝间接触、融合形成异核19接合：异核细胞内不同基因型的细胞核在双方增殖过程中，发生部分染色体转移或遗传信息交换。接合导致部分合子形成。

（2）接合现象接合：异核细胞内不同基因型的细胞核在双方增殖20部分合子：

是由一个供体染色体片段与一个受体染色体的整体相结合而形成的，但亦可能两个亲本都不完整部分合子：21部分合子形成后，经过一次单交换，产生的杂合的染色体组，即：异核系。异核系的菌落很小，遗传类型各不相同。能在MM或SM上生长。但异核系的分生孢子影印到同样培养基上就不能生长。（3）异核系的形成部分合子形成后，经过一次单交换，产生的杂合的22异核系不稳定，在菌落生长过程中，染色体重叠两节段（二体区）的不同位置上发生交换后，能产生重组体孢子。异核系所产生的孢子几乎全部是单倍体，而成为一个单倍的无性繁殖系。但是，重组体也可由部分合子经过双交换而产生。（4）重组体的形成异核系不稳定，在菌落生长过程中，染色体重叠两23《菌株的选育》课件24常用放线菌杂交方法：2、放线菌杂交技术

混合培养法平板杂交法玻璃纸转移法常用放线菌杂交方法：2、放线菌杂交技术

25选择性平板法

两亲株是互补营养缺陷型，两亲株混合，接种到CM斜面上(其中一株产生孢慢时可多接一些)，孢子形成后制成单孢子悬浮液，然后在SM平板上分离，长出菌落即为重组体。（1）混合培养法选择性平板法（1）混合培养法26将菌落培养在非选择性培养基上，形成孢子后，用影印培养法将菌落印至铺有试验菌孢子(107～109个/mL)的CM平板上培养至孢子形成。把形成的孢子影印到一系列SM上—筛选各种重组体子代。

优点：能迅速地大量杂交，尤其是确定大量菌落与一个共同试验菌配对时的致育力更为方便。一个培养皿可排列20个菌株与一株配对菌株杂交。（2）平板杂交法将菌落培养在非选择性培养基上，形成孢子后，27使用本法须备2条件：直接亲本须带两个遗传标记（营养要求和抗药性），另一个直接亲本对该药物敏感并带有另一种营养缺陷型；SM是带有抗性药物的基本培养基。（3）玻璃纸转移法使用本法须备2条件：（3）玻璃纸转移法28

原理：异核体带有链霉素敏感的等位基因，在含链霉素的SM上不生长。敏感性亲本和抗药性亲本因营养要求得不到满足也不能在该SM上生长。而不带链霉素敏感等位基因的两直接亲本的局部结合子则能在该SM上生长。原理：异核体带有链霉素敏感的等位基因，在含链29在金霉素、土霉素、新霉素、红霉素和新生霉素等抗生素产生菌的杂交育种方面都有成功报道。

刘颐屏等研究了金霉素链霉菌的遗传重组作用，他们从一个野生型菌株出发诱发营养缺陷型，用这些营养缺陷型菌株进行杂交，获得了产量高于野生型菌株的重组体。对于某些重组体再进一步用诱变剂进行处理时，发现产量变异幅度较野生型菌株大，且整个分布偏向于高产，从而育成了高产菌株。在金霉素、土霉素、新霉素、红霉素和新生霉素等30

第五节原生质体融合技术

（protoplastfusion）第五节原生质体融合技术

（31概念：把两亲本细胞壁酶解，在高渗环境中释放出球状体（原生质体），混合原生质体，由聚乙二醇(PEG)作助融剂，使互相凝集、融合，两亲本基因组由接触到交换，实现遗传重组。概念：32①、不需要有已知的遗传系统。

去除了细胞壁，亲株基因组直接融合、重组，不需要有已知的遗传系统。

（一）原生质体融合的优越性①、不需要有已知的遗传系统。（一）原生质体融合的优越性33②、得到多种类型的重组子

原生质体融合后两亲株的基因组之间有机会发生多次交换，得到多种类型的重组子。参与融合的亲株数并不限于一个，可以多至三个、四个，这是一般常规杂交所达不到的。②、得到多种类型的重组子34③、重组频率特别高。因有聚乙二醇作助融剂。如天蓝色链霉菌种内重组频率可达到20％。

④、可以和其他育种方法相结合。把由其他方法得到的优良性状通过原生质体融合再组合到一个单株中。

③、重组频率特别高。35⑤、易于提高筛选效率。可以用温度、药物、紫外线等处理、钝化亲株的一方或双方，然后融合，在再生菌落中筛选重组子。这样可提高筛选效率。⑤、易于提高筛选效率。36（二）原生质体融合的一般步骤（二）原生质体融合的一般步骤37《菌株的选育》课件38原生质体融合方法：PEG促溶、电诱导促融等。原生质体融合方法：39

①、细胞经过原生质体化与再生，常伴着基因突变，可能得到高产变异菌株。例1：生二素链霉菌通过原生质体再生使螺旋霉素产量提高2倍。例2：弗氏链霉菌通过再生使泰乐菌素生产能力提高了3倍多。（三）原生质体融合在微生物育种中的应用①、细胞经过原生质体化与再生，常伴着基因突40②、链霉菌经过原生质体化，再生成细胞时，常引起质粒消除，导致染色体或次级代谢途径变化，可能出现高产变异株。

质粒消除频率达13％～85％，②、链霉菌经过原生质体化，再生成细胞时，41③、种内融合还可能使抗生素合成中的限速酶得到修饰而使抗生素合成的代谢途径畅通。④、有效的种间融合，可能使两个产生不同抗生素菌株的调节基因和结构基因重组在一起，诱发“沉默基因”的表达，产生新物质。种间融合还可能使两个产生不同抗生素菌株的结构基因重组而产生杂种抗生素。

③、种内融合还可能使抗生素合成中的限速酶得到42

第六节DNA重组技术

（DNArecombination）第六节DNA重组技术

（DNArecom43概念：

按人的意志，将供体遗传信息在体外与载体相接成重组DNA分子，然后转入受体细胞中，使其在受体中表达和遗传。概念：44工业应用举例：将血红蛋白基因引入顶头孢霉菌中，限氧条件下头孢菌素C的产量提高了5倍；将麦迪霉素产生菌的4’-羟基酰化酶基因克隆到生二素链霉菌内，可直接产生酰化螺旋霉素。工业应用举例：45医药应用举例：①、人胰岛素、干扰素、人白细胞介素、人促红细胞生成素(EPO)、重组链激酶和集落生长因子等。②、基因工程抗体，极大地拓展了抗体的功能及其临床应用范围，可用于肿瘤、病毒病治疗等。③、转基因动物，生产一些需要量大或Pr复杂需要翻译后修饰的重组蛋白.医药应用举例：46DNA重组在育种方面的优势：①、增加生物合成基因量，增加抗生素产量；②、导入强启动子或抗性基因增加抗生素产量；③、把两种不同的生物合成基因在体外重组后导入受体内产生杂交抗生素；④、激活沉默基因，产生新的生物活性物质或提高抗生素产量；⑤、把异源基因克隆到宿主中表达，改变生产工艺。DNA重组在育种方面的优势：47（一）DNA重组技术基本过程（一）DNA重组技术基本过程48工程菌在保存、发酵过程中不稳定，成为制约基因工程转变为生产力的关键之一。（二）工程菌的稳定性工程菌在保存、发酵过程中不稳定，成为制约基因49外在表现：得不到表达产物、或达不到要求产量。本质：质粒不稳定；表达产物不稳定。内在表现：质粒丢失；重组质粒DNA片段脱落。1、工程菌不稳定性的表现外在表现：得不到表达产物、或达不到要求产量。1、工程菌不50质粒丢失：由环境因素或生理、遗传学原因，质粒从宿主中丢失，丢失率因环境、宿主、质粒结构而有不同。

重组质粒上一部分片段脱落：

表现为质粒变小或某些遗传信息发生变化甚至丧失。表达产物不稳定：

人干扰素工程菌在表达干扰素时，随着培养时间的延长，干扰素活性反而下降。质粒丢失：重组质粒上一部分片段脱落：51影响工程菌稳定性的因素：

（1）质粒结构：质粒稳定区受到影响，重组质粒上有重复序列，或与宿主染色体有部分同源等。（2）宿主：质粒中有同源序列，宿主的比生长速率、宿主中重组基因的完整性、重组时有关基因的变异等。（3）环境因素：高温、去垢剂、某些药物(如利福平)、染料及胸腺嘧啶饥饿、紫外线辐射等都会引起质粒的丢失。影响工程菌稳定性的因素：52（1）组建合适载体构建质粒时，插入一段特殊的DNA片段或基因，使宿主细胞分裂时，质粒能够较稳定地遗传到子代细胞中。（2）选择适当宿主

在选择宿主时，须确定其遗传特点。重组质粒在大肠杆菌中较稳定，而在枯草杆菌和酵母中较不稳定。2、解决工程菌不稳定的对策（1）组建合适载体2、解决工程菌不稳定的对策53（3）施加选择压力

a抗生素添加法

通常在重组质粒上含抗药性基因。转入不耐药的宿主后，工程菌获得了抗药性。发酵时，培养基中加入抗生素，可阻止丢失质粒的非生产菌生长。

b抗生素依赖变异法

诱变使宿主成为某抗生素的依赖性突变株，而重组质粒上含有该抗生素的非依赖性基因。发酵生产时，不向培养基中加抗生素就能起到消除重组质粒不稳定的影响。（3）施加选择压力b抗生素依赖变异法54c、营养缺陷型法

诱变使宿主成为营养缺陷型，将相关基因插入到重组质粒中，选择基础培养基使失去重组质粒的细胞不能存活，而只有含重组质粒的细胞才能生长。

c、营养缺陷型法55（4）控制基因过量表达外源基因表达水平越高，重组质粒越不稳定，如果外源基因的表达受到抑制，则重组质粒不可能丢失。可采取两阶段培养法。（4）控制基因过量表达56A一些温度敏感型质粒，低温时质粒拷贝数少，温度升高时质粒大量复制，拷贝数剧增。发酵前期控制温度使基因不过量表达，质粒稳定遗传，后期提高温度使基因高效表达。B也可用诱导型启动子。即在构建表达质粒时，使用可诱导的操纵子，选择培养条件使启动子受阻遏(抑制)至一定时期，使质粒稳定地遗传，然后通过去阻遏使质粒高效表达。两阶段培养法举例：A一些温度敏感型质粒，低温时质粒拷贝数少57（5）控制培养条件众多环境因素中，培养基组成、培养温度、菌体的比生长速率尤为重要。对一个已经组建完成的克隆菌来说，选择最合适的培养条件是进行工业化生产的关键步骤。（6）固定化重组菌以提高基因工程菌的稳定性。（5）控制培养条件（6）固定化重组菌以提高基因工程菌的稳定性58

第七节菌种保藏第七节菌种保藏59菌种是国家的重要资源。菌种保藏是微生物学研究和育种工作的重要组成部分。

任务:不死亡、不污染、不退化。1980年，中国微生物菌种保藏委员会成立。一、菌种保藏的意义菌种是国家的重要资源。一、菌种保藏的意义60原理：人工创造条件使微生物的代谢尽量降低，以减少变异。一般可通过限制营养、缺氧，干燥和低温，使菌种处于“体眠”状态。二、菌种保藏原理和方法原理：二、菌种保藏原理和方法61（一）斜面冰箱保藏法4℃冰箱保存。保存期1-3月。（一）斜面冰箱保藏法62（二）沙土管保藏法

适合于产孢子或芽孢的微生物。1、将沙与土洗净、烘干、过筛，（1-2）：1混匀，分装于小试管中，料高1厘米，121度间歇灭菌三次，烘干备用。沙80目，土80一100目。2、将孢子制成悬液，接入沙土管。或将斜面孢子刮下直接与沙土混合，置干燥器中用真空泵抽干，冰箱内保存。3、保存期1年左右。（二）沙土管保藏法63（三）菌丝速冻法

不产孢子或芽孢的微生物可用甘油菌丝速冻法。保藏温度为－20℃，为避免损伤致死，需甘油作保护剂。甘油最终浓度为25％。

操作：①、配制浓度为50％的甘油溶液，121℃灭菌后备用；②、制备菌悬液，一般浓度为108～1010个/mL；③、菌悬液和甘油溶液等体积混合均匀，置－20℃保藏。（三）菌丝速冻法64（四）石蜡油封存法

向菌种斜面上，倒入一层灭菌石蜡油，量高出斜面1cm，保存冰箱中。适于不能利用石蜡油作碳源的微生物。保存期约1年。（四）石蜡油封存法65（五）真空冷冻干燥保藏法基本原理：在较低温度下(-18℃)，快速地将细胞冻结，并且保持细胞完整，然后在真空中使水分升华。在这样的环境中，微生物的生长和代谢暂时停止，不易发生变异。菌种可保存5年左右。

（五）真空冷冻干燥保藏法66

基本操作：将微生物制成悬浮液，与保护剂混合，放在安瓿管内，用低温酒精或干冰迅速冻结，低温下用真空泵抽干，真空熔封。低温保藏。

保护剂：脱脂牛奶或血清等。牛奶可用离心或加热的方法脱脂。

保护剂的作用：在冷冻干燥的脱水过程中代替结合水而稳定细胞成分(细胞膜)的构型，防止细胞膜因为冻结而破坏。保护剂还可以起支持作用，使微生物疏松地固定在上面。基本操作：将微生物制成悬浮液，与保护剂混合，67《菌株的选育》课件68（六）液氮超低温保藏法

是近几年才发展起来的，国外已较普遍采用，适用范围最广。尤其是一些不产孢子的菌丝体，用其他保藏方法不理想，可用液氮保藏法，其保存期最长。（六）液氮超低温保藏法69（1）原理

液氮的温度可达-196℃，远远低于新陈代谢作用停止的温度(-130℃)，菌种代谢活动停止，化学作用消失。（1）原理70（2）操作

a安瓿管

需能承受大温差而不至于破裂，加棉塞后灭菌，烘干后备用。

b菌种准备及分装

超低温冷冻过程需要保护剂。常用保护剂为10％甘油，制备好菌液后，加入安瓿管，装量0.2～1mL。（2）操作71

c冻结

关键是把微生物从常温过渡到低温。这样在细胞接触低温前，使胞内水通过膜渗出，而不形成冰晶而伤害细胞。美国ATCC先将菌液降到0℃，再1℃/min降低到－35℃，再放入液氮罐的气相中。因液氮蒸发导致温度上升，冰晶状态发生变化而导致菌种死亡。所以要常常注意液氮残存量，定期补加。

c冻结72d重新培养

将安瓿管从冰箱中取出，室温迅速解冻，升温至0℃时即可打开安瓿管，移到适宜的斜面上培养。d重新培养73三、国内外主要菌种保藏机构三、国内外主要菌种保藏机构74国际机构：ATCC

AmericanTypeCultureCollection.RockvillMaryland,U.S.A.美国标准菌种收藏所，美国，马里兰州，罗克维尔市。CSH

ColdSpringHarborLaboratory.U.S.A.冷泉港研究室，美国。国际机构：75NIH

NationalInstitutesofHealth.Bethesda,Maryland,U.S.A.国立卫生研究所，美国，马里兰州，贝塞斯达。NRRLNorthernUti1izationResearchandDevelopmentDivision,U.S.DepartmentofArgculture,Peoria,U.S.A.美国农业部、北方开发利用研究部，美国皮奥里亚市。NIH76IAM

InstituteofAppliedMicribiology.UniversityofTokyo,Japan.日本东京大学应用微生物研究所，日本东京。IFO

InstltuteforFermentation.Osaka,Japan.发酵研究所，日本大阪。IAM77KCC

KakenChemicalCompanyLtd.Tokyo,Japan.科研化学有限公司，日本东京。NCTC

NationalCollectionofTypeCulture.London,UnitedKingdom.国立标准菌种收藏所，英国伦敦。KCC78国内机构：中国微生物菌种保藏管理委员会(ChinaCommitteeforCultureCollectionofMicroorganisms．CCCMS)。下设六个菌种保藏管理中心。1、普通微生物菌种保藏管理中心：ChinaGeneralMicrobiologicalCultureCollectionCentre(CGMCC)中国科学院微生物研究所，北京(AS)：真菌，细菌；中国科学院武汉病毒研究所，武汉(AS-Ⅳ)：病毒。(CCTCC)国内机构：792、农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)：中国农业科学院土壤肥料研究所，北京(1SF)。3、工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)：轻工业部食品发酵工业科学研究所，北京(IFFl)。4、医学微生物菌种保藏管理中心(CMCC)：中国医学科学院皮肤病研究所，南京(1D)：真菌。卫生部药品生物制品检定所，北京(NICPBP)：细菌。中国医学科学院病毒研究所，北京：病毒。2、农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)：805、抗生素菌种保藏管理中心(CACC)：中国医学科学院抗生素研究所，北京(1A)。四川抗生素工业研究所，成都(STA)：新抗生素菌种。华北药厂抗生素研究所，石家庄(IANP)：生产用抗生素菌种。6、兽医微生物菌种保藏管理中心(CVCC)：农业部兽医药品监察所，北京。

5、抗生素菌种保藏管理中心(CACC)：81

第三节抗噬菌体菌株的选育第三节抗噬菌体菌株的选育82（一）噬菌体的分布广泛存在于土壤、肥料、粪便和污水中。有寄主细胞的地方，易找到其噬菌体。病人外科疮口脓液：金黄色葡萄球菌噬菌体；受细菌病害植株细菌发酵工厂污水和土壤（情况严重时，甚至从空气中亦能分离到噬菌体）。（一）噬菌体的分布83（1）抗噬菌体菌株选育方法

a自然突变以噬菌体为筛子，敏感菌株孢子自然突变为抗性菌株（抗性突变频率低）。

（二）抗噬菌体菌株的选育（1）抗噬菌体菌株选育方法（二）抗噬菌体菌株的选育84

b诱发突变诱变处理过的敏感菌株孢子液分离在高浓度噬菌体平板上，长出的菌落为抗性变异株；生长速度一般与正常菌落相近。诱变后敏感菌孢子接入种子培养基，菌丝长浓后加入高浓度噬菌体再培养几天，加入噬菌体反复感染，敏感菌裂解，平板分离抗性株。b诱发突变85（2）抗噬菌体菌株的特性试验

a抗噬菌体性状稳定性试验抗性菌株分别在孢子培养、种子培养和发酵培养过程中用点滴法或双层琼脂法测定噬菌斑。如都不出现噬菌斑，说明该菌株对此噬菌体具有抗性。还可观察抗性菌株经多次传代后对噬菌体的抗性是否稳定。（2）抗噬菌体菌株的特性试验86

b抗性菌株产量试验

抗噬菌体菌株生产能力不低于原敏感株。

一般抗性菌株与原敏感菌株在某些发酵特性方面会有些改变。因此，要考察它对碳源、氮源、通气量、无机磷添加量及其他培养条件的要求等。b抗性菌株产量试验87

c抗性与溶源性的区别试验菌株的抗噬菌体特性具有相对遗传稳定性

抗性机理：改变细胞壁结构阻止噬菌体吸附侵入，改变生理代谢使噬菌体不能侵染，即使侵染后也不能增殖释放，这些菌株具有真正的抗性。溶源性菌株不是真正抗性菌（原噬菌体）？？c抗性与溶源性的区别试验88（三）噬菌体的防治

感染噬菌体后的表观现象：畸形菌丝，菌体迅速消失，pH值上升，发酵产物停止积累，甚至下降等现象。链霉素、红霉素、万古霉素、金霉素、林可霉素、谷氨酸、丙酮丁醇、山梨糖、碱性蛋白酶发酵过程中都会遭到噬菌体侵染。

（三）噬菌体的防治89（1）正确判断根据发酵中出现的异常现象。（2）普及有关噬菌体知识（3）选育抗噬菌体菌株（1）正确判断90（4）消灭噬菌体在感染噬菌体的发酵罐排气口及下水道喷洒药剂，防止噬菌体扩散。车间内外定期喷洒药物。常用药物有漂白粉、甲醛、石灰水等。种子室尽量与外界减少接触，严格执行无菌操作，检查空气中有无噬菌体存在。在噬菌体感染期间，车间内定时检查噬菌体分布情况，采取有效措施直至消灭为止。（4）消灭噬菌体91（5）收集和保存噬菌体将生产上出现噬菌体收集保藏起来用作选育抗性菌株及研究防治措施的材料和依据。

噬菌体以预防为主，筛选抗性菌株，保持环境卫生，杜绝噬菌体滋生。（5）收集和保存噬菌体92

第四节杂交育种第四节杂交育种93概念：将两个基因型不同的菌株接合使遗传物质重新组合，从中分离和筛选具有新性状的菌株。概念：94杂交育种目的：①不同菌株的遗传物质进行交换和重组，获得杂种菌株；②不同菌株的优良性能集中于重组体中，克服长期用诱变剂处理造成的菌株生活能力下降等缺陷；③通过杂交扩大变异范围，改变产品质量和产量，甚至出现新品种；④分析杂交结果，总结遗传物质转移和传递规律，促进遗传学理论的发展。杂交育种目的：95互补的两种营养缺陷型菌株的混合培养中将会有不再需要两种物质的重组子出现。据此，1946年第一次在大肠杆菌中发现杂交行为。（一）细菌杂交细菌存在杂交行为的实验证明：互补的两种营养缺陷型菌株的混合培养中将会有96实验证明，把上述两种菌株分别接种到一个特制的U形管的两端培养，中间放一片烧结玻璃，培养液可流通但把细菌隔开，MM上不会出现菌落，说明细胞接触是基因重组的必要条件。细菌可通过F因子转移、转化和转导等发生基因重组（杂交）。细胞接触是基因重组的必要条件实验证明，把上述两种菌株分别接种到一个特制的97放线菌杂交是在细菌杂交基础上发展起来的。基因重组过程近似细菌，育种方法有许多与霉菌相似。（二）放线菌杂交育种放线菌杂交是在细菌杂交基础上发展起来的。（二）98放线菌只有一条环状染色体，基因重组过程类似于大肠杆菌，大体上有以下四种遗传体系。1、放线菌杂交原理放线菌只有一条环状染色体，基因重组过程类似99混合培养营养缺陷型，菌丝间接触、融合形成异核体。异核体：

在同一个细胞质里，存在两种遗传上不同的细胞核，在营养上互补。菌落表型是原养型。基因型分别与亲本之一相同，无重组体出现。没有发生遗传信息交换。

（1）异核现象混合培养营养缺陷型，菌丝间接触、融合形成异核100接合：异核细胞内不同基因型的细胞核在双方增殖过程中，发生部分染色体转移或遗传信息交换。接合导致部分合子形成。

（2）接合现象接合：异核细胞内不同基因型的细胞核在双方增殖101部分合子：

是由一个供体染色体片段与一个受体染色体的整体相结合而形成的，但亦可能两个亲本都不完整部分合子：102部分合子形成后，经过一次单交换，产生的杂合的染色体组，即：异核系。异核系的菌落很小，遗传类型各不相同。能在MM或SM上生长。但异核系的分生孢子影印到同样培养基上就不能生长。（3）异核系的形成部分合子形成后，经过一次单交换，产生的杂合的103异核系不稳定，在菌落生长过程中，染色体重叠两节段（二体区）的不同位置上发生交换后，能产生重组体孢子。异核系所产生的孢子几乎全部是单倍体，而成为一个单倍的无性繁殖系。但是，重组体也可由部分合子经过双交换而产生。（4）重组体的形成异核系不稳定，在菌落生长过程中，染色体重叠两104《菌株的选育》课件105常用放线菌杂交方法：2、放线菌杂交技术

混合培养法平板杂交法玻璃纸转移法常用放线菌杂交方法：2、放线菌杂交技术

106选择性平板法

两亲株是互补营养缺陷型，两亲株混合，接种到CM斜面上(其中一株产生孢慢时可多接一些)，孢子形成后制成单孢子悬浮液，然后在SM平板上分离，长出菌落即为重组体。（1）混合培养法选择性平板法（1）混合培养法107将菌落培养在非选择性培养基上，形成孢子后，用影印培养法将菌落印至铺有试验菌孢子(107～109个/mL)的CM平板上培养至孢子形成。把形成的孢子影印到一系列SM上—筛选各种重组体子代。

优点：能迅速地大量杂交，尤其是确定大量菌落与一个共同试验菌配对时的致育力更为方便。一个培养皿可排列20个菌株与一株配对菌株杂交。（2）平板杂交法将菌落培养在非选择性培养基上，形成孢子后，108使用本法须备2条件：直接亲本须带两个遗传标记（营养要求和抗药性），另一个直接亲本对该药物敏感并带有另一种营养缺陷型；SM是带有抗性药物的基本培养基。（3）玻璃纸转移法使用本法须备2条件：（3）玻璃纸转移法109

原理：异核体带有链霉素敏感的等位基因，在含链霉素的SM上不生长。敏感性亲本和抗药性亲本因营养要求得不到满足也不能在该SM上生长。而不带链霉素敏感等位基因的两直接亲本的局部结合子则能在该SM上生长。原理：异核体带有链霉素敏感的等位基因，在含链110在金霉素、土霉素、新霉素、红霉素和新生霉素等抗生素产生菌的杂交育种方面都有成功报道。

刘颐屏等研究了金霉素链霉菌的遗传重组作用，他们从一个野生型菌株出发诱发营养缺陷型，用这些营养缺陷型菌株进行杂交，获得了产量高于野生型菌株的重组体。对于某些重组体再进一步用诱变剂进行处理时，发现产量变异幅度较野生型菌株大，且整个分布偏向于高产，从而育成了高产菌株。在金霉素、土霉素、新霉素、红霉素和新生霉素等111

第五节原生质体融合技术

（protoplastfusion）第五节原生质体融合技术

（112概念：把两亲本细胞壁酶解，在高渗环境中释放出球状体（原生质体），混合原生质体，由聚乙二醇(PEG)作助融剂，使互相凝集、融合，两亲本基因组由接触到交换，实现遗传重组。概念：113①、不需要有已知的遗传系统。

去除了细胞壁，亲株基因组直接融合、重组，不需要有已知的遗传系统。

（一）原生质体融合的优越性①、不需要有已知的遗传系统。（一）原生质体融合的优越性114②、得到多种类型的重组子

原生质体融合后两亲株的基因组之间有机会发生多次交换，得到多种类型的重组子。参与融合的亲株数并不限于一个，可以多至三个、四个，这是一般常规杂交所达不到的。②、得到多种类型的重组子115③、重组频率特别高。因有聚乙二醇作助融剂。如天蓝色链霉菌种内重组频率可达到20％。

④、可以和其他育种方法相结合。把由其他方法得到的优良性状通过原生质体融合再组合到一个单株中。

③、重组频率特别高。116⑤、易于提高筛选效率。可以用温度、药物、紫外线等处理、钝化亲株的一方或双方，然后融合，在再生菌落中筛选重组子。这样可提高筛选效率。⑤、易于提高筛选效率。117（二）原生质体融合的一般步骤（二）原生质体融合的一般步骤118《菌株的选育》课件119原生质体融合方法：PEG促溶、电诱导促融等。原生质体融合方法：120

①、细胞经过原生质体化与再生，常伴着基因突变，可能得到高产变异菌株。例1：生二素链霉菌通过原生质体再生使螺旋霉素产量提高2倍。例2：弗氏链霉菌通过再生使泰乐菌素生产能力提高了3倍多。（三）原生质体融合在微生物育种中的应用①、细胞经过原生质体化与再生，常伴着基因突121②、链霉菌经过原生质体化，再生成细胞时，常引起质粒消除，导致染色体或次级代谢途径变化，可能出现高产变异株。

质粒消除频率达13％～85％，②、链霉菌经过原生质体化，再生成细胞时，122③、种内融合还可能使抗生素合成中的限速酶得到修饰而使抗生素合成的代谢途径畅通。④、有效的种间融合，可能使两个产生不同抗生素菌株的调节基因和结构基因重组在一起，诱发“沉默基因”的表达，产生新物质。种间融合还可能使两个产生不同抗生素菌株的结构基因重组而产生杂种抗生素。

③、种内融合还可能使抗生素合成中的限速酶得到123

第六节DNA重组技术

（DNArecombination）第六节DNA重组技术

（DNArecom124概念：

按人的意志，将供体遗传信息在体外与载体相接成重组DNA分子，然后转入受体细胞中，使其在受体中表达和遗传。概念：125工业应用举例：将血红蛋白基因引入顶头孢霉菌中，限氧条件下头孢菌素C的产量提高了5倍；将麦迪霉素产生菌的4’-羟基酰化酶基因克隆到生二素链霉菌内，可直接产生酰化螺旋霉素。工业应用举例：126医药应用举例：①、人胰岛素、干扰素、人白细胞介素、人促红细胞生成素(EPO)、重组链激酶和集落生长因子等。②、基因工程抗体，极大地拓展了抗体的功能及其临床应用范围，可用于肿瘤、病毒病治疗等。③、转基因动物，生产一些需要量大或Pr复杂需要翻译后修饰的重组蛋白.医药应用举例：127DNA重组在育种方面的优势：①、增加生物合成基因量，增加抗生素产量；②、导入强启动子或抗性基因增加抗生素产量；③、把两种不同的生物合成基因在体外重组后导入受体内产生杂交抗生素；④、激活沉默基因，产生新的生物活性物质或提高抗生素产量；⑤、把异源基因克隆到宿主中表达，改变生产工艺。DNA重组在育种方面的优势：128（一）DNA重组技术基本过程（一）DNA重组技术基本过程129工程菌在保存、发酵过程中不稳定，成为制约基因工程转变为生产力的关键之一。（二）工程菌的稳定性工程菌在保存、发酵过程中不稳定，成为制约基因130外在表现：得不到表达产物、或达不到要求产量。本质：质粒不稳定；表达产物不稳定。内在表现：质粒丢失；重组质粒DNA片段脱落。1、工程菌不稳定性的表现外在表现：得不到表达产物、或达不到要求产量。1、工程菌不131质粒丢失：由环境因素或生理、遗传学原因，质粒从宿主中丢失，丢失率因环境、宿主、质粒结构而有不同。

重组质粒上一部分片段脱落：

表现为质粒变小或某些遗传信息发生变化甚至丧失。表达产物不稳定：

人干扰素工程菌在表达干扰素时，随着培养时间的延长，干扰素活性反而下降。质粒丢失：重组质粒上一部分片段脱落：132影响工程菌稳定性的因素：

（1）质粒结构：质粒稳定区受到影响，重组质粒上有重复序列，或与宿主染色体有部分同源等。（2）宿主：质粒中有同源序列，宿主的比生长速率、宿主中重组基因的完整性、重组时有关基因的变异等。（3）环境因素：高温、去垢剂、某些药物(如利福平)、染料及胸腺嘧啶饥饿、紫外线辐射等都会引起质粒的丢失。影响工程菌稳定性的因素：133（1）组建合适载体构建质粒时，插入一段特殊的DNA片段或基因，使宿主细胞分裂时，质粒能够较稳定地遗传到子代细胞中。（2）选择适当宿主

在选择宿主时，须确定其遗传特点。重组质粒在大肠杆菌中较稳定，而在枯草杆菌和酵母中较不稳定。2、解决工程菌不稳定的对策（1）组建合适载体2、解决工程菌不稳定的对策134（3）施加选择压力

a抗生素添加法

通常在重组质粒上含抗药性基因。转入不耐药的宿主后，工程菌获得了抗药性。发酵时，培养基中加入抗生素，可阻止丢失质粒的非生产菌生长。

b抗生素依赖变异法

诱变使宿主成为某抗生素的依赖性突变株，而重组质粒上含有该抗生素的非依赖性基因。发酵生产时，不向培养基中加抗生素就能起到消除重组质粒不稳定的影响。（3）施加选择压力b抗生素依赖变异法135c、营养缺陷型法

诱变使宿主成为营养缺陷型，将相关基因插入到重组质粒中，选择基础培养基使失去重组质粒的细胞不能存活，而只有含重组质粒的细胞才能生长。

c、营养缺陷型法136（4）控制基因过量表达外源基因表达水平越高，重组质粒越不稳定，如果外源基因的表达受到抑制，则重组质粒不可能丢失。可采取两阶段培养法。（4）控制基因过量表达137A一些温度敏感型质粒，低温时质粒拷贝数少，温度升高时质粒大量复制，拷贝数剧增。发酵前期控制温度使基因不过量表达，质粒稳定遗传，后期提高温度使基因高效表达。B也可用诱导型启动子。即在构建表达质粒时，使用可诱导的操纵子，选择培养条件使启动子受阻遏(抑制)至一定时期，使质粒稳定地遗传，然后通过去阻遏使质粒高效表达。两阶段培养法举例：A一些温度敏感型质粒，低温时质粒拷贝数少138（5）控制培养条件众多环境因素中，培养基组成、培养温度、菌体的比生长速率尤为重要。对一个已经组建完成的克隆菌来说，选择最合适的培养条件是进行工业化生产的关键步骤。（6）固定化重组菌以提高基因工程菌的稳定性。（5）控制培养条件（6）固定化重组菌以提高基因工程菌的稳定性139

第七节菌种保藏第七节菌种保藏140菌种是国家的重要资源。菌种保藏是微生物学研究和育种工作的重要组成部分。

任务:不死亡、不污染、不退化。1980年，中国微生物菌种保藏委员会成立。一、菌种保藏的意义菌种是国家的重要资源。一、菌种保藏的意义141原理：人工创造条件使微生物的代谢尽量降低，以减少变异。一般可通过限制营养、缺氧，干燥和低温，使菌种处于“体眠”状态。二、菌种保藏原理和方法原理：二、菌种保藏原理和方法142（一）斜面冰箱保藏法4℃冰箱保存。保存期1-3月。（一）斜面冰箱保藏法143（二）沙土管保藏法

适合于产孢子或芽孢的微生物。1、将沙与土洗净、烘干、过筛，（1-2）：1混匀，分装于小试管中，料高1厘米，121度间歇灭菌三次，烘干备用。沙80目，土80一100目。2、将孢子制成悬液，接入沙土管。或将斜面孢子刮下直接与沙土混合，置干燥器中用真空泵抽干，冰箱内保存。3、保存期1年左右。（二）沙土管保藏法144（三）菌丝速冻法

不产孢子或芽孢的微生物可用甘油菌丝速冻法。保藏温度为－20℃，为避免损伤致死，需甘油作保护剂。甘油最终浓度为25％。

操作：①、配制浓度为50％的甘油溶液，121℃灭菌后备用；②、制备菌悬液，一般浓度为108～1010个/mL；③、菌悬液和甘油溶液等体积混合均匀，置－20℃保藏。（三）菌丝速冻法145（四）石蜡油封存法

向菌种斜面上，倒入一层灭菌石蜡油，量高出斜面1cm，保存冰箱中。适于不能利用石蜡油作碳源的微生物。保存期约1年。（四）石蜡油封存法146（五）真空冷冻干燥保藏法基本原理：在较低温度下(-18℃)，快速地将细胞冻结，并且保持细胞完整，然后在真空中使水分升华。在这样的环境中，微生物的生长和代谢暂时停止，不易发生变异。菌种可保存5年左右。

（五）真空冷冻干燥保藏法147

基本操作：将微生物制成悬浮液，与保护剂混合，放在安瓿管内，用低温酒精或干冰迅速冻结，低温下用真空泵抽干，真空熔封。低温保藏。

保护剂：脱脂牛奶或血清等。牛奶可用离心或加热的方法脱脂。

保护剂的作用：在冷冻干燥的脱水过程中代替结合水而稳定细胞成分(细胞膜)的构型，防止细胞膜因为冻结而破坏。保护剂还可以起支持作用，使微生物疏松地固定在上面。