无菌及微生物检查方法验证

无菌检查及微生物检查方法

介绍内容

一、微生物的基础知识二、无菌检查方法

微生物基础知识

微生物（microorganism,microbe）是一些肉眼看不见的微小生物的总称。微生物（microorganism）包括细菌、支原体、螺旋体、衣原体、立克次体、病毒及真菌（霉菌、酵母菌和放线菌）等。

细菌（bacterium）属于原核细胞型微生物，其特点是具有细胞壁、原始的核质，以二分裂方式繁殖。

细菌的形态

⒈细菌体积微小，是无色半透明的，用肉眼直接观察难以看到，其结构和形状须经过显微镜放大数百倍至上千倍才能观察。⒉一般以微米（µm）作为测量单位。⒊在细菌学中，按其形态可分为球菌、杆菌、弧菌和螺杆菌。⒋经革兰染色法（Gramstain）可将细菌分成两大类：即革兰阳性菌（G+）和革兰阴性菌（G-）。

真菌（fungus；eumycetes）是具有真核和细胞壁的生物。种类很多，已报道的种超过10万个。大多是由纤细管状菌丝构成的菌丝体。许多菌丝在一起统称菌丝体。菌丝体在基质上生长的形态称为菌落。

真菌的形态具有多样性，大小不一，大的用肉眼可以看到，小的用普通光学显微镜放大数倍乃至千倍方可观察到。其形态分单细胞、多细胞，单细胞呈圆形或卵圆形，如酵母菌（yeast）。多细胞由菌丝和孢子组成，并交织成团。

药品污染常见的真菌

毛霉属、根霉属、曲霉属、青霉属、木霉属一、毛霉属（MucorMicheliexFries）

毛霉属在自然界分布很广，常用于发酵工业。并引起水分高的粮食及食品的霉烂变质。

根霉属（RhizopusEhrenberg）

根霉属广泛应用于发酵工业，在潮湿的粮食及食品上能迅速蔓延生长，引起粮食及食品的腐烂。曲霉属（Aspergillus）

曲霉属的菌丝无色、淡色或表面凝聚有色物质，为有隔的多细胞。本属的常见产毒霉菌有8个种，具有强烈的致癌性。

青霉属菌丝无色色或有色色，为有有隔的多多细胞。。分生孢孢子梗从从菌丝垂垂直生出出，无足足细胞，，顶端不不膨大，，无顶囊囊，产生生一轮至至数轮分分叉，在在最后一一级分枝枝的小梗梗上，长长出成串串的分生生孢子，，形似扫扫帚状，，称为帚帚状枝。。本属的的常见产产毒霉菌菌有9个个种，其其中展青青霉可产产生展青青霉素，，是一种种神经毒毒素，并并具有致致畸、致致突变和和致癌性性；霉菌菌落落形态霉菌在孟孟加拉红红培养基基上的形形态酵母菌显显微镜下下形态无菌检查查法无菌检查查法系用用于检查查药典要要求无菌菌的药品品、医疗疗器具、、原料、、辅料、、及其他他品种是是否无菌菌的一种种方法。。若供试试品符合合无菌检检查法的的规定，，仅表明明了供试试品在该该检验条条件下未未发现微微生物污污染。无菌保障障试验环境境检验依据据隔离系统统的应用用应用隔离离系统重重要的目目的⒈是保护护产品免免受外源源性污染染，包括括操作人人员、操操作环境境及外包包装等的的污染，，保证无无菌实验验结果的的可靠性性，实现现一次检检出的要要求。⒉是保护护操作人人员免受受实验过过程中的的有害物物质带来来的污染染。隔离系统统应按相关关的要求求进行验验证，其其内部环环境的洁洁净度须须符合无无菌检查查的要求求。日常检验验还需对对试验环环境进行行监控。。培养基硫乙醇酸酸盐流体体培养基基改良马丁丁培养基基0.5%葡萄糖糖肉汤培培养基制备培养养基的要要求⒈培养基基的装量量与容器器高度的的比例应应符合培培养结束后培养养基氧化化层（粉粉红色））不超过过培养基基深度1/2。。⒉培养基基氧化层层颜色不不得超过过培养基基深度的的1/5，否则则，须经经100℃水浴浴加热至至粉红色色消失（（不超过过20分分钟），，迅速冷冷却，只只限加热热一次。。⒊配制好好的培养养基应采采用验证证合格的的灭菌程程序灭菌菌。培养基的的贮存制备好的的培养基基应在2-25℃、避避光保存存；保保存在在非密容容器中，，应在3周内使使用；保保存在密密闭容器器中，可可在1年年内使用用。培养基的的适用性性检查无菌性检检查每批培养养基随机机取不少少于5支支，培养养14天天应无菌菌生长。。试验可可与无菌菌试验同同时进行行。灵敏度检检查菌种种菌液制备备黑曲霉菌菌液的制制备培养基基接接种参照中国国药典2010版结果判断断空白对照照应无菌菌生长，，若加菌菌的培养养基管均均生长良良好，判判该培养养基的灵灵敏度检检查符合合规定。。试验同时时应做空空白对照照稀释液、、冲洗液液0.1%蛋白胨胨水溶液液pH7.0氯化化钠-蛋蛋白胨缓缓冲液根据供试试品的特特性，可可选用其其他经验验证过的的适宜的的溶液作作为稀释释液、冲冲洗液。。如需要，，可在上上述稀释释液或冲冲洗液的的灭菌前前或灭菌菌后加入入表面活活性剂或或中和剂剂等。阳性对照照根据供试试品特性性选择阳阳性对照照菌：无抑菌作作用及抗抗革兰阳阳性菌抗革兰阴阴性菌抗厌氧菌菌抗真菌加菌量结果判断断阴性对照照供试品无无菌检查查时，应应取相应应溶剂和和稀释液液、冲洗洗液同法法操作，，作为阴阴性对照照。阴性性对照不不得有菌菌生长。。无菌检查查法包括薄膜膜过滤法法和直接接接种法法。只要供试试品性状状允许，，应采用用薄膜过过滤法。。薄膜过滤滤法过滤器应应优先选选择封闭闭式薄膜膜过滤也也可使用用一般薄薄膜过滤滤器。选择滤膜膜材质时时应考虑虑供试品品及其溶溶剂的特特性。⒈可溶于于十四烷烷酸异丙丙酯的膏膏剂和黏黏性油剂剂供试品品。⒉水溶性供试品直直接过滤滤。⒊可溶性性固体制制剂供试试品。⒋装有药物物的注射射器供试品和和具有导导管的医医疗器具具的供试试品。直接接种种法供试品按按规定量量分别接接入含培培养细菌菌和真菌菌培养基基的容器器中，除除另有规规定外，，每个容容器中的的培养基基量应符符合接种种的供试试品体积积不得大大于培养养基体积积的10%。同同时硫乙乙醇酸酸盐培养养基不得得少于15ml、改良良马丁培培养基不不得少于于10ml，培培养基用用量和高高度应经经方法验验证。培养及观观察培养14天，如如果培养养基浑浊浊或培养养14天天后从外外观不能能判断是是否长菌菌，可取取该培养养液适量量转种至至同种培培养基或或斜面上上，培养养细菌2天、真真菌3天天，观察察有无菌菌生长或或镜检进进行判断断。阴性对照照不得有有菌生长长。结果判断断⒈若供试试品管均均澄清，，或虽显显浑浊无无菌生长长，判供供试品符符合规定定。⒉若供试试品中任任何1管管显混浊浊并确证证有生长长供试品品不符合合规定。。⒊除非能能充分证证明，检检出的微微生物非非供试品品所含。。⒋当符合合下列至至少一个个条件时时，方可可判复试试。⑴对无无菌检查查试验所所用的设设备及环环境的微微生物监监控结果果不符合合无菌检检查法的的要求。。⑵回顾顾无菌实实验过程程，发现现有可能能引起微微生物污污染的因因素；⑶阴性性对照管管有菌生生长。⑷供供试试品品管管中中生生长长的的微微生生物物经经鉴鉴定定后后，，确确证证微微生生物物生生长长是是因因无无菌菌试试验验中中所所使使用用的的物物品品和和（（或或））无无菌菌操操作作技技术术不不当当引引起起的的。。⑸试试验验若若经经确确认认无无效效，，应应重重试试。。重重试试时时，，重重新新取取同同量量供供试试品品，，依依法法重重试试，，若若无无菌菌生生长长，，判判供供试试品品符符合合规规定定，，若若有有菌菌生生长长判判供供试试品品不不符符合合规规定定。。方法法验验证证的的必必要要性性⒈为为保保证证检检验验结结果果的的可可靠靠性性，，真真实实性性，，选选择择正正确确的的检检验验方方法法是是至至关关重重要要的的。。因因此此试试验验前前必必须须对对选选择择的的方方法法进进行行验验证证。。⒉证证明明所所采采用用的的方方法法是是适适宜宜的的，，确确认认所所采采用用的的方方法法适适宜宜于于被被检检供供试试品品的的微微生生物物污污染染的的检检验验。。药品品无无菌菌检检查查和和微微生生物物检检查查方方法法验验证证检验验结结果果的的影影响响因因素素⒈供供试试品品的的组组分分⒉环环境境影影响响⒊检检验验方方法法⒋检检验验条条件件⒈我我国国无无菌菌和和微微生生物物检检验验方方法法验验证证的的概概况况⒉⒉国国外外无无菌菌和和微微生生物物检检验验方方法法验验证证的的概概况况⒊⒊国国外外无无菌菌和和微微生生物物检检验验方方法法验验证证的的概概况况药品品微微生生物物检检验验方方法法验验证证的的基基本本要要求求验证证试试验验的的设设计计需需综综合合全全面面考考虑虑，，主主要要有有以以下下几几方方面面；；⑴供供试试品品特特性性⑵检验目的⑶试验全方面验验证当验证试验符符合要求时，，就可认为在在该试验条件件下该供试品品对微生物无无抑菌作用或或抑菌作用可可忽略不计，，供试品检验验结果可真实实的体现。⑷重新验证证药品的生产工工艺、制剂组组分、检验方方法或检验条条件发生改变变时，应重新新进行验证，，以确认所发发生的变化不不影响该药品品中的微生物物检查。验证试验用菌菌株的要求⑴验证试验用用菌株应有代代表性。⑵试验菌株应应选择非致病病性菌株。⑶试验菌宜选择择比较稳定、、重现性强的的菌株。⑷菌株传代次次数不得超过过第五代。试验用菌株的的储藏菌种保藏的原原则根据微生物菌菌种的生理、、生化特性，，在人工创造造的条件下尽尽量降低微生生物细胞的代代谢强度，使使细胞基本上上处于休眠状状态，生长繁繁殖受到抑制制但不至于死死亡，以减低低菌种的变异异率。标准菌株的复复活或培养物物的制备应按按供应商提供供的说明或按按验证的方法法进行。低温、干燥、、缺氧、缺乏乏营养等环境境条件都可以以抑制微生物的的代谢和生长长繁殖，因此此低温、干燥燥和真空空是菌种保藏藏的重要手段段。标准储备菌株株经纯度和特特性确认后保保存时，可将将培养物等份悬悬浮于抗冷冻冻的培养基中中，并分装于于小瓶中中,建议采用用低温冷冻干干燥，液氮储储存，超超低温冷冻冻(低于-70℃)等方方法保存。冷冻菌株一旦旦解冻转种制制备工作菌株株后,不得重重新冷冻或再再次使用。工作菌株不可可代替标准菌菌株，标准菌菌株的商业衍衍生物仅可用用作工作菌株株。不同的微生