PCR技术及其发展和应用课件

PCR技术及其发展和应用张雪梅检验系临床生化教研室PCR技术及其发展和应用张雪梅1主要参考书

CW迪芬巴赫

、GS德弗克斯勒［美］主编。《PCR技术实验指南》黄留玉主编。《PCR最新技术原理、方法及应用》尹一兵主编。《分子诊断学》主要参考书

CW迪芬巴赫

、GS德弗克斯勒［美］主编。《P2目录PCR技术的原理PCR技术的衍生技术实时荧光PCR技术PCR技术的应用目录PCR技术的原理3一、PCR的基本原理PCR反应体系PCR过程PCR的特点标准的PCR反应体系4种dNTP混合物各200umol/L引物各10～100pmol模板DNA0.1～2ugDNA聚合酶2.5uMg2+1.5mmol/L一、PCR的基本原理PCR反应体系标准的PCR反应体系4PCR的基本原理PCR反应体系PCR过程PCR的特点PCR的基本原理PCR反应体系51234522557294时间（min）温度（℃）PCR的基本原理PCR反应体系PCR过程PCR的特点适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍MOVIE1234522557294时间（min）温度（℃）PCR的基6PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点1234522557294时间（min）温度（℃）适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性子链延伸DNA加倍DNA变性形成2条单链模板DNA95℃PCR的基本原理PCR反应条件1234522557294时间7PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50℃引物1引物2DNA引物PCR的基本原理PCR反应条件50℃引物1引物2DNA引物8PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶PCR的基本原理PCR反应条件引物1引物2DNA引物72℃T9PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点第1轮结束95℃第2轮开始PCR的基本原理PCR反应条件第1轮结束95℃第2轮开始10PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50℃TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理PCR反应条件50℃TaqTaqTaqTaq11PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第2轮结束PCR的基本原理PCR反应条件72℃第2轮结束12PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增理想拷贝数=2nn循环次数实际拷贝数=(1+x)nX平均效率,约为0.85n循环次数

重复30轮后230=1,073,741,8241.8530=103,550,417PCR的基本原理PCR反应条件模板DNA第1轮扩增第2轮扩增13PCR技术简史核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明PCR的完善1971年，Khorana提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。但由于测序和引物合成的困难，以及70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，Khorana的设想被人们遗忘了……PCR技术简史核酸体外扩增的设想1971年，Khorana提14PCR技术简史核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明PCR的完善1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR）基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制然而，采用E-coliDNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错PCR技术简史核酸体外扩增的设想1985年，美国PE-Cet15PCR技术简史核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明PCR的完善1988年初，Keohanog改用T4DNA聚合酶进行PCR，其扩增的DNA片段很均一，真实性也较高，只有所期望的一种DNA片段。但每循环一次，仍需加入新酶。1988年Saiki等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermusaquaticus)中提取到一种耐热DNA聚合酶。

耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪PCR技术简史核酸体外扩增的设想1988年初，Keohano16实验步骤（1）在0.5mlPCR管内配置20ul反应体系：

CK(ul)1#(ul)模板01引物10.50.5引物20.50.510×PCRBuffer22Taq酶0.20.2dNTPs0.50.5ddH2O16.315.3Total2020实验步骤（1）在0.5mlPCR管内配置20ul反应体系：17（2）PCR反应程序(1)94℃变性5min，(2)94℃变性1min，(3)52℃退火1min，(4)72℃延伸1min。

(5)72℃延伸10min。重复(2)-(4)30次（2）PCR反应程序(1)94℃变性5min，重复(2)-18PCR结果：1、对照(无模板)；2－6、PCR产物（5ul样品）PCR产物的电泳鉴定PCR结果：1、对照(无模板)；PCR产物的电泳鉴定19PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点灵敏度高皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平能从100万个细胞中检出一个靶细胞病毒检测的灵敏度可达3个RFU细菌检测的最小检出率为3个细菌简便、快速一次性加好反应液，1～4小时完成扩增扩增产物一般用电泳分析对标本的纯度要求低血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNAPCR的基本原理PCR反应条件灵敏度高20（1）模板单、双链DNA均可，多种来源。质量要求不高，但不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。一般人基因组100ngDNA模板（100L）。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。PCR反应的影响因素

1)反应体系Lambda

DNA，模板量分别为100

pg,

10pg,

1pg,

100fg

,

10fg

（1）模板PCR反应的影响因素

1)反应体系Lambda

D21（2）引物引物是与待扩增DNA片断两翼互补的一段特异的寡核苷酸片断。引物是PCR反应中最关键的因素，因此引物序列的设计对于PCR是否成功是非常重要的。

（2）引物22引物设计的原则：（1)序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列。序列的查找可在相关的网址，如/pubmed查找各种目的序列。同源性比较可以在www.ncbi.nih/blast.cgi进行在线比较或通过OMIGA、ClustalX等软件进行两两或多序列的比较。引物序列同源性比对引物设计的原则：序列的查找可在相关的网址，如http://w23（2）引物长度以15-40bp为宜。（3）碱基尽可能随机分布，G+C占50-60%。（4）引物内部避免形成二级结构（发夹结构）。（5）两引物间避免有互补序列（二聚体）。（6）引物3’端为关键碱基；5’端无严格限制。（2）引物长度以15-40bp为宜。243’5’3’5’限制性内切酶的识别序列启动子序列定点突变探针标记3’5’3’5’限制性内切酶的识别序列25引物设计引物设计常用软件主要有：PrimerPremier5.0Oligo6primer3ThePrimerGeneratorNetPrimer

引物设计引物设计常用软件主要有：261.将序列输入软件中（2）在表中粘贴序列（1）新序列两个方法1.将序列输入软件中（2）在表中粘贴序列（1）新序列两个方27选择序列文件所在位置（2）打开原有的序列文件选择序列文件所在位置（2）打开原有的序列文件28在对话框中输入待扩增序列点击左上角的“Primer”按钮在对话框中输入待扩增序列292.设置相关参数2.设置相关参数303.得到的引物结果3.得到的引物结果31Hairpin:引物自身是否会形成发夹结构Dimer:同一种引物是否会形成二聚体Falseprimiring:引物在待扩增序列中其他位置是否有配对CrossDimer:正向与反向引物间是否会形成二聚体正向和反向引物的互换正向和反向引物的评价正向和反向引物的信息每点击左边红色的按钮，就出现相应的内容对正向和反向引物进行编辑Hairpin:引物自身是否会形成发夹结构正向和反向引物的32可对引物进行增加或减少碱基用键盘输入5个碱基可对引物进行用键盘输入5个碱基33引物的信息改动后引物的信息引物的信息改动后引物的信息34重新回到双引物的界面重新回到双引物的界面35“Edit”－“Copy”－“SensePrimer”5'CGCCTCGAGAAAAGACAGGACTCCACCTCA3'4.输出引物序列“Edit”－“Copy”－“SensePrimer”4.36引物纯度：公司合成引物常用的纯化方式C18脱盐、OPC纯化、PAGE纯化、HPLC纯化。普通PCR：OPC纯（>95%）较长引物（大于50个碱基）：PAGE纯（>95%）经过修饰或标记的引物：HPLC纯（>99%,但价格昂贵）引物浓度：0.1-0.5mol/L，浓度过高易导致模板与引物错配，反应特异性下降。引物纯度：公司合成引物常用的纯化方式C18脱盐、OPC纯化37

合成内容产量(OD)发货时间(工作日)纯化方式价格(￥)普通引物合成(<60base)23PAGE1.60/base2~53OPC1.30/base5~105PAGE2.20/base3OPC1.80/base205PAGE4.00/base3OPC3.20/base305PAGE5.80/base3OPC4.60/base506PAGE10.00/base4OPC8.00/base1007PAGE询价5OPC询价长链合成(60~90base)25PAGE3.50/base长链合成(90~120base)25PAGE5.00/base***生物科技有限公司的引物合成服务

合成内容产量(OD)发货时间(工作日)纯化方式价格(￥)38（3）耐热DNA聚合酶1）TaqDNA聚合酶（Taqpolymerase）：95℃的半寿期为40min最适温度（72℃）时每个酶分子每秒可催化合成150个核苷酸酶活性（受多种因素影响）：5’→3’方向的聚合酶活性，5’→3’方向的外切酶活性和逆转录酶活性，非模板依赖性活性，可在双链PCR产物每一条链的3‘端加上单核苷酸尾，使PCR产物的3’端突出一个单A核苷酸尾（3）耐热DNA聚合酶1）TaqDNA聚合酶（Taqpo39TthDNA聚合酶：在高温和MnCl2存在的条件下，能有效地逆转录RNA。用于一步法RT-PCR。VentDNA聚合酶：又称TliDNA聚合酶，该酶耐高温且具有3‘-5’外切酶活性的校对功能，其保真性较TaqDNA聚合酶高一倍。该酶扩增长片断（>12kb）的功能较强。PfuDNA聚合酶：具有3’→5’外切酶活性的校对功能，催化DNA合成的忠实性比Taq聚合酶高12倍，但不适于>2kb的片断扩增。2）其他的耐热聚合酶TthDNA聚合酶：在高温和MnCl2存在的条件下，能有效40（4）dNTPdNTP浓度取决于扩增片段的长度四种dNTP浓度应相等浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性。（4）dNTP41（5）Mg2+Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降；Mg2+过高影响反应特异性。Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。（5）Mg2+Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。422）循环参数变性使双链DNA解链为单链95oC20-30秒(2)退火温度由引物长度和GC含量决定。增加温度能减少引物与模板的非特异性结合，降低温度可增加反应的灵敏性。2）循环参数43（3）延伸70-75oC，延伸时间由扩增片段长度决定（4）循环次数主要取决于模板DNA的浓度一般为25-35次次数过多：扩增效率降低，错误掺入率增加（3）延伸44二、PCR的衍生技术

逆转录PCR（reversetranscriptionPCR，RT-PCR）

反向PCR（inversePCR）

巢氏PCR（nestingPCR）

原位PCR（insituPCR）多重PCR（multiplexPCR）多重等位基因PCR（multiplexallelePCR）

不对称PCR（asymmertricPCR）

锚定PCR（anchoredPCR）

长片段PCR（longfragmentPCR）荧光定量PCR（fluorescentquantitativePCR）二、PCR的衍生技术45逆转录酶DNA聚合酶活性mRNAcDNA杂化双链PCR扩增1、逆转录PCR

(reversetranscription-PCR,RT-PCR)

逆转录酶DNA聚合酶活性mRNAcDNA杂化双链PCR扩增146影响因素（1）模板对RT-PCR的影响对RNA制品的纯度和完整性要求都极为严格（2）逆转录酶对RT-PCR的影响MLV逆转录酶能合成大于2kb的较长cDNA，但对热的稳定性较AMV逆转录酶差。（3）逆转录引物对RT-PCR的影响随机引物：原核细胞多用oligo(dT)：真核细胞多用基因特异性的引物（GSP）：特异性强，广谱性低影响因素（1）模板对RT-PCR的影响47例子：S.pn的转化对PsaA基因mRNA表达的影响a、RNA的提取：野生型和转化缺陷型S.pn都诱导转化后，采用Qiagen试剂盒进行总RNA提取。b、cDNA的制备：取RNA2μl，随机引物1μl，DEPC水9μl，混匀后，70℃变性5min，立即置于冰上。然后顺序加入逆转录buffer5μl，dNTP1.5μl,RNasin0.5μl,DEPC水5μl,逆转录酶M-MLV1μl。混匀后于37℃，1小时，得到cDNA。c、PCR扩增:

PsaA的引物3μL，cDNA1μL，Tagplus酶0.2μL，共30μL体系。循环参数：94℃30秒，55℃40秒，72℃45秒，循环30次。用16srRNA的PCR产物为标准物，2%琼脂糖电泳。例子：S.pn的转化对PsaA基因mRNA表达的影响a、R48

电泳结果用软件Quantity-one3.2进行半定量比较，结果进行配对t检验分析16S(463bp)PsaA(254bp)图2，2号菌株及其转化缺陷菌株在加入CSP后的不同时间PsaAmRNA的表达。

1234567图1，2号菌株及其转化缺陷菌株在加入CSP后的不同时间PsaA的RT-PCR电泳图。line1:Marker2.line2-4:0min,10min,20minafterS.pneumoniaeNo.2wasaddedCSP.line5-7:0min,10min,20minafterS.pneumoniaeNo.2dwasaddedCSP.

***电泳结果用软件Quantity-one3.2进行半定量比492、反向PCR(inversePCR)

用反向的引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。应用：（1）用于测序的DNA大片段的克隆（2）获得启动子序列（3）小质粒的定点突变（4）鉴定插入失活基因或体内诱导基因2、反向PCR(inversePCR)用反向的引物50已知序列未知序列未知序列限制酶限制酶连接酶反向PCR示意图已知序列未知序列未知序列限制酶限制酶连接酶反向PCR示意图51转化到大肠杆菌后，提取质粒，采用质粒引物即可直接对X片断进行扩增后测序，得到X基因序列信息。（10/64）EGFPXdw序列Xdw序列质粒引物质粒引物质粒引物例子：S.pn体内诱导基因序列的获得转化到大肠杆菌后，提取质粒，采用质粒引物即可直接对X片断进行523、多重PCR(multiplexPCR)

用于检测特定基因序列的存在或缺失。电泳引物3、多重PCR(multiplexPCR)用于检测特定基53图1第1、2、3组引物多重PCR电泳图

1：正常对照；2：DL2000marker；3~10：检出的缺失型患者杜氏/贝克型肌营养不良症一种常见的致死性神经-肌肉系统的X连锁隐性遗传病，其基因突变中缺失最常见，约占55%~65%，缺失分布的位点较多，随地域及民族的差异而有不同特点图1第1、2、3组引544、突变PCR（1）随机突变：应用：构建突变体文库，继而可从中筛选出具有特殊性质的突变个体策略：易错PCR（error-pronePCR）。利用TaqDNA聚合酶等耐热DNA聚合酶不具有3′→5′校对功能的特性，在PCR扩增反应中可能掺入错误的核苷酸，从而产生随机错误的扩增产物。加入次黄嘌呤核苷酸并限制某一种核苷酸的用量，从而促进DNA聚合酶选择其它3种核苷酸或次黄嘌呤核苷酸，导致扩增产物发生突变。4、突变PCR（1）随机突变：55（2）定点突变（1）5‘端引入突变：通过修饰上游引物的5’端，即可引入标记的碱基、限制性酶切位点、启动子序列等。（2）序列中的单位点突变：采用重叠延伸PCR(OverlapExtensionPCR，OEPCR)（2）定点突变（1）5‘端引入突变：通过修饰上游引物的5’56（A）为5‘端引入突变（B）为单碱基突变（A）为5‘端引入突变（B）为单碱基突变57例子：S.pn的ply146aa缺失的突变序列构建S.Pn的ply为一细胞毒性分子，其146位aa缺失后毒性大大减弱。构建突变体作为疫苗：首先设计4个引物：（M1和M2完全重叠）P1:5’-CGGGATCCATGGCAAATAAAGCAGTAAATG-3’BamHIP2:5’-CCGCTCGAGCAAGCATTCTCCTCTCCTAGTC-3’XhoIM1:5’-GGTCAATAATGTCCCAAGAATGCAGTATG-3’M2:5’-CATACTGCATTCTTGGGACATTATTGACC-3’例子：S.pn的ply146aa缺失的突变序列构建58突变位点M2M1P2P15’5’5’3’3’5’为酶切位点序列以基因组DNA为模板，以P1和M1为引物扩增出ply上游片断，以P2和M2为引物扩增出ply下游片断以上下游片断为模板，以P1和P2为引物，扩出全长酶切后克隆到质粒中保存突变位点M2M1P2P15’5’5’3’3’5’为酶切位点序59（3）多位点突变策略：多次重叠PCR关键：重叠引物的设计（每对突变引物需要部分重叠，方向相反）。（3）多位点突变策略：多次重叠PCR605、原位PCR(InSituPCR)原位PCR是由Hasse等于1990年首创。它是利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段，在不破坏细胞的前提下，利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行PCR扩增，可进行细胞内定位。适用于检测病理切片中含量较少的靶序列。5、原位PCR(InSituPCR)原位PCR是61操作步骤1.细胞或组织固定：细胞经固定和乙醇通透化处理后便适于一般PCR试剂（包括引物和Taq酶）进入2.PCR扩增细胞内目的片段3.原位杂交检测扩增产物A.阳性对照B.阴性对照C.原位检测mRNA表达操作步骤A.阳性对照B.阴性对照C.原位检测mRNA表达62三、实时荧光PCR技术

通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程；结合相应的软件可以对结果进行分析，计算待测样品的初始模板量。三、实时荧光PCR技术通过荧光染料或荧光标记的特异63如何定量？Ct值的概念Ct值的定义：PCR扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的阈值所对应的循环次数。为什么要用Ct值定量实时荧光定量PCR方法利用循环阈值（Ct）的概念，在指数扩增的开始阶段进行检测，此时样品间的细小误差尚未放大，因此该Ct值具有极好的重复性。如何定量？Ct值的概念64C(t)值的重现性相同模板在同一台PCR仪上相同条件下重复96次扩增的扩增曲线图终点处检测产物量不恒定；C(t)值具重现性C(t)值的重现性相同模板在同一台PCR仪上相同条件下重复965荧光强度循环数曲线初始模板量对数C(T)循环数标准曲线10410310610510210C(t)与初始模板含量初始模板量越多，C(t)值越小C(t)与初始模板浓度的对数值成线性关系荧光强度循环数曲线初始模板量对数C(T)循环数标66定量原理初始DNA量越多,荧光达到某一值（域值）时所需要的循环数越少（Ct值）Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数就可计算出样品中所含的模板量确定初始模板的浓度定量原理初始DNA量越多,荧光达到某一值（域值）时所需要671、荧光定量PCR标记方法内掺式染料 SYBRGreenI序列特异性探针 Taqman MolecularBeacons DualProbes(FRET)引物特异性探针

Amplifluor(Intergen)1、荧光定量PCR标记方法685’3’5’3’SGExcitationSGSGSGSGEmissionSYBR-GreenI

1）内掺式染料5’3’5’3’SGExcitationSGSGSGSGEm695’3’5’3’SGSGSGSGSGExcitationEmissionSYBR-GreenI

5’3’5’3’SGSGSGSGSGExcitationEm70优点使用方便 不必设计复杂的引物没有序列特异性可以用于不同的模板便宜灵敏优点使用方便71例子：荧光定量PCR检测肺炎链球菌comE基因转录水平方法流程：1、标准品制备：普通PCR扩增出comE基因片断→装入克隆质粒→定量稀释为109拷贝作为标准品备用2、定量检测comE基因表达水平：提取RNA→逆转录成cDNA→与成10倍梯度稀释的标准品一起作为模板，同时进行荧光定量PCR→根据实验数据分析结果→得到其表达的绝对量。例子：荧光定量PCR检测肺炎链球菌comE基因转录水平方法72图1comE基因荧光定量PCR扩增曲线图2comE基因荧光定量PCR融解曲线表1D39菌株在CSP诱导后不同时间的comE基因mRNA表达批次comE/16SrRNA0min10min*20min10.03410.95200.040220.19741.20470.111230.01240.40730.0160*：p<0.05，CSP诱导10min时comE的表达量较0min和20min时显著增高实验结果：图1comE基因荧光定量PCR扩增曲线图2comE基因荧73Oligo1:FluoresceinOligo2:LCRed640ExcitationEmissionTransfer荧光共振能量传递（FRETProbe）2）序列特异性探针Oligo1:FluoresceinOligo2:L74双标记探针（TaqmanProbe）双标记探针（TaqmanProbe）75优点对目标序列有很高的特异性特别适合于SNP检测与MolecularBeacons相比设计相对简单是目前应用最广泛的一种技术TACCGGGGGTTACGAACGGTAATGA

T

C

CTA

CCG

A

T

C

C

C

A

CCSNP检测优点对目标序列有很高的特异性TACCGGGGGTTACGAA76RQExcitationXRQQRExcitationEmission分子信标（MolecularBeaconProbe）RQExcitationXRQQRExcitationEmi775’3’5’3’5’3’5’3’3’RQ5’RQRQ3’5’QRRREmissionExcitationQR引物特异性探针（AmplifluorProbe）3）引物特异性探针5’3’5’3’5’3’5’3’3’RQ5’RQRQ3’5’782、荧光定量实时PCR与普通PCR的比较灵敏度高灵敏的荧光检测较电泳检测灵敏度高特异性高使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合，提高了PCR反应的特异性定量准确全程监控，准确的算法进行定量无需跑胶，自动化程度高2、荧光定量实时PCR与普通PCR的比较794通道实时荧光定量PCR仪3、荧光定量PCR仪荧光定量PCR仪是一种带有激发光源和荧光信号检测系统的PCR仪，通常配有电脑系统及相应的分析软件。4通道实时荧光定量PCR仪3、荧光定量PCR仪80

PCR只是一个简单的不起眼玩艺——凯利·穆利斯（KaryMullis)PCR只是一个概念，所发生的奇迹是：PCR概念变成了可操作的实验系统，变成了一项成熟的技术，后者又上升成为新的概念。…

它最大的特点就是能不断推出新形式。

——摘自[MakingPCR:AStoryofBiotechnology

byPaulRabinow]

81PCR技术的应用研究与生产基因克隆，DNA测序，分析突变诊断细菌、病毒、寄生虫检测，肿瘤诊断法医犯罪现场标本分析其他……PCR技术的应用研究与生产821)基因克隆重组质粒质粒DNA基因片段酶切PCR扩增染色体DNA连接1)基因克隆重组质粒质粒DNA基因片段酶切PCR扩增染色体83基因工程产品大肠杆菌胰岛素重组体

+胰岛素基因染色体DNAPCR扩增基因工程产品大肠杆菌胰岛素重组体+胰岛素基因染色体D84我国已批准生产的部分生物技术药物名称作用rhuEPO产生红细胞rhuIFNα1b(外用)病毒性角膜炎rhuIFNα1b乙肝、丙肝rhuIFNα2a乙肝、丙肝、疱疹等rhuIFNα2a(酵母)乙肝、丙肝rhuIFNα2b乙肝、丙肝白血病等rhuIFNα2a(栓剂)妇科病rhuIFNα2b(凝胶剂)疱疹等rhuIFNγ类风湿人胰岛素糖尿病rhuG－CSF刺激产生白细胞rhuGM－CSF刺激产生白细胞、骨髓移植rhuGH矮小病乙肝疫苗预防乙肝rhuEGF(外用)烧伤、创伤EGF衍生物烧伤、创伤rhuIL2癌症辅助治疗rhuIL2125Ser癌症辅助治疗bFGF(外用)创伤、烧伤RSK溶血栓(心梗)抗IL28单抗乳膏剂银屑病痢疾疫苗预防痢疾我国已批准生产的部分生物技术药物85Sequencingbysynthesis(Illumina/Solexa)：readlength80-150bp,1G/run.2)基因测序dioldiol 1stcycledenaturation1stcycleannealingdioldioln=35total1stcycleextensiondioldioldioldiol2ndcycledenaturation2ndcycleannealingdioldioldioldioldioldiol2ndcycleextensionPCRPCRSequencingbysynthesis(Illum863)基因检测A’内源性病变基因正常人A病人外源性基因正常人(-)病人(+)3)基因检测A’内源性病变基因正常人A病人外源性基因正常人87β-地中海贫血症

扩增阻滞突变系统（amplificationrefractorymutationsystem，ARMS）进行检测（1）内源性基因检测—遗传病的诊断β-地中海贫血症扩增阻滞突变系统（amplifi88PCR技术及其发展和应用课件89300bp1000bp800bp图1，β珠蛋白ARMS检测结果11、2分别为正常样本的N产物和M产物，3、5、7为检测样本的N产物,4、6、8为相应M产物。图2，β珠蛋白ARMS检测结果21为N产物，2为M产物对照产物861bp300bp1000bp800bp图1，β珠蛋白ARMS检测结90囊性纤维化病(CF)

囊性纤维化病(CF)91镰刀型细胞贫血症

镰刀型细胞贫血症92（2）外源性基因检测—病原体的诊断丙型肝炎病毒（HCV）感染的诊断（2）外源性基因检测—病原体的诊断丙型肝炎病毒（HCV）感染93HBV感染的传统诊断主要采用免疫测定法检测血清标本中的HBSAg，HbeAg，抗-Hbs，抗-HBc和抗-Hbe（两对半），免疫学方法虽然比较简单，但只能提供血清中的HBV间接证据，无法证明是否具有传染性，且敏感性较低。目前的荧光定量PCR方法多采用TaqMan探针，一般根据HBV基因中的高度保守序列来设计，能够检测少至10拷贝/mL的HBVDNA。检测限范围宽为250－2.5×109拷贝/mL，是传统方法的良好补充。乙型肝炎病毒（HBV）的PCR检测

HBV感染的传统诊断主要采用免疫测定法检测血清标本中的HBS94普遍认为HBeAg阳性者具有较强的传染性，而HBeAb的出现说明病情好转或稳定，其传染性弱。这113例HBeAg阴性患者检出42例HBV-DNA阳性，阳性率37.2%，具有传染性。A组(HBsAg、抗-HBe、抗-HBc均阳性)，B组(HBsAg、抗-HBc均阳性)，C组（抗-HBs、抗-HBe、抗-HBc均阳性），D组（抗-HBc阳性），E组（抗-HBe、抗HBc阳性）血清学模式例数阳性数阳性率A组622845.2B组16637.2C组12433.2D组15212.5E组8117.2合计1134237.2表1不同模式HBeAg阴性乙肝患者HBV-DNA阳性率（%）普遍认为HBeAg阳性者具有较强的传染性，而HBeA95采用聚乙二醇干扰素α-2a（PEG-IFN）、拉米夫定（LAM）、阿德福韦（ADV）、恩替卡韦（ETV）、替比夫定（LDT）和替诺福韦（TDF）治疗1年。上图为HBeAg阳性慢性乙肝患者，下图为HBeAg阴性慢性乙肝患者。采用聚乙二醇干扰素α-2a（PEG-IFN）、拉米夫定（L96目前结核病确诊主要依靠痰片染色，抗酸杆菌和结核杆菌的培养法鉴定。但涂片阳性率不高，且不能确诊；培养法需较长时间。ELISA和RIA法敏感性低，尚不能直接检测临床标本。结核分枝杆菌感染的分子诊断目前结核病确诊主要依靠痰片染色，抗酸杆菌和结核杆菌的培养法鉴97北京胸科医院、北京市结核病胸部肿瘤研究所、上海肺科医院三家医院的考核情况。

医院结核组351例对照组160例 例数涂阳培阳 北京胸科 143 36 42 60 北京结研所 151 40 31 50 上海肺科 57 57 29 50结核分枝杆菌(TB)FQ-PCR检测与常规检测比较北京胸科医院、北京市结核病胸部肿瘤研究所、上海肺科医98

FQ-PCR法与涂片法、培养法的检出率比较组别 涂片法 培养法 FQ-PCR法 例数阳性检出率阳性检出率阳性检出率 结核病组35113337.9%10229.1%22062.7%

对照组16000%00%00%

FQ-PCR法与涂片法、培养法的检出率比较组别 994)基因配型4)基因配型1005）法医学分析女性男性Y引物PCR男性女性5）法医学分析女性男性Y引物PCR男性女性101个体识别、亲缘鉴定方法：PCR-RFLPDNA遗传指纹PCR-ASOPCR-VNTR多态性PCR-SSCP线粒体DNA测序个体识别、亲缘鉴定102DNA指纹图谱鉴定返DNA指纹图谱鉴定返103思考题一次特异性很好的PCR后，所得产物的长度都是一样的吗？PCR技术的核心思路是什么，还可以有哪些变化，以实现不同的研究目的？思考题一次特异性很好的PCR后，所得产物的长度都是一样的吗？104PCR技术及其发展和应用张雪梅检验系临床生化教研室PCR技术及其发展和应用张雪梅105主要参考书

CW迪芬巴赫

、GS德弗克斯勒［美］主编。《PCR技术实验指南》黄留玉主编。《PCR最新技术原理、方法及应用》尹一兵主编。《分子诊断学》主要参考书

CW迪芬巴赫

、GS德弗克斯勒［美］主编。《P106目录PCR技术的原理PCR技术的衍生技术实时荧光PCR技术PCR技术的应用目录PCR技术的原理107一、PCR的基本原理PCR反应体系PCR过程PCR的特点标准的PCR反应体系4种dNTP混合物各200umol/L引物各10～100pmol模板DNA0.1～2ugDNA聚合酶2.5uMg2+1.5mmol/L一、PCR的基本原理PCR反应体系标准的PCR反应体系108PCR的基本原理PCR反应体系PCR过程PCR的特点PCR的基本原理PCR反应体系1091234522557294时间（min）温度（℃）PCR的基本原理PCR反应体系PCR过程PCR的特点适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍MOVIE1234522557294时间（min）温度（℃）PCR的基110PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点1234522557294时间（min）温度（℃）适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性子链延伸DNA加倍DNA变性形成2条单链模板DNA95℃PCR的基本原理PCR反应条件1234522557294时间111PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50℃引物1引物2DNA引物PCR的基本原理PCR反应条件50℃引物1引物2DNA引物112PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶PCR的基本原理PCR反应条件引物1引物2DNA引物72℃T113PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点第1轮结束95℃第2轮开始PCR的基本原理PCR反应条件第1轮结束95℃第2轮开始114PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50℃TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理PCR反应条件50℃TaqTaqTaqTaq115PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第2轮结束PCR的基本原理PCR反应条件72℃第2轮结束116PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增理想拷贝数=2nn循环次数实际拷贝数=(1+x)nX平均效率,约为0.85n循环次数

重复30轮后230=1,073,741,8241.8530=103,550,417PCR的基本原理PCR反应条件模板DNA第1轮扩增第2轮扩增117PCR技术简史核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明PCR的完善1971年，Khorana提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。但由于测序和引物合成的困难，以及70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，Khorana的设想被人们遗忘了……PCR技术简史核酸体外扩增的设想1971年，Khorana提118PCR技术简史核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明PCR的完善1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR）基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制然而，采用E-coliDNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错PCR技术简史核酸体外扩增的设想1985年，美国PE-Cet119PCR技术简史核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明PCR的完善1988年初，Keohanog改用T4DNA聚合酶进行PCR，其扩增的DNA片段很均一，真实性也较高，只有所期望的一种DNA片段。但每循环一次，仍需加入新酶。1988年Saiki等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermusaquaticus)中提取到一种耐热DNA聚合酶。

耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪PCR技术简史核酸体外扩增的设想1988年初，Keohano120实验步骤（1）在0.5mlPCR管内配置20ul反应体系：

CK(ul)1#(ul)模板01引物10.50.5引物20.50.510×PCRBuffer22Taq酶0.20.2dNTPs0.50.5ddH2O16.315.3Total2020实验步骤（1）在0.5mlPCR管内配置20ul反应体系：121（2）PCR反应程序(1)94℃变性5min，(2)94℃变性1min，(3)52℃退火1min，(4)72℃延伸1min。

(5)72℃延伸10min。重复(2)-(4)30次（2）PCR反应程序(1)94℃变性5min，重复(2)-122PCR结果：1、对照(无模板)；2－6、PCR产物（5ul样品）PCR产物的电泳鉴定PCR结果：1、对照(无模板)；PCR产物的电泳鉴定123PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点灵敏度高皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平能从100万个细胞中检出一个靶细胞病毒检测的灵敏度可达3个RFU细菌检测的最小检出率为3个细菌简便、快速一次性加好反应液，1～4小时完成扩增扩增产物一般用电泳分析对标本的纯度要求低血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNAPCR的基本原理PCR反应条件灵敏度高124（1）模板单、双链DNA均可，多种来源。质量要求不高，但不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。一般人基因组100ngDNA模板（100L）。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。PCR反应的影响因素

1)反应体系Lambda

DNA，模板量分别为100

pg,

10pg,

1pg,

100fg

,

10fg

（1）模板PCR反应的影响因素

1)反应体系Lambda

D125（2）引物引物是与待扩增DNA片断两翼互补的一段特异的寡核苷酸片断。引物是PCR反应中最关键的因素，因此引物序列的设计对于PCR是否成功是非常重要的。

（2）引物126引物设计的原则：（1)序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列。序列的查找可在相关的网址，如/pubmed查找各种目的序列。同源性比较可以在www.ncbi.nih/blast.cgi进行在线比较或通过OMIGA、ClustalX等软件进行两两或多序列的比较。引物序列同源性比对引物设计的原则：序列的查找可在相关的网址，如http://w127（2）引物长度以15-40bp为宜。（3）碱基尽可能随机分布，G+C占50-60%。（4）引物内部避免形成二级结构（发夹结构）。（5）两引物间避免有互补序列（二聚体）。（6）引物3’端为关键碱基；5’端无严格限制。（2）引物长度以15-40bp为宜。1283’5’3’5’限制性内切酶的识别序列启动子序列定点突变探针标记3’5’3’5’限制性内切酶的识别序列129引物设计引物设计常用软件主要有：PrimerPremier5.0Oligo6primer3ThePrimerGeneratorNetPrimer

引物设计引物设计常用软件主要有：1301.将序列输入软件中（2）在表中粘贴序列（1）新序列两个方法1.将序列输入软件中（2）在表中粘贴序列（1）新序列两个方131选择序列文件所在位置（2）打开原有的序列文件选择序列文件所在位置（2）打开原有的序列文件132在对话框中输入待扩增序列点击左上角的“Primer”按钮在对话框中输入待扩增序列1332.设置相关参数2.设置相关参数1343.得到的引物结果3.得到的引物结果135Hairpin:引物自身是否会形成发夹结构Dimer:同一种引物是否会形成二聚体Falseprimiring:引物在待扩增序列中其他位置是否有配对CrossDimer:正向与反向引物间是否会形成二聚体正向和反向引物的互换正向和反向引物的评价正向和反向引物的信息每点击左边红色的按钮，就出现相应的内容对正向和反向引物进行编辑Hairpin:引物自身是否会形成发夹结构正向和反向引物的136可对引物进行增加或减少碱基用键盘输入5个碱基可对引物进行用键盘输入5个碱基137引物的信息改动后引物的信息引物的信息改动后引物的信息138重新回到双引物的界面重新回到双引物的界面139“Edit”－“Copy”－“SensePrimer”5'CGCCTCGAGAAAAGACAGGACTCCACCTCA3'4.输出引物序列“Edit”－“Copy”－“SensePrimer”4.140引物纯度：公司合成引物常用的纯化方式C18脱盐、OPC纯化、PAGE纯化、HPLC纯化。普通PCR：OPC纯（>95%）较长引物（大于50个碱基）：PAGE纯（>95%）经过修饰或标记的引物：HPLC纯（>99%,但价格昂贵）引物浓度：0.1-0.5mol/L，浓度过高易导致模板与引物错配，反应特异性下降。引物纯度：公司合成引物常用的纯化方式C18脱盐、OPC纯化141

合成内容产量(OD)发货时间(工作日)纯化方式价格(￥)普通引物合成(<60base)23PAGE1.60/base2~53OPC1.30/base5~105PAGE2.20/base3OPC1.80/base205PAGE4.00/base3OPC3.20/base305PAGE5.80/base3OPC4.60/base506PAGE10.00/base4OPC8.00/base1007PAGE询价5OPC询价长链合成(60~90base)25PAGE3.50/base长链合成(90~120base)25PAGE5.00/base***生物科技有限公司的引物合成服务

合成内容产量(OD)发货时间(工作日)纯化方式价格(￥)142（3）耐热DNA聚合酶1）TaqDNA聚合酶（Taqpolymerase）：95℃的半寿期为40min最适温度（72℃）时每个酶分子每秒可催化合成150个核苷酸酶活性（受多种因素影响）：5’→3’方向的聚合酶活性，5’→3’方向的外切酶活性和逆转录酶活性，非模板依赖性活性，可在双链PCR产物每一条链的3‘端加上单核苷酸尾，使PCR产物的3’端突出一个单A核苷酸尾（3）耐热DNA聚合酶1）TaqDNA聚合酶（Taqpo143TthDNA聚合酶：在高温和MnCl2存在的条件下，能有效地逆转录RNA。用于一步法RT-PCR。VentDNA聚合酶：又称TliDNA聚合酶，该酶耐高温且具有3‘-5’外切酶活性的校对功能，其保真性较TaqDNA聚合酶高一倍。该酶扩增长片断（>12kb）的功能较强。PfuDNA聚合酶：具有3’→5’外切酶活性的校对功能，催化DNA合成的忠实性比Taq聚合酶高12倍，但不适于>2kb的片断扩增。2）其他的耐热聚合酶TthDNA聚合酶：在高温和MnCl2存在的条件下，能有效144（4）dNTPdNTP浓度取决于扩增片段的长度四种dNTP浓度应相等浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性。（4）dNTP145（5）Mg2+Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降；Mg2+过高影响反应特异性。Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。（5）Mg2+Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。1462）循环参数变性使双链DNA解链为单链95oC20-30秒(2)退火温度由引物长度和GC含量决定。增加温度能减少引物与模板的非特异性结合，降低温度可增加反应的灵敏性。2）循环参数147（3）延伸70-75oC，延伸时间由扩增片段长度决定（4）循环次数主要取决于模板DNA的浓度一般为25-35次次数过多：扩增效率降低，错误掺入率增加（3）延伸148二、PCR的衍生技术

逆转录PCR（reversetranscriptionPCR，RT-PCR）

反向PCR（inversePCR）

巢氏PCR（nestingPCR）

原位PCR（insituPCR）多重PCR（multiplexPCR）多重等位基因PCR（multiplexallelePCR）

不对称PCR（asymmertricPCR）

锚定PCR（anchoredPCR）

长片段PCR（longfragmentPCR）荧光定量PCR（fluorescentquantitativePCR）二、PCR的衍生技术149逆转录酶DNA聚合酶活性mRNAcDNA杂化双链PCR扩增1、逆转录PCR

(reversetranscription-PCR,RT-PCR)

逆转录酶DNA聚合酶活性mRNAcDNA杂化双链PCR扩增1150影响因素（1）模板对RT-PCR的影响对RNA制品的纯度和完整性要求都极为严格（2）逆转录酶对RT-PCR的影响MLV逆转录酶能合成大于2kb的较长cDNA，但对热的稳定性较AMV逆转录酶差。（3）逆转录引物对RT-PCR的影响随机引物：原核细胞多用oligo(dT)：真核细胞多用基因特异性的引物（GSP）：特异性强，广谱性低影响因素（1）模板对RT-PCR的影响151例子：S.pn的转化对PsaA基因mRNA表达的影响a、RNA的提取：野生型和转化缺陷型S.pn都诱导转化后，采用Qiagen试剂盒进行总RNA提取。b、cDNA的制备：取RNA2μl，随机引物1μl，DEPC水9μl，混匀后，70℃变性5min，立即置于冰上。然后顺序加入逆转录buffer5μl，dNTP1.5μl,RNasin0.5μl,DEPC水5μl,逆转录酶M-MLV1μl。混匀后于37℃，1小时，得到cDNA。c、PCR扩增:

PsaA的引物3μL，cDNA1μL，Tagplus酶0.2μL，共30μL体系。循环参数：94℃30秒，55℃40秒，72℃45秒，循环30次。用16srRNA的PCR产物为标准物，2%琼脂糖电泳。例子：S.pn的转化对PsaA基因mRNA表达的影响a、R152

电泳结果用软件Quantity-one3.2进行半定量比较，结果进行配对t检验分析16S(463bp)PsaA(254bp)图2，2号菌株及其转化缺陷菌株在加入CSP后的不同时间PsaAmRNA的表达。

1234567图1，2号菌株及其转化缺陷菌株在加入CSP后的不同时间PsaA的RT-PCR电泳图。line1:Marker2.line2-4:0min,10min,20minafterS.pneumoniaeNo.2wasaddedCSP.line5-7:0min,10min,20minafterS.pneumoniaeNo.2dwasaddedCSP.

***电泳结果用软件Quantity-one3.2进行半定量比1532、反向PCR(inversePCR)

用反向的引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。应用：（1）用于测序的DNA大片段的克隆（2）获得启动子序列（3）小质粒的定点突变（4）鉴定插入失活基因或体内诱导基因2、反向PCR(inversePCR)用反向的引物154已知序列未知序列未知序列限制酶限制酶连接酶反向PCR示意图已知序列未知序列未知序列限制酶限制酶连接酶反向PCR示意图155转化到大肠杆菌后，提取质粒，采用质粒引物即可直接对X片断进行扩增后测序，得到X基因序列信息。（10/64）EGFPXdw序列Xdw序列质粒引物质粒引物质粒引物例子：S.pn体内诱导基因序列的获得转化到大肠杆菌后，提取质粒，采用质粒引物即可直接对X片断进行1563、多重PCR(multiplexPCR)

用于检测特定基因序列的存在或缺失。电泳引物3、多重PCR(multiplexPCR)用于检测特定基157图1第1、2、3组引物多重PCR电泳图

1：正常对照；2：DL2000marker；3~10：检出的缺失型患者杜氏/贝克型肌营养不良症一种常见的致死性神经-肌肉系统的X连锁隐性遗传病，其基因突变中缺失最常见，约占55%~65%，缺失分布的位点较多，随地域及民族的差异而有不同特点图1第1、2、3组引1584、突变PCR（1）随机突变：应用：构建突变体文库，继而可从中筛选出具有特殊性质的突变个体策略：易错PCR（error-pronePCR）。利用TaqDNA聚合酶等耐热DNA聚合酶不具有3′→5′校对功能的特性，在PCR扩增反应中可能掺入错误的核苷酸，从而产生随机错误的扩增产物。加入次黄嘌呤核苷酸并限制某一种核苷酸的用量，从而促进DNA聚合酶选择其它3种核苷酸或次黄嘌呤核苷酸，导致扩增产物发生突变。4、突变PCR（1）随机突变：159（2）定点突变（1）5‘端引入突变：通过修饰上游引物的5’端，即可引入标记的碱基、限制性酶切位点、启动子序列等。（2）序列中的单位点突变：采用重叠延伸PCR(OverlapExtensionPCR，OEPCR)（2）定点突变（1）5‘端引入突变：通过修饰上游引物的5’160（A）为5‘端引入突变（B）为单碱基突变（A）为5‘端引入突变（B）为单碱基突变161例子：S.pn的ply146aa缺失的突变序列构建S.Pn的ply为一细胞毒性分子，其146位aa缺失后毒性大大减弱。构建突变体作为疫苗：首先设计4个引物：（M1和M2完全重叠）P1:5’-CGGGATCCATGGCAAATAAAGCAGTAAATG-3’BamHIP2:5’-CCGCTCGAGCAAGCATTCTCCTCTCCTAGTC-3’XhoIM1:5’-GGTCAATAATGTCCCAAGAATGCAGTATG-3’M2:5’-CATACTGCATTCTTGGGACATTATTGACC-3’例子：S.pn的ply146aa缺失的突变序列构建162突变位点M2M1P2P15’5’5’3’3’5’为酶切位点序列以基因组DNA为模板，以P1和M1为引物扩增出ply上游片断，以P2和M2为引物扩增出ply下游片断以上下游片断为模板，以P1和P2为引物，扩出全长酶切后克隆到质粒中保存突变位点M2M1P2P15’5’5’3’3’5’为酶切位点序163（3）多位点突变策略：多次重叠PCR关键：重叠引物的设计（每对突变引物需要部分重叠，方向相反）。（3）多位点突变策略：多次重叠PCR1645、原位PCR(InSituPCR)原位PCR是由Hasse等于1990年首创。它是利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段，在不破坏细胞的前提下，利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行PCR扩增，可进行细胞内定位。适用于检测病理切片中含量较少的靶序列。5、原位PCR(InSituPCR)原位PCR是165操作步骤1.细胞或组织固定：细胞经固定和乙醇通透化处理后便适于一般PCR试剂（包括引物和Taq酶）进入2.PCR扩增细胞内目的片段3.原位杂交检测扩增产物A.阳性对照B.阴性对照C.原位检测mRNA表达操作步骤A.阳性对照B.阴性对照C.原位检测mRNA表达166三、实时荧光PCR技术

通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程；结合相应的软件可以对结果进行分析，计算待测样品的初始模板量。三、实时荧光PCR技术通过荧光染料或荧光标记的特异167如何定量？Ct值的概念Ct值的定义：PCR扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的阈值所对应的循环次数。为什么要用Ct值定量实时荧光定量PCR方法利用循环阈值（Ct）的概念，在指数扩增的开始阶段进行检测，此时样品间的细小误差尚未放大，因此该Ct值具有极好的重复性。如何定量？Ct值的概念168C(t)值的重现性相同模板在同一台PCR仪上相同条件下重复96次扩增的扩增曲线图终点处检测产物量不恒定；C(t)值具重现性C(t)值的重现性相同模板在同一台PCR仪上相同条件下重复9169荧光强度循环数曲线初始模板量对数C(T)循环数标准曲线10410310610510210C(t)与初始模板含量初始模板量越多，C(t)值越小C(t)与初始模板浓度的对数值成线性关系荧光强度循环数曲线初始模板量对数C(T)循环数标170定量原理初始DNA量越多,荧光达到某一值（域值）时所需要的循环数越少（Ct值）Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数就可计算出样品中所含的模板量确定初始模板的浓度定量原理初始DNA量越多,荧光达到某一值（域值）时所需要1711、荧光定量PCR标记方法内掺式染料