实验四 细胞计数和大小测量课件

细胞计数和大小测量实验四一、实验目的1、学会血球计数板的使用方法。2、利用motic测量软件，测定细胞的大小。二、实验原理

1、细胞计数细胞计数法是细胞培养的一项基本技术。它是了解细胞生长状态、绘制生长曲线等的重要手段。在动物细胞原代与传代培养、细胞冷冻与复苏等众多技术中需要细胞计数；植物细胞和微生物进行悬浮培养也需测定细胞数目。（1）电子计数仪——库尔特原理“最开始的方法是对向下经过毛细管、通过一条光束的血细胞计数，就像统计正走下走廊的人们的人数一样。但我们没有获得非常好的感测信号，我们问自己这是为什么。除了调节光束的方法外，是否有其它方法由细胞的通过动作产生电脉冲信号？”尽管当时我们不知道答案，但血细胞是绝缘体–因此我们通过调节电流而不是调节光束，而获得了解决方案。

“在我们开始时，我们没有多少钱，我们在烟盒上取下的一张玻璃纸上，用加热的针刺了一个小孔。虽然这种小孔维持不了多久，但我们对一些细胞进行了计数。”刺有小孔的玻璃纸通过橡胶圈固定而覆盖在玻璃管的末端之上，并将连接在电源上的两个电极分开，悬浮在离子介质中的细胞流过刺有小孔的玻璃纸。一个细胞在此小孔中的液体排水量（等于其自身体积），与传导电流流经此小孔的两个电极之间的电压脉冲成正比。

库尔特兄弟发现，细胞和悬浮介质之间的电反差，是通过光电方法获得的反差的10倍，通过所产生的电压脉冲可非常容易地对流经小孔的悬浮液中的细胞进行准确计数。

计数器样品台的功能示意图。当管闩F打开时，压力计储液槽R中的水银被连接至P的小型真空泵抽吸，所产生的压力差会在管闩F关闭后使得水银柱J移动，使样品悬浮液E通过带孔圆片A从样品槽流入样品管B中。带孔圆片和样品管由介电材料制成，其电阻率比悬浮介质的电阻率要大得多。通过连接线H和I，电极C和D通过小孔将电流连接起来，且将所产生的信号脉冲送至放大器和脉冲计数器（没有显示）。需要分析的样品的体积由三个控制电极(K,L,M)测定，这三个电极穿过了压力计管的管壁；当流动的水银造成K和L之间有电接触时，脉冲计数器启动，而当水银与M接触时会使计数器停止工作（M与L之间的距离经过了校准）。只有当悬浮液以恒速流过小孔时才会对细胞进行计数，这样使得可测定细胞的浓度，因为悬浮液体积等于电极L和M之间的水银的体积。第二个管闩G只在下列情况下打开，即用清洁的悬浮介质通过O来填充或冲洗样品管时。观察小孔的显微镜没有显示。

到20世纪80年代后期，仅美国就有5万多种库尔特计数器在使用。描述其实际应用和理论设计的刊物现在数以千计，相关的专利也有好几百种。

2000年以后出品的Multisizer系列在工业、生物等各领域具有不可替代的地位。（2）血球计数板血球计数板是由一块比普通载玻片厚的特制玻片制成的。玻片中有四条下凹的槽，构成三个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽隔为两半，每半边上面个刻有一个方格网。计数池方格网上刻有9个大方格，大方格的长和宽各为1mm，深度为0.1mm，其体积为0.1mm3。中间的一个大方格为微生物计数室。1mm红在血球计数板上，刻有一些符号和数字其含义是：XB-K-25为计数板的型号和规格，表示此计数板分25个中格；0.1mm为盖上盖玻片后计数室的高；1/400mm2表示计数室面积是1mm2，分400个小格，每小格面积是1/400mm2。

中间计数室通常有两种规格：一种是16×25型：中间大方格内分为16中格，每一中格又分为25小格；另一种是25×16型：中间大方格内分为25中格，每一中格又分为16小格。不管计数室是哪一种构造；它们都有一个共同的特点，即每一大方格都是由16×25=25×16=400个小方格组成。25×16型的计数板一般计数四个角和中央的五个中方格（80个小方格）的细胞数。计数重复3次，取其平均值。计数完毕后，依下列公式计算：细胞个数／1mL=80个小方格细胞总数/80×400×10000×稀释倍数

16×25型的计数板四角：1、4、13、16四个中方格（100个小方格）计数。计数重复3次，取其平均值。计数完毕后，依下列公式计算：细胞个数／1mL=100个小方格细胞总数/100×400×10000×稀释倍数微生物小，用中间计数室来计数。细胞较大，一般用网格线四个角的四个大方格来计数。计数重复3次，取其平均值。计数完毕后，依下列公式计算：细胞个数／1mL=4个大方格细胞总数/4×10000×稀释倍数计数规则：1、计数时，只计数完整的细胞，若聚成一团的细胞则按一个细胞进行计数。2、由于划线部分也占有计数室的总面积，因此对压线细胞也应列入计数，为避免重复计数或漏计，一般遵循数上不数下，数左不数右的原则。3、2次重复计数误差不应超过±5%。2、细胞大小测量由于细胞一般都很小，只能在显微镜下来测量。常用于用于测量细胞大小的工具有目镜测微尺(目尺)和镜台测微尺(台尺)。以motic校准片配合motic显微数码互动系统中的测量软件，可方便的测定细胞的大小、面积等数据。显微测微尺显微测微尺是用来测量在显微镜下所观察到的物体的长度、面积的工具，包括镜台测微尺和目镜测微尺，两尺配合使用。

Motic校准片上面刻有4个黑点，直径分别是1.5mm0.6mm0.15mm0.07mm4倍镜10倍镜40倍镜100倍镜三、实验试剂和器材试剂：①4%甲醛溶液②四膜虫培养液器材：擦镜纸、盖玻片、显微镜、血球计数板、移液器、motic校准片、配套标本片1、将血球计数板置水平台面，把专用盖片在上面放好、放正。2、准确吸取200微升四膜虫培养物溶液，加入到装有200微升甲醛离心管中，充分混匀。3、吸取50微升的样品液置于盖玻片的边缘，使其在毛细作用下自然地吸入盖片与计数板之间的缝隙。在两侧的计数池中都加上样。多余的液体用吸水纸吸取。稍待片刻，使细胞全部沉降到血球计数室内。注意：加样量不要溢出盖玻片，也不要过少或带气泡！正四、实验操作

（1）四膜虫细胞计数血球计数板的使用观察并计数将血球计数板置于载物台上，打开显微镜光源，将孔径光栏调至最小，在4倍镜下先找到计数板上的网格，然后换10倍镜观察。分别计数4个大格中的细胞数，总和为S，重复3次操作。计数规则：1、计数时，只计数完整的细胞，若聚成一团的细胞则按一个细胞进行计数。2、由于划线部分也占有计数室的总面积，因此对压线细胞也应列入计数，为避免重复计数或漏计，一般遵循数上不数下，数左不数右的原则。3、二次重复计数误差不应超过±5%。血球计数板的清洁血球计数板使用后，弃盖玻片，先用自来水对着网格线处冲洗。用棉球或纱布蘸洗洁精清洁网格线，切勿用硬物洗刷，以防刮花玻璃面。再用自来水冲洗。洗后自行晾干或用吹风机吹干，或用95%乙醇、无水乙醇、丙酮等有机溶剂脱水使其干燥。干后通过镜检观察每小格内是否残留菌体或其他沉淀物。若不干净，则必须重复清洗直到干净为止。（2）细胞大小测量（以10倍镜为例）1、将motic校准片置于载物台上，以0.6mm黑点对准通光孔，物镜调至10倍镜下，调节旋钮至电脑屏幕上出现边缘清晰的黑色圆点。2、点击工具栏上“动态测量”，在屏幕左侧出现工作框。在“校准”下选择圆直径600，物镜倍数10×，然后点击框。校准3、取下校准片，换上待测标本。在10倍镜下调节清楚后，以动态测量工具中选择适当的工具，在屏幕上点击，便可测定细胞的直径或面积等数据。4、如在10倍镜下重新测量，选择工具栏中“清除全部项”，便可重新进行测量。5、若40倍镜下测量，应选择校准片中0.15mm的小黑点进行校准。其他步骤如10倍镜操作。注意：一次校准后，如更换不同的物镜，不影响具体的观察，但如进行测量的话，则应回到校准时物镜下测量细胞大小，否则应重新选择校准标准。细胞大小测量6、在一干净载玻片滴10微升四膜虫和4%甲醛溶液的混合液，涂布开，加盖玻片。在10倍镜下选10个四膜虫细胞，测量其长宽，并计算其平均值。（注意光线应适当调暗。）7、观察人血涂片，40倍镜下，任选20个红细胞，测量其直径，并计算出平均值。8、40倍镜下，测量20个嗜中性粒细胞的直径，计算出平均值。红细胞淋巴细胞单核细胞嗜中性粒细胞嗜酸性粒细胞嗜碱性粒细胞五、实验结果

统计四角4个大格中的细胞数，记为S。重复三次并取其平均值。计算：四膜虫原液中的细胞浓度=？（1）细胞计数计算四膜虫的长、宽度的平均数据计算红细胞的平均直径计算嗜中性粒细胞的平均直径（2）细胞大小测量六、注意事项细胞计数板一定要用棉花或纱布蘸洗洁精清洗，然后用自来水冲洗干净。晾干。七、实验报告

Introduction简述细胞计数仪和细胞计数板的原理。Materials&methods用自己的语言小结细胞计数板的操作方法。Results记录原始数据，计算四膜虫原液中四膜虫的密度。记录原始数据，计算两种血细胞的大小。Discussion讨论实验中进行细胞计数的注意事项。对该实验有何意见或建议？Questions

分析用细胞计数板对细胞计数时的误差来源。References简述染色体显带技术？有哪些带型分析？它们的原理是什么？试述Giemsa显带的原理。NextTopicRequirements：所有同学课余查找相关参考书和网页，准备以上问题。第4组同学相互讨论并做ppt准备，由1人在下次实验时做Presenta