淋巴细胞分离的实验方法

TheLianLab附录220101肝脏免疫学实验室淋巴细胞分离技术肝脏淋巴细胞分离1．小鼠摘眼球放血后，剪开颈动脉处死，摘取肝脏。2．将肝脏放在200目钢丝网上自边缘开始研磨，转至15ml离心管中。3．650rpm×1min离心，将上层液体转至15ml离心管中。4．1500prm×5min离心后弃上清，重复洗两次。5．6ml40%Percoll溶液重悬沉淀，将3ml70%Percoll溶液加于其底层，2000rpm×20min，升6降2。6．吸取两层Percoll溶液之间的白细胞层至15ml离心管中，加满PBS后2000rpm×5min离心收集细胞。7．1mlPBS重悬细胞后，吸取10ul细胞悬液，按照1：1的比例与台盼蓝混匀后计数。脾脏淋巴细胞分离1．小鼠摘眼球放血后剪开颈动脉处死，摘取脾脏。2．用载玻片的粗糙面将脾脏一点一点磨碎，将收集的研磨悬液通过200目尼龙网过滤至15ml离心管中，1500rpm×5min离心收集细胞。3．8mlPBS重悬细胞沉淀，在底层加入3mlFicoll,2000rpm×20min，升6降2。4．吸取两层溶液之间的白细胞层至15ml离心管，加满PBS后2000rpm×5min离心收集细胞。5．6-8mlPBS重悬细胞后，吸取10ul细胞悬液，按照1：1的比例与台盼蓝混匀后计数。胸腺淋巴细胞分离1．小鼠摘眼球放血后，剪开颈动脉处死，摘取胸腺。2．将胸腺放在200目钢丝网上研磨，将收集的研磨悬液通过尼龙网过滤至15ml离心管中，1500rpm×5min离心收集细胞。3．6-8mlPBS重悬细胞沉淀，再次通过200目尼龙网过滤后，吸取10ul细胞悬液，按照1：1的比例与台盼蓝混匀后计数。淋巴结淋巴细胞分离1．小鼠摘眼球放血后脱臼处死，摘取淋巴结。2．用载玻片的粗糙面将淋巴结磨碎，将收集的研磨悬液通过200目尼龙网过滤至15ml离心管中，1500rpm×5min离心收集细胞。3．6-8mlPBS（按照细胞团的大小凭经验确定）重悬细胞沉淀，通过200目尼龙网过滤后，吸取10ul细胞悬液，按照1：1的比例与台盼蓝混匀后计数。骨髓淋巴细胞分离1．小鼠摘眼球放血后，剪开颈动脉处死。TheLianLab附录2201012．将脚踝处皮肤剪开至大腿根部，暴露腿部肌肉，清理肌肉后将腿骨从大腿关节和脚踝处剪断，用纱布捏住腿骨，脚踝一端向上，剔除肌肉和软骨，将两段腿骨分开。3．用注射器将骨髓从腿骨较粗一头吹打出，将液体通过尼龙网过滤至15ml离心管中，1500rpm×5min离心收集细胞。4．8mlPBS重悬细胞沉淀，在底层加入3mlFicoll,2000rpm×20min，升6降2。5．吸取两层溶液之间的白细胞层至15ml离心管中，加满PBS后1260g×5min离心收集细胞。6．1mlPBS重悬细胞后，吸取10ul细胞悬液，按照1：1的比例与台盼蓝混匀后计数。第一版补充说明：✧这里的离心速度做了一些修改：本来700rpm应该对应99g，这里改为100g；本来2000rpm对应805g，这里下调到800g，这可以根据后来的需要修改；2500rpm一律对应为1260g。✧实验室的离心机型号为Eppendorf5810R，离心程序说明：ProgNO.1234Rcf100g800g1260g1260gTime1min5min20min5minUP~~↗6~DOWN~~↘2~✧Percoll原液（9V）加10×PBS（1V）配制为Percoll贮存液(StockPercoll)XPercoll10ml40%70%1×PBS(ml)63StockPercoll(ml)47第二版补充说明：✧这里的离心速度做了一些修改：这里的离心速度做了较大的修改，红色标注✧✧实验中离心程序的改变致力于解决肝脏细胞总是分离不到106的量级，选择小的离心速度取得了不错的效果。TheLianLab附录220101✧离心机的编程Programming:Storingafixedprogram(onlypossiblewhenthedeviceisatastandstill):Itispossibletosaveamaximumof35fixedprograms(1...9,A...Z)..Entertheprogramdatatobeusedfirstbypressingtheparameterkeysandthearrowkeysorusethedatafromthelastrun.The"atsetrpm"functionsandthesetdecelerationrampcanalsobesavedinaprogramifnecessary.Pressthekeytwice➔thefirstfreeprogramno.,indicatedby"P...",appearsinthedisplayandflashes.UseORtoselectthedesiredfreeprogramnumber(1...9,A...Z)canbeselected.Holddownthekeyfortwosecondsuntilappearsinthedisplay.ThepreviouslysetparametersofTemp.,Speed,Time,etc.arenowsavedasadataset.Ifparametersaremodifiedduringtherunwithafixedprogram,"0"appearsinthePROGfieldandtheuserexitsprogramwithoutitbeingmodified.Toexitthefixedprogram,callupprogram"0"ormodifytheparameters.✧选择已有的程序进行离心Presetprogram：Programscanonlybepreselectedwhenthedeviceisatastandstill.Pressthekeyonce➔theprogramno.thathasbeensetflashes.⏹⏹0indicatesdatafromlastrun.1...9,A...Zindicatefixedprograms.Usetoselectfurtherprogramnumbers.Returnstoprogram0orleavestheprogrammingmodewhenthelidisopen.Inordertostarttheselectedprogramimmediately,thecentrifugelidmustbeclosedpriortopressingthekey.✧对已有的程序进行删除操作Writeprotection：deletedwhilethelidisopenpriortorenewedassignmentofaprogramnumber.Pressthekeyonc