生物化学实验课件

生物化学实验PAGEPAGE8实验一二硝基水杨酸比色法测定总糖含量（4学时）一、实验目的（1）掌握二硝基水杨酸比色法测定总糖的原理。（2）学习分光光度计的使用方法。（3）掌握比色定糖法操作技术。二、实验原理在碱性条件下，还原糖与3，5-二硝基水杨酸共热，3，5-二硝基水杨酸被还原为3-氨基-5硝基水杨酸（棕红色物质），还原糖则被氧化成糖酸及其他产物，在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色深浅的程度成一定比例关系，在540nm波长下测定棕红色物质的吸光度，查对标准曲线并计算，便可分别求出样品中还原糖的含量。总糖可在强酸条件下水解，得到还原糖，从而间接求出样品中总糖的含量。三、实验仪器（1）刻度试管：25mL；（2）烧杯：100mL；（3）三角瓶：100mL；（4）容量瓶：100mL；（5）刻度吸管：1mL，2mL，10mL；（6）恒温水浴；（7）沸水浴；（8）离心机（过滤法不用此设备），离心管或玻璃漏斗，电子天平，分光光度计。四、实验试剂（1）1mg/mL葡萄糖标准液：准确称取0.250g分析纯葡萄糖（预先80℃烘至恒重），置于小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，定量转移到250mL容量瓶中，以蒸馏水定容至刻度，摇匀，冰箱中保存备用。（2）3，5-二硝基水杨酸试剂：将6.3g3，5-二硝基水杨酸和262mL2mol/L的NaOH溶液，加到500mL含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解。冷却后加蒸馏水定容至1000mL，贮于棕色瓶中备用。（3）碘-碘化钾溶液：称取5.0g碘、10.0g碘化钾，用蒸馏水溶解至100mL。（4）酚酞指示剂：称取0.1g酚酞溶于70%乙醇至250mL。（5）6mol/LHCl，6mol/LNaOH。（6）小麦淀粉，食用面粉。五、实验操作1．制作葡萄糖标准曲线取7支刻度试管，按下表操作。管号0123456葡萄糖标准液/mL00.81.01.2蒸馏水/mL2.01.210.83，5-二硝基水杨酸/mL1.5将各管内液体混匀，在100℃水浴中加热5min，取出冷却至27~30℃后以蒸馏水定容至25mL，将各管摇匀，将分光光度计调至540nm波长，用零号管调零，再读取1~6号管的吸光度，然后将读取的吸光度为纵坐标，葡萄糖mg数为横坐标，绘制出标准曲线。2．还原糖及总糖的待测液的制备（1）还原糖待测液的制备：取3.0g小麦淀粉，置于100mL三角瓶内，缓缓加入50mL蒸馏水，边注水边搅拌，直至均匀溶解，将溶液置于于50℃恒温水浴加热20min，离心机过滤5min，用20mL蒸馏水清洗残液，再用离心机过滤，然后将2次上清液集中于100mL容量瓶中，蒸馏水定容至刻度，混匀，作为还原糖待测液。（2）样品中总糖的水解和提取：准确称取1.0g食用面粉，放在100mL的三角瓶中，加入10mL6mol/LHCl及15mL蒸馏水，置于沸水浴中加热水解30min，取1~2滴水解液于白瓷板上，加1滴碘-碘化钾溶液，检查水解是否完全，如已经水解完全，则不显蓝色。待三角瓶中的水解液冷却后，加入1滴酚酞指示剂，以6mol/LNaOH中和至微红色，过滤，再用少量蒸馏水冲洗三角瓶及滤纸，将滤液全部收集在100mL的容量瓶中，以蒸馏水定容至刻度，混匀。精确取10mL定容过的水解液，移入另一个100mL的容量瓶，以水稀释定容，作为总糖待测液。（3）显色和比色，取4支25mL刻度试管，编号，按下表所示的量操作。管号还原糖测定管号总糖测定管号①②ⅠⅡ还原糖待测液/mL2200总糖待测液/mL0011蒸馏水/mL00113,5-二硝基水杨酸/mL1.5将各管内液体混匀，在沸水浴中加热5min，取出冷却至36℃，蒸馏水定容至25mL。将分光光度计调至540nm波长，以葡萄糖零号管调零，在分虽读取①、②、Ⅰ、Ⅱ4个管的吸光度。3．还原糖及总糖的测定以管①、②的吸光度平均值和管Ⅰ、Ⅱ的吸光度平均值，分别是在标准曲线上查出相应的还原糖毫克数，按下式计算出样品中还原糖和总糖的含量。六、结果处理（1）标准曲线制作与样品含糖量测定应同时进行，一起显色和比色。（2）用其他含糖材料，以试验材料比较其含糖量的差异。（3）小麦淀粉中含有何种糖？在提取总糖时，其他杂质是否会影响到测定？实验一二硝基水杨酸比色法测定总糖含量实验操作第一步省略，见板书还原糖待测液的制备选用漏斗，不用离心机显色和比色时，加一个空白，见板书实验二酶的生化基础实验（3学时）一、实验目的（1）加深对酶的性质的认识。（2）了解酶特性的实验原理。（3）掌握温度对酶活力的影响，pH对酶活性的影响，唾液酶活化和抑制的三个实验。（4）了解酶催化的高效性，特异性，进一步掌握酶的代谢反应及其调控机理。二、实验原理酶与一般催化剂最主要的区别之一是酶具有高度的特异（专一）性，即一种酶只能对一种或一类化合物起催化作用，例如，淀粉酶和蔗糖酶虽然都催化糖苷的水解，但是淀粉酶只对淀粉起作用，蔗糖酶只水解蔗糖，还原糖产物可用本乃狄试剂鉴定。通过比较淀粉酶在不同pH、不同温度以及有无抑制剂或者激活剂时水解淀粉的差异，说明这些环境因素对酶活性的影响。1．温度对酶活力的影响酶的催化作用受温度的影响，在最适温度下，酶的反应速度最高。大多数动物酶的最适温度为37~40℃，植物酶的最适温度为50~60℃。酶对温度的稳定性与其存在形式有关。有些酶的干燥制剂，即使加热到100℃，其活性并无明显改变，但在100℃的溶液中却很快地完全失去活性。低温能降低或抑制酶的活性，但不能推动酶活性。2．pH对酶活性的影响酶的活性受环境pH的影响极为显著，不同酶的最适应的pH不同，本实验观察pH对唾液淀粉酶活性的影响，唾液淀粉酶的最适pH约为6.8。3．唾液酶的活性和抑制酶的活性受活化剂或抑制剂的影响，氯离子为唾液淀粉酶的活化剂，铜离子为其抑制剂。三、实验仪器（1）分光光度计（722型或最新型），恒温水浴；（2）锥形瓶：50mL；（3）量筒：100mL；（4）漏斗：φ4cm；（5）温度计：0~100℃；（6）滴管；（7）吸量管：0.2mL，0.5mL，1mL，2mL，5mL；（8）试管：1.5cm×1.5cm。四、实验试剂（1）Fe粉；（2）ω(淀粉)=1%的溶液，用ω(NaCl)=0.3%的溶液配制；（3）ω(淀粉)=0.5%的溶液，用ω(NaCl)=0.3%的溶液配制；（4）唾液淀粉酶溶液：先用蒸馏水漱口，再含10mL左右蒸馏水轻轻漱动，数分钟后吐出，收集在烧杯中，过滤，得到清澈的唾液淀粉酶原液，稀释100~200倍，混匀备用；（5）碘化钾-碘溶液：将碘化钾20g及碘10g溶于100mL水中，使用前稀释10倍；（6）浓度为0.1mol/L柠檬酸溶液；（7）浓度为0.2mol/L磷酸氢二钠溶液；（8）pH试纸（pH=4.9~8）；（9）ω(氯化钠)=1%的溶液；（10）ω(CuSO4·5H2O)=1%的溶液；（11）ω(硫酸钠)=1%的溶液；（12）本乃狄（Benedict）试剂：17.3gCuSO4·5H2O加100mL蒸馏水加热溶解，冷却，173g柠檬酸钠和100gNa2CO3·2H2O，以600mL蒸馏水加热溶解，冷却后将CuSO4溶液慢慢倒入柠檬酸钠碳酸钠溶液中，边加边搅匀，最后定容至1000mL，过滤除去深沉；（13）ω(蔗糖)=2%的溶液：用分析纯蔗糖新配制；（14）磷酸缓冲液：A液（0.2mol/LNa2HPO4）：称取28.40gNa2HPO4溶于1000mL蒸馏水中；B液（0.1mol/L柠檬酸）：称取21.01g柠檬酸溶于1000mL蒸馏水中；（15）实验材料：马铃薯；（16）ω(H2O2)=2%。五、实验操作1．酶催化的高效性酶催化的高效性实验：取4支试管，按下表操作。操作项目管号1234ω(H2O2)=2%/mL3333生马铃薯小块/块2000熟马铃薯小块/块0200铁粉00小匙0现象解释实验现象2.酶催化的专一性蔗糖酶溶液的制取：取1g干酵母，放入研钵中，加少量石英砂和水研磨，加蒸馏水50mL，静置片刻，过滤即得。酶催化的专一性实验：取6支干净试管，按下表操作。操作项目管号123456ω(淀粉)=1%/mL110010ω(蔗糖)=2%/mL001101唾液淀粉酶原液/mL101000蔗糖酶溶液/mL010100蒸馏水000011酶促水解摇匀，37℃水浴中保温10min本乃狄试剂/mL222222反应摇匀，沸水浴中保温5~10min现象解释实验现象3．温度对酶活力的影响淀粉和可溶性淀粉遇碘呈蓝色，糊精按其分子的大小，遇碘可呈蓝色、紫色、暗褐色或红色。最简单的糊精遇碘不呈颜色，麦芽糖遇碘也不呈色，在不同温度下，淀粉被唾液淀粉酶水解的程度，可由水解混合物遇碘呈的颜色来判断。（1）温度对酶活力的影响1取3支试管，按下表操作。操作项目管号123唾液淀粉酶溶液/mL111pH=7.0磷酸缓冲液/mL222在一定温度下预处理5min0℃37℃70℃ω(淀粉）=1%的溶液/mL222摇匀，保持各自温度继续反应，数分钟后每隔半分钟从第2号管吸取1滴反应液于白瓷板上，用碘液检查反应进行情况，直至反应液不再变色（只有碘液的颜色），立即取出所有试管，流水冷却2min，各加1滴碘液，混匀，观察并记录各管反应现象。（2）温度对酶活力的影响2取3支试管，编号后按下表加入试剂。管号123淀粉溶液/mL稀释唾液/mL11－煮沸过的稀释唾液/mL－－1摇匀后，将1号和3号两个试管放入37℃恒温水浴中，2号试管放入冰水中，10min后取出，将2号试管内液体分为两半，用碘-碘化钾液来检验1、2、3号试管淀粉被唾液淀粉酶水解的程度，记录并解释结果。将2号管剩下的一半溶液放入37℃水浴中继续保温10min后，再用碘液实验，观察其现象及结果。4．pH对酶活力的影响取4个标有号码的50mL锥形瓶，用吸管按下表添加A液和B液并制备pH=5.0~8.0四种缓冲液。锥形瓶号A液/mLB液/mLpH15.154.855.026.053.955.837.722.286.849.720.288.0从4个锥形瓶中各取缓冲液3mL，分别注入4支带有号码的试管中，随后在每个试管中添加ω(淀粉)=1%的溶液1mL和稀释唾液2mL。向各试管中加入稀释唾液的时间间隔为1min，将试管中的内溶物混匀，并依次置于37℃水浴中保温。待向第4管加入唾液2mL后，每隔1min由第3管取出1滴混合液，置于白瓷板上，加1滴碘-碘化钾溶液，至混合液变为淡黄色后，向所有试管依次添加碘-碘化钾溶液溶液，添加碘-碘化钾溶液的时间间隔，从第1管起，亦为1min。观察各试管中物质呈现的颜色，分析pH对唾液淀粉酶活性的影响。5.酶的抑制与激活凡能增强酶的活性、加快酶促反应速度的物质，称为激活剂。激活剂种类很多，有①无机阳离子，如钠离子、钾离子、铜离子、钙离子等；②无机阴离子，如氯离子、溴离子、碘离子、硫酸盐离子磷酸盐离子等；③有机化合物，如维生素C、半胱氨酸、还原性谷胱甘肽等。凡能减弱、抑制甚至破坏酶活性的物质称为酶的抑制剂，士林它可降低酶促反应速度。酶的抑制剂有重金属离子、一氧化碳、硫化氢、氢氰酸、氟化物、碘化乙酸、生物碱、染料、对-氯汞苯甲酸、二异丙基氟磷酸、乙二胺四乙酸、表面活性剂等。酶的抑制与激活的实验可按下表操作。操作项目管号123ω(氯化钠)=1%的溶液/mL100ω(硫酸铜)=1%的溶液/mL010蒸馏水/mL001唾液淀粉酶溶液/mL111ω(淀粉)=1%的溶液/mL333保温反应并检查淀粉水解程度摇匀，37℃水浴反应1min左右即可用碘液检查1号试管淀粉水解程度，待1号试管的反应液不再变色时取出所有试管碘液/滴111现象6.唾液滴定酶的活化和抑制取4个标号试管，用吸管向4个试管中按下表添加各试剂。操作项目管号1234ω(淀粉)=1%的溶液/mL1.5稀释唾液/mL0.5ω(硫酸铜)=1%的溶液/mL0.5－－－ω(氯化钠)=1%的溶液/mL－0.5－－ω(硫酸钠）=1%的溶液/mL－－0.5－蒸馏水－－－0.537℃水浴中保温10min（注）碘化钾-碘溶液/滴2~32~32~32~3现象注：保温时间可根据唾液淀粉酶活力调整。解释结果，说明本实验第3管的意义。六、实验结果处理（1）酶的最适pH？最适温度？（2）说明底物浓度、酶浓度、温度与pH对酶促反应速度的影响？（3）酶有哪些催化特点？实验三蛋白质的沉淀反应（3学时）一、实验目的（1）熟悉蛋白质的沉淀反应。（2）进一步掌握蛋白质的有关性质。（3）掌握几种沉淀蛋白质的操作技术。二、实验原理多数蛋白质是亲水胶体，当其稳定因素被破坏或与某些试剂结合成不溶解的盐后，即产生沉淀。三、实验仪器（1）吸管瓶：500mL；（2）吸量管：5mL、2mL、1mL；（3）试管：1.5cm×15cm；（4）漏斗；（5）试管架；（6）滤纸。四、实验试剂（1）蛋白质试液：卵清蛋白质液；（2）硫酸铵晶体：如颗粒太大，最好研碎；（3）饱和硫酸铵溶液：蒸馏水100mL加硫酸铵至饱和；（4）(乙醇)=95%的溶液；（5）结晶氯化钠；（6）ω(乙酸铅)=1%的溶液：1g乙酸铅溶于蒸馏水并稀释至100mL；（7）ω(鞣酸)=5%的溶液：5g鞣酸溶于水并稀释至100mL；（8）ω(硫酸铜)=10%的溶液；（9）饱和苦味酸溶液；（10）(乙酸)=1%的溶液：冰乙酸1mL用蒸馏水稀释至100mL。五、实验操作1．蛋白质盐析作用向蛋白质溶液中加入中性盐至一定浓度，蛋白质即沉淀析出，这种作用称为盐析。（1）操作方法：①取蛋白质溶液5mL，加入等量饱和硫酸铵溶液（