ELISA的原理及分类课件

ELISA的原理及分类ELISA的原理及分类150年代的免疫荧光（IFA）和60年代的放射免疫(RIA)分析技术之后，在70年代初期又建立了用酶来标记抗原或抗体的分析技术。由于酶的高效生物催化作用，一个酶分子在数分钟内可以催化几十几百个底物分子发生反应，产生了放大作用，使得原来极其微乎其微的抗原或抗体在数分钟后就可被识别出来，这种技术被称为酶联免疫吸附试验法。现已成功地应用于多种病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断。50年代的免疫荧光（IFA）和60年代的放射免疫(RIA)分2ELISA的基本原理酶联免疫吸附试验（Enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA）概念：以酶作为标记指示物、以抗原抗体免疫反应为基础的固相吸附测定方法。三个方面：固相支持物包被的抗原或抗体酶标记的抗体或抗原和酶反应底物

ELISA的基本原理酶联免疫吸附试验31.抗原(antigen，Ag)

一个完整的抗原应包括两方面的免疫性能：①免疫原性(immunogenicity):诱导宿主产生免疫应答的能力，具有这种能力的物质称为免疫原(immunogen)；②免疫反应性(immunoreactivity):抗原与抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合的能力。2.抗原的基本理化特性——•大于Ab或者TCR的抗原结合部位 •无机物不能成为抗原；•分子量太小（如对氨基苯甲酸，DNP）的有机物不能成为抗原；•蛋白质是最主要、最常见的抗原；•多糖、脂肪、核苷酸等有机大分子能被B细胞和gd-T细胞所识别。

1.抗原(antigen，Ag)43.最大特性：免疫应答的特异性

某一特定抗原只能刺激机体产生针对该特定抗原的细胞和体液免疫应答；

某一特定抗原只能与其相应的特异抗体或致敏淋巴细胞产生结合反应。4.抗原抗体的结合:

实质上只发生在抗原的抗原决定簇与抗体的抗原结合位点之间。由抗原决定簇和抗体分子超变区之间空间结构的互补性决定的。

抗体分子N端可变区形成3nm×1.5nm×0.7nm的槽沟，只有与其空间结构互补的抗原决定簇才能如楔状嵌入。

由于两者在化学结构和空间构型上呈互补关系，所以抗原抗体反应具有高度的特异性。

3.最大特性：免疫应答的特异性

5抗体1抗体2抗体3抗体1抗体2抗体36例如：乙肝病毒中的HBsAg诱导机体的免疫应答产生只针对病毒表面抗原成分的抗体，HBeAg和HBcAg也可诱导机体产生相应的抗体，虽然这两种也来源于同一病毒，但表面抗原仅与其相应的抗体结合，而不与另外两种抗体反应。

抗原抗体反应的这种特异性使免疫测定能在非常复杂的蛋白质化合物（例如血清）中测定某一特定的物质，而不需先分离待检物。例如：乙肝病毒中的HBsAg诱导机体的免疫应答产生只针对病毒7但是这种特异性也不是绝对的。交叉反应(crossreaction)当两种不同的抗原物质具有部分相同或类似结构的抗原决定簇，则可与彼此相应的抗体反应，从而在抗原抗体反应中可出现交叉反应。

例如：绒毛膜促性腺激素（hCG）和黄体生成激素（LH）均由α和β两个亚单位组成，其结构的不同处在β亚单位，而两者的α亚单位是同类的。用hCG免疫动物所得的抗血清中含有抗α-hCG和抗β-hCG两种抗体，抗α-hCG抗体将与LH中的α酶位发生交叉反应。在临床检验中，如用抗hCG抗血清作为妊娠诊断试剂检定尿液中hCG，只能用于hCG浓度较高的试验，否则妇女生理性排泄入尿液中的微量LH将与之发生交叉反应。因此在作为早孕诊断（敏感度应达到50mIu/mlhCG）的实际中必须应用只对hCG特异的抗β-hCG，以避免与其它激素的交叉反应的发生。但是这种特异性也不是绝对的。81.用于免疫测定方法建立的抗原----ELISA方法纯化抗原：如HBsAg从体液，组织或病原体培养物等中采用物理化学方法：超速离心，过滤层析，电泳分离等分离获得。注：纯化抗原的纯度对相应的免疫测定方法的特异性有较大的影响合成抗原（多肽片段）如HCV缺乏完整的立体构型决定簇，导致抗体的漏检。基因工程抗原HBcAg,HBeAg和HCV早期：多为病原体的部分抗原，导致敏感性上缺陷。融合蛋白：对抗原的生物学和免疫学特性能最大程度的保留，工业化大量生产，没有提纯抗原存在的传染危险性。抗原分类1.用于免疫测定方法建立的抗原----ELISA方法抗原分类92.干扰免疫测定的抗原多为机体内源性抗原异嗜性抗原：不同种属的动物/植物和微生物细胞表面上的共同抗原，广泛的交叉性，故影响免疫测定的特异性。免疫球蛋白：免疫应答的产物￫抗体最常见的类风湿因子（RF），可于变性的IgG发生特异的结合，在ELISA引起非特异性反应。2.干扰免疫测定的抗原10抗体—分类在感染或疫苗接种以后，最先出现的抗体是IgM；血内含量低、半衰期短、出现早、消失快、组织穿透力弱，故其保护作用实际上常不如IgG。在抗原的反复刺激下，可通过Ig基因的类转换而转向IgG合成IgG是再次免疫应答的主要抗体；合成速度快、分解慢、半衰期长。可作保护性抗体。IgGIgAIgDIgMIgAIgE抗体—分类在感染或疫苗接种以后，最先出现的抗体是IgM；血内11制备抗体的发展技术：多克隆抗体：免疫动物后从血清中所得。抗原通常都有许多的抗原决定簇，所得抗体为针对这些所有抗原决定簇的抗体混合物。抗体的亲和力和特异性相对低于单克隆抗体。单克隆抗体：杂交瘤技术缺点：结合的单一性，产生假阴性混合单克隆抗体：杂交瘤技术双特异性单克隆抗体或多抗：杂交瘤技术基因工程抗体：基因工程技术制备抗体的发展技术：12测定中常用标记物，色原低物和终止液标记物1.辣根过氧化物酶（HRP）：国内试剂盒2.碱性磷酸酶（ALP）ALP为一种含锌的金属酶。注：在ELISA中洗涤缓冲液一般均为磷酸盐缓冲液生理盐水（PBS），含有相对高浓度的磷离子，对ALP有很强的抑制作用，洗板残留的PBS，足以抑制一半的酶活性。因此如标记的是ALP，则洗涤缓冲液不能用PBS液。国外全自动免疫分析仪多使用ALP3.Β-半乳糖苷酶：热稳定性差，少用。测定中常用标记物，色原低物和终止液标记物13HRP的色原底物--反应形式：氧化还原底物的氧化作用。—OPD（邻苯二胺）1.原理：在HRP的作用下，由过氧化氢（H2O2）氧化而聚合成2，2‘-二氨基偶氮苯（DAB）显色在pH5.0左右时，DAB在波长450nm处有广范围的最大吸收。2.由于不稳定性，在试剂盒中，OPD均以片剂或粉剂供应，临用前溶解。3.缺点：对机体具有致突变作用。

—TMB（四甲基联苯胺）

1.优于OPD2.原理：在HRP的作用下，由过氧化氢（H2O2）氧化合成联苯醌，在波长450nm处有最大消光系数。3.A液和B液：一种为TMB溶液，一种为一定浓度的过氧化氢溶液。4.如发现底物A和（或）B出现颜色，或二者各取一滴混合后显色，说明该试剂盒的底物溶液已变质或已受污染，必须废弃。HRP的色原底物--反应形式：氧化还原底物的氧化作用。—OP14显色和终止反应TMB（无色）

TMB阳离子根（蓝色）

联苯醌（黄色）

λmax=370和650nmλmax=450nmHRPHRP酸性显色和终止反应HRPHRP酸性15固相支持物及抗原抗体的固相化一般有聚苯乙烯、聚氯乙稀、硝酸纤维素膜等。多用聚苯乙烯塑料---好的光透性和蛋白吸附能力、易加工、价格低廉。1.聚苯乙烯的主链结构为碳链，侧链为非极性集团，表面成疏水性。2.抗体或抗原蛋白被动吸附于固相时，疏水键是其吸附于聚苯乙烯等疏水性固相表面的主要作用力。3.缺点：孔间变异较大，重复性差。改善ELISA测定的重复性：间接非共价吸附方法－－proteinA、抗IgG或链霉亲和素等作为中介物而吸附于固相上。共价吸附法－－化学交联试剂如戊二醛法，在其作用下抗体或抗原的活性基团与固相反应形成共价键而成。固相支持物及抗原抗体的固相化一般有聚16ELISA载体的形状主要有三种：微量滴定板、小珠和小试管。以微量滴定板最为常用，专用于EILSA的产品称为ELISA板，国际上标准的微量滴定板为8×12的96孔式。已有多种自动化仪器用于微量滴定板型的ELISA检测，包括加样、洗涤、保温、比色等步骤，对操作的标准化极为有利。聚苯乙烯经射线照射后，其吸附性能特别是对免疫球蛋白的吸附性能增加良好的ELISA板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之间、同一板各孔之间性能相近。ELISA载体的形状主要有三种：微量滴定板、小珠和小试管。以17ELISA基本原理1.抗原抗体反应在固相支持物上进行；2.反应结果的判断以酶与其底物作用后的显色或产生荧光或发光反应为准则；3.显色强度产生荧光或发光反应与临床标本中待测物的浓度成正比或反比关系。国内试剂盒均以酶的显色反应来完成测定。ELISA基本原理1.抗原抗体反应在固相支持物上进行；18酶学ELISA基本原理1.抗原或抗体的固相化抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，并保持其免疫学活性；2.抗原或抗体的酶标记抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性；

3.酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。酶学ELISA基本原理1.抗原或抗体的固相化19ELISA试剂盒包含以下各组分：

1.已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）；

2.酶标记的抗原或抗体（结合物）；

3.酶的底物；

4.阴性对照品和阳性对照品（定性测定中），参考标准品和控制血清（定量测定中）；

5.结合物及标本的稀释液；

6.洗涤液；

7.酶反应终止液。ELISA试剂盒包含以下各组分：20在测定时受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。在测定时21灵敏度和特异性由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。特异性：1.抗原与相应的抗体的结合具有高度特异性2.酶标记物与相应抗原或抗体结合具有高度特异性3.酶的催化具有高度特异性灵敏度和特异性由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结22临床ELISA测定的常用模式一、检测抗原：（1）双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。抗体的来源为多克隆抗体即抗血清时，包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物。应用单克隆抗体，一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗，分别用于包被固相载体和制备酶结合物。这种双位点夹心法具有很高的特异性。临床ELISA测定的常用模式一、检测抗原：23两步法双抗体夹心法测抗原酶标抗体固相抗体待测抗原EE温育洗板温育洗板温育两步法双抗体夹心法测抗原酶标抗体固相抗体待测抗原EE温育洗板24两步法中抗原抗体遵循下述规律1.Ab＋AgAb·Ag（复合物）2.Ab·Ag＋Ab*Ab·Ag·Ab*（复合物）两步法中抗原抗体遵循下述规律1.Ab＋Ag25随着待测抗原浓度的增加，显色程度也逐步加深，当抗原浓度增加到一定程度时，反应显色达到平台，不再加深，呈S形变化曲线吸光度抗原两步法ELISA抗原浓度与显色变化的反应曲线图吸光度抗原两步法ELISA抗原浓度与显色变化的反应曲线图26临床工作中多采用一步法将待测样本和酶标抗体同时加入，从而仅有一步温育和洗板过程，即为通常所说的“一步法”。EEE温育洗板温育固相抗体待测抗原酶标抗体临床工作中多采用一步法将待测样本和酶标抗体同时加入，从而仅有27一步法测定时结合形式Ab＋Ag＋Ab*Ab·Ag·Ab*---aAb·Ag---bAg·Ab*---cAb*·Ag·Ab*---d

a为最后测定结果的显色之源，当待测种抗原浓度增加时，无疑会使b，c和d复合物增加，从而消耗有限的Ab*，使a复合物相应减少，显色降低，吸光度对抗原浓度的变化曲线呈钟形。一步法测定时结合形式28钩状效应抗原浓度与显色变化的反应曲线为钟形曲线测定显色随着待测标本中抗原浓度的增加升高至一定程度后，测定吸光度即随抗原浓度的增加而开始下降直至不显色，出现假阴性结果。一步法抗原浓度与显色变化的反应曲线抗原吸光度钩状效应抗原浓度与显色变化的反应曲线为钟形曲线一步法抗原浓度29因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）时，应注意可测范围的最高值。用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应。如包被使用一种单抗，酶标记使用另一种单抗，同时充分混匀反应液，并适当延长反应温育时间，则可使b,c和d复合物减少至最低程度，大大减轻钩状效应。

因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质（例如血清30测定标本中HBeAg时

多克隆抗－HBe包被反应板

加入代测标本，同时加入单克隆抗－HBe－HRP

形成抗－HBe－HBeAg－抗－HBe－HRP复合物

加入TMB低物显色反应

测OD值测定标本中HBeAg时31测定HBsAg时：单克隆抗－HBs包被反应板加入待测标本，同时加入多克隆抗－HBs－HRP形成抗－HBs－HBsAg－抗HBs-HRP复合物加入TMB低物产生显色反应测OD值测定HBsAg时：32类风湿因子（RF）的干扰RF是一种自身抗体，多为IgM型，能和多种动物IgG的Fc段结合。用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有RF，它可充当抗原成份，同时与固相抗体和酶标抗体结合，表现出假阳性反应。类风湿因子（RF）的干扰RF是一种自身抗体，多为IgM型，能332.改良双抗体夹心法

特异性抗体a包被于固相载体洗涤加入含有欲测抗原之待检样品孵育洗涤再加一次未标记的特异性抗体b孵育洗涤再加酶标记抗b抗体，孵育洗涤加底物显色进行测定注：加入的抗体b于第一次包被于固相载体上的特异性抗体a对被测抗原来说都是特异性的，但不是用同种动物免疫制备的，否则可出现非特异性反应。2.改良双抗体夹心法34

这种方法与双抗体夹心法不同之处是多加了一层抗体。因此，放大的倍数更高，故比双抗体夹心法更加灵敏。同时避免标记特异性抗体，而另一优点是只要标记一种抗抗体，即可达到多种应用。这种方法与双抗体夹心法不同之处是多加了一层抗体。因此，353.竞争抑制法测抗原

适用于小分子抗原或半抗原测定如地高辛、茶碱等药物以及T3、T4及睾酮等激素，因其只有一个抗原决定簇，无法使用双抗体夹心法测定，只能采用竞争抑制法测定。原理：是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅。3.竞争抑制法测抗原适用于小分子抗原或半抗原测定36固相抗体EEE酶标抗原待测抗原E底物E显色反应（弱）固相抗体EEE酶标抗原底物显色反应（强）EEEEEE竞争法ELISA测小分子抗原固相抗体EEE酶标抗原待测抗原E底物E显色反应（弱）固相抗体37测定模式缺点：1.小分子酶结合物制备上不如抗体酶结合物简便2.纯化困难，结合小分子的酶与游离酶之间难分离。双抗体夹心竞争ELISA方法测定小分子抗原，测定的灵敏度和特异性均有所提高。测定模式缺点：38双抗体夹心竞争ELISA方法测定小分子抗原二或多聚体小分子待测抗原酶标抗体EEEE温育洗板温育双抗体夹心竞争ELISA方法测定小分子抗原二或多聚体小分子待39二、检测抗体间接法测抗体

间接法是检测抗体常用的方法。原理：利用酶标记的抗抗体（抗人免疫球蛋白抗体）以检测与固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法。目前应用最多的是抗HCV、抗HIV以及梅毒螺旋体抗体等检测。二、检测抗体间接法测抗体40酶标抗体固相抗原待测抗体EE间接法测抗体酶标抗体固相抗原待测抗体EE间接法测抗体41测定HCV抗体时包被合成多肽抗原和基因工程抗原（包括病毒结构区核心抗原和非结构区抗原)加入待测样本形成抗原抗体复合物加入酶结合物加入底物显色测OD值测定HCV抗体时包被合成多肽抗原和基因工程抗原（包括病毒结构42影响因素1.严格讲所测定的仅为抗体的IgG类，不涉及IgM和IgA类，这是有酶标二抗体决定的。2.间接法成功的关键在于抗原的纯度。一般为基因工程重组抗原，如HCV的NS3,NS4,NS5,HIV的GP41和GP120等。3另一种干扰因素为正常血清中所含的高浓度的非特异性IgG。病人血清中受检的特异性IgG只占总IgG中的一小部分。IgG的吸附性很强，非特异IgG可直接吸附到固相载体上，有时也可吸附到包被抗原的表面。在检测过程中标本须先行稀释，以避免过高的阴性本底影响结果的判断。

影响因素1.严格讲所测定的仅为抗体的IgG类，不涉及IgM和432.双抗原夹心法测抗体

反应模式与双抗体夹心法类似。原理：用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体。此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。乙肝标志物中抗HBs的检测常采用本法。2.双抗原夹心法测抗体反应模式与双抗体夹心法类似。44双抗原夹心法测抗体也可采用“一步法”。由于机体产生抗体IgG的滴度有限，因而不会产生“钩状效应”。固相抗原EE待测抗体酶标抗原温育洗板EE温育EE双抗原夹心法测抗体也可采用“一步法”。固相抗原EE待测抗体酶45测定HBsAb时采用纯化的HBsAg包被反应板加入待测标本，同时加入HBsAg-HRP形成HBsAg-抗－HBs-HBsAg-HRP复合物加入TMB低物显色测OD值测定HBsAb时463.竞争法测抗体

当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。标本中抗体量越多，结合在固相上的酶标抗体愈少，因此阳性反应呈色浅于阴性反应。如抗原为高纯度的，可直接包被固相。3.竞争法测抗体当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到47HBcAb的竞争法测定EE待测抗体酶标抗体温育洗板E温育E底物固相抗原HBcAb的竞争法测定EE待测抗体酶标抗体温育洗板E温育E底48竞争法测抗－HBe采用多克隆抗－HBe、基因工程重组HBeAg包被反应板，加入待测标本，同时加入单克隆抗－HBe-HRP，与抗原形成竞争结合，如待测标本中抗抗－Hbe含量高，则抗－HBe-HRP与HbeAg结合少，加入TMB显色时低物显色淡，反之显色深。竞争法测抗－HBe采用多克隆抗－HBe、基因工程重组HBeA49EE待测抗体酶标抗体温育洗板E温育E底物E竞争法测HBeAbEE待测抗体酶标抗体温育洗板E温育E底物E竞争法测HBeAb504.捕获包被法测抗体

如抗原中会有干扰物质，直接包被不易成功，可采用捕获包被法，即先包被与固相抗原相应的抗体，然后加入抗原，形成固相抗原。在临床检验中测定抗体IgM时多采用捕获包被法。原理：先用抗人IgM抗体包被固相，以捕获血清标本中的IgM（其中包括针对抗原的特异性IgM抗体和非特异性的IgM）。然后加入抗原，此抗原仅与特异性IgM相结合。继而加酶标记针对抗原的特异性抗体。再与底物作用，呈色即与标本中的IgM成正相关。此法常用于病毒性感染的早期诊断。急性甲型肝炎的诊断的血清抗-HAV的IgM检测、急性乙型肝炎病毒感染的血清抗HBcIgM检测和TORRCH系列的IgM检测等。4.捕获包被法测抗体如抗原中会有干扰物质，直接包被不易成51

抗人IgMμ链作为固相抗体加入待测标本IgM类抗体被固相捕获再加入特异抗原，与固相上捕获的IgM抗体结合加入酶标抗特异抗原的抗体加入底物显色测OD值抗人IgMμ链作52戌型肝炎病毒（HEV）IgM抗体检测

鼠抗人IgMμ链作为固相抗体

加入待测标本IgM类抗体固相捕获加入HRP标记的HEV抗原

形成包被二抗-IgM抗体-酶标抗原复合物加入底物显色测OD值戌型肝炎病毒（HEV）IgM抗体检测53甲型肝炎病毒（HAV）IgM抗体检测鼠抗人IgMμ链作为固相抗体

加入待测标本IgM类抗体固相捕获加入HRP标记的HAV抗原

形成包被二抗-IgM抗体-酶标抗原复合物加入底物显色测OD值甲型肝炎病毒（HAV）IgM抗体检测54

也有用间接法ELISA测IgM抗体如用抗原包被的间接法直接测定IgM抗体，因标本中一般同时存在较高浓度的IgG抗体，部分特异IgG抗体将与IgM抗体竞争与固相的抗原结合，干扰IgM抗体的检测。必须先将标本A蛋白或抗IgG抗体处理，以除去IgG的干扰。

55类风湿因子（RF，IgM类）及其他非特异性IgM的干扰1.RF由于能与固相的抗人μ链抗体结合，并可与随后加入的酶标抗体（动物IgG)反应，导致假阳性反应。

2.非特异性IgM在第一步温育中，可与特异性IgM竞争与固相抗体结合，所以影响测定的灵敏度。因此需对样本进行稀释。类风湿因子（RF，IgM类）及其他非特异性IgM的干扰56影响测定结果的标本因素标本采集可用作ELISA测定的标本十分广泛，体液（如血清）、分泌物（唾液）和排泄物（如尿液、粪便）等均可作标本以测定其中某种抗体或抗原成份。

医学检验中均以血清作为检测标本血清标本可按常规方法采集，应注意避免溶血，红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以HRP为标记的ELISA测定中，溶血标本可能会增加非特异性显色。

如有细菌污染，菌体中可能含有内源性HRP，也会产生假阳性反如在冰箱中保存过久，其中的可发生聚合，在间接法ELISA中可使本底加深。一般说来，在5天内测定的血清标本可放置于4℃，超过一周测定的需低温冰存。

影响测定结果的标本因素标本采集57冻结血清融解后，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混匀，宜轻缓，避免气泡，可上下颠倒混和，不要在混匀器上强烈振荡。混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤，澄清后再检测反复冻融会使抗体效价跌落，所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测，宜少量分装冰存。保存血清自采集时就应注意无菌操作冻结血清融解后，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混匀，宜轻缓582.试剂的准备从冰箱中拿出即用，有可能影响后面温育时间不够，导致对一些若阳性的标本的检测出现假阴性。洗板液稀释时所用的蒸馏水或去离子水应保证质量。ELISA的原理及分类课件593.加样

在ELISA中一般有3次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。加样时应将所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。加标本一般用微量加样器，按规定的量加入板孔中。每次加标本应更换吸嘴，以免发生交叉污染加酶结合物应用液和底物应用液时可用定量多道加液器，使加液过程迅速完成。此外，滴加的速度很重要，滴加太快，很容易出现重复滴加或加在两孔之间的现象，这样就会在孔内的非包被区出现非特异性吸附，从而引起非特异性显色，所以有时候这次测定为阳性，下次为阴性。3.加样在ELISA中一般有3次加样步聚，即加标本，加酶604.温育(incubation)

ELISA属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。以抗体包被的夹心法为例，加入板孔中的标本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗结合的机会，只有最贴近孔壁的一层溶液中的抗原直接与抗体接触。这是一个逐步平衡的过程，因此需经扩散才能达到反应的终点。在其后加入的酶标记抗体与固相抗原的结合也同样如此。这就是为什么ELISA反应总是需要一定时间的温育。保证在设定的温度下有足够的反应时间

4.温育(incubation)615.洗板

洗涤的方式：某些ELISA仪器配有特殊的自动洗涤仪手工操作手工操作：有浸泡式和流水冲洗式两种

（1）浸泡式过程如下：a.吸干或甩干孔内反应液；b.用洗涤液过洗一遍（将洗涤液注满板孔后，即甩去）；c.浸泡，即将洗涤液注满板孔，放置1-2分钟，间歇摇动，浸泡时间不可随意缩短；d.吸干孔内液体。吸干应彻底，可用水泵或真空泵抽吸，也可甩去液体后在清

洁毛巾或吸水纸上拍干；e.重复操作c和d，洗涤3-4次（或按说明规定）。在间接法中如本底较高，可增加洗涤次数或延长浸泡时间。

5.洗板62

（2）流水冲洗式流水冲洗法最初用于小珠载体的洗涤，洗涤液仅为蒸馏水甚至可用自来水。过程：洗涤时附接一特殊装置，使小珠在流水冲击下不断地滚动淋洗，持续冲洗2分钟后，吸干液体，再用蒸馏水浸泡2分钟，吸干即可。浸泡式犹如盆浴，流水冲洗式则好比淋浴，其洗涤效果更为彻底，且也简便、快速。已有实验表明，流水冲洗式同样也适用于微量滴定板的洗涤。洗涤时设法加大水流量或加大水压，让水流冲击板孔表面，洗涤效果更佳。（2）流水冲洗式流水冲洗法最初用于小珠载体的洗涤，洗涤液636.显色和比色显色是ELISA中的最后一步温育反应，此时酶催化无色的底物生成有色的产物。反应的温度和时间仍是影响显色的因素。在一定时间内，阴性孔可保持无色，而阳性孔则随时间的延长而呈色加强。适当提高温度有助于加速显色进行。在定量测定中，加入底物后的反应温度和时间应按规定力求准确。

6.显色和比色显色是ELISA中的最后一步温育反应，此时酶催64比色

比色前应先用洁净的吸水纸拭干板底附着的液体，然后将板正确放入酶标比色仪的比色架中。以软板为载体的试验，需先将板置于标准96孔的座架中，才可进行比色。比色时应先以蒸馏水校零点，测读底物孔（未经任何反应仅加底物液的孔）和空白孔（以生理盐水或稀释液代替标本作全过程的孔），以记录本次试验的试剂状况。其后可用空白孔以蒸馏水校零点，以上各孔的吸光度需减去空白孔的吸光度，然后进行计算。

比色

比色前应先用洁净的吸水纸拭干板底附着的液体，然后将65酶标比色仪酶标比色仪简称酶标仪，通常指专用于测读ELISA结果吸光度的光度计酶标仪不应安置在阳光或强光照射下，操作时室温宜在15~30℃，使用前先预热仪器

15-30分钟，测读结果更稳定。

酶标比色仪667.结果判断

定性测定在间接法和夹心法ELSIA中，阳性孔呈色深于阴性孔。在竞争法ELISA中则相反，阴性孔呈色深于阳性孔。7.结果判断67谢谢大家！谢谢大家！68ELISA的原理及分类ELISA的原理及分类6950年代的免疫荧光（IFA）和60年代的放射免疫(RIA)分析技术之后，在70年代初期又建立了用酶来标记抗原或抗体的分析技术。由于酶的高效生物催化作用，一个酶分子在数分钟内可以催化几十几百个底物分子发生反应，产生了放大作用，使得原来极其微乎其微的抗原或抗体在数分钟后就可被识别出来，这种技术被称为酶联免疫吸附试验法。现已成功地应用于多种病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断。50年代的免疫荧光（IFA）和60年代的放射免疫(RIA)分70ELISA的基本原理酶联免疫吸附试验（Enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA）概念：以酶作为标记指示物、以抗原抗体免疫反应为基础的固相吸附测定方法。三个方面：固相支持物包被的抗原或抗体酶标记的抗体或抗原和酶反应底物

ELISA的基本原理酶联免疫吸附试验711.抗原(antigen，Ag)

一个完整的抗原应包括两方面的免疫性能：①免疫原性(immunogenicity):诱导宿主产生免疫应答的能力，具有这种能力的物质称为免疫原(immunogen)；②免疫反应性(immunoreactivity):抗原与抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合的能力。2.抗原的基本理化特性——•大于Ab或者TCR的抗原结合部位 •无机物不能成为抗原；•分子量太小（如对氨基苯甲酸，DNP）的有机物不能成为抗原；•蛋白质是最主要、最常见的抗原；•多糖、脂肪、核苷酸等有机大分子能被B细胞和gd-T细胞所识别。

1.抗原(antigen，Ag)723.最大特性：免疫应答的特异性

某一特定抗原只能刺激机体产生针对该特定抗原的细胞和体液免疫应答；

某一特定抗原只能与其相应的特异抗体或致敏淋巴细胞产生结合反应。4.抗原抗体的结合:

实质上只发生在抗原的抗原决定簇与抗体的抗原结合位点之间。由抗原决定簇和抗体分子超变区之间空间结构的互补性决定的。

抗体分子N端可变区形成3nm×1.5nm×0.7nm的槽沟，只有与其空间结构互补的抗原决定簇才能如楔状嵌入。

由于两者在化学结构和空间构型上呈互补关系，所以抗原抗体反应具有高度的特异性。

3.最大特性：免疫应答的特异性

73抗体1抗体2抗体3抗体1抗体2抗体374例如：乙肝病毒中的HBsAg诱导机体的免疫应答产生只针对病毒表面抗原成分的抗体，HBeAg和HBcAg也可诱导机体产生相应的抗体，虽然这两种也来源于同一病毒，但表面抗原仅与其相应的抗体结合，而不与另外两种抗体反应。

抗原抗体反应的这种特异性使免疫测定能在非常复杂的蛋白质化合物（例如血清）中测定某一特定的物质，而不需先分离待检物。例如：乙肝病毒中的HBsAg诱导机体的免疫应答产生只针对病毒75但是这种特异性也不是绝对的。交叉反应(crossreaction)当两种不同的抗原物质具有部分相同或类似结构的抗原决定簇，则可与彼此相应的抗体反应，从而在抗原抗体反应中可出现交叉反应。

例如：绒毛膜促性腺激素（hCG）和黄体生成激素（LH）均由α和β两个亚单位组成，其结构的不同处在β亚单位，而两者的α亚单位是同类的。用hCG免疫动物所得的抗血清中含有抗α-hCG和抗β-hCG两种抗体，抗α-hCG抗体将与LH中的α酶位发生交叉反应。在临床检验中，如用抗hCG抗血清作为妊娠诊断试剂检定尿液中hCG，只能用于hCG浓度较高的试验，否则妇女生理性排泄入尿液中的微量LH将与之发生交叉反应。因此在作为早孕诊断（敏感度应达到50mIu/mlhCG）的实际中必须应用只对hCG特异的抗β-hCG，以避免与其它激素的交叉反应的发生。但是这种特异性也不是绝对的。761.用于免疫测定方法建立的抗原----ELISA方法纯化抗原：如HBsAg从体液，组织或病原体培养物等中采用物理化学方法：超速离心，过滤层析，电泳分离等分离获得。注：纯化抗原的纯度对相应的免疫测定方法的特异性有较大的影响合成抗原（多肽片段）如HCV缺乏完整的立体构型决定簇，导致抗体的漏检。基因工程抗原HBcAg,HBeAg和HCV早期：多为病原体的部分抗原，导致敏感性上缺陷。融合蛋白：对抗原的生物学和免疫学特性能最大程度的保留，工业化大量生产，没有提纯抗原存在的传染危险性。抗原分类1.用于免疫测定方法建立的抗原----ELISA方法抗原分类772.干扰免疫测定的抗原多为机体内源性抗原异嗜性抗原：不同种属的动物/植物和微生物细胞表面上的共同抗原，广泛的交叉性，故影响免疫测定的特异性。免疫球蛋白：免疫应答的产物￫抗体最常见的类风湿因子（RF），可于变性的IgG发生特异的结合，在ELISA引起非特异性反应。2.干扰免疫测定的抗原78抗体—分类在感染或疫苗接种以后，最先出现的抗体是IgM；血内含量低、半衰期短、出现早、消失快、组织穿透力弱，故其保护作用实际上常不如IgG。在抗原的反复刺激下，可通过Ig基因的类转换而转向IgG合成IgG是再次免疫应答的主要抗体；合成速度快、分解慢、半衰期长。可作保护性抗体。IgGIgAIgDIgMIgAIgE抗体—分类在感染或疫苗接种以后，最先出现的抗体是IgM；血内79制备抗体的发展技术：多克隆抗体：免疫动物后从血清中所得。抗原通常都有许多的抗原决定簇，所得抗体为针对这些所有抗原决定簇的抗体混合物。抗体的亲和力和特异性相对低于单克隆抗体。单克隆抗体：杂交瘤技术缺点：结合的单一性，产生假阴性混合单克隆抗体：杂交瘤技术双特异性单克隆抗体或多抗：杂交瘤技术基因工程抗体：基因工程技术制备抗体的发展技术：80测定中常用标记物，色原低物和终止液标记物1.辣根过氧化物酶（HRP）：国内试剂盒2.碱性磷酸酶（ALP）ALP为一种含锌的金属酶。注：在ELISA中洗涤缓冲液一般均为磷酸盐缓冲液生理盐水（PBS），含有相对高浓度的磷离子，对ALP有很强的抑制作用，洗板残留的PBS，足以抑制一半的酶活性。因此如标记的是ALP，则洗涤缓冲液不能用PBS液。国外全自动免疫分析仪多使用ALP3.Β-半乳糖苷酶：热稳定性差，少用。测定中常用标记物，色原低物和终止液标记物81HRP的色原底物--反应形式：氧化还原底物的氧化作用。—OPD（邻苯二胺）1.原理：在HRP的作用下，由过氧化氢（H2O2）氧化而聚合成2，2‘-二氨基偶氮苯（DAB）显色在pH5.0左右时，DAB在波长450nm处有广范围的最大吸收。2.由于不稳定性，在试剂盒中，OPD均以片剂或粉剂供应，临用前溶解。3.缺点：对机体具有致突变作用。

—TMB（四甲基联苯胺）

1.优于OPD2.原理：在HRP的作用下，由过氧化氢（H2O2）氧化合成联苯醌，在波长450nm处有最大消光系数。3.A液和B液：一种为TMB溶液，一种为一定浓度的过氧化氢溶液。4.如发现底物A和（或）B出现颜色，或二者各取一滴混合后显色，说明该试剂盒的底物溶液已变质或已受污染，必须废弃。HRP的色原底物--反应形式：氧化还原底物的氧化作用。—OP82显色和终止反应TMB（无色）

TMB阳离子根（蓝色）

联苯醌（黄色）

λmax=370和650nmλmax=450nmHRPHRP酸性显色和终止反应HRPHRP酸性83固相支持物及抗原抗体的固相化一般有聚苯乙烯、聚氯乙稀、硝酸纤维素膜等。多用聚苯乙烯塑料---好的光透性和蛋白吸附能力、易加工、价格低廉。1.聚苯乙烯的主链结构为碳链，侧链为非极性集团，表面成疏水性。2.抗体或抗原蛋白被动吸附于固相时，疏水键是其吸附于聚苯乙烯等疏水性固相表面的主要作用力。3.缺点：孔间变异较大，重复性差。改善ELISA测定的重复性：间接非共价吸附方法－－proteinA、抗IgG或链霉亲和素等作为中介物而吸附于固相上。共价吸附法－－化学交联试剂如戊二醛法，在其作用下抗体或抗原的活性基团与固相反应形成共价键而成。固相支持物及抗原抗体的固相化一般有聚84ELISA载体的形状主要有三种：微量滴定板、小珠和小试管。以微量滴定板最为常用，专用于EILSA的产品称为ELISA板，国际上标准的微量滴定板为8×12的96孔式。已有多种自动化仪器用于微量滴定板型的ELISA检测，包括加样、洗涤、保温、比色等步骤，对操作的标准化极为有利。聚苯乙烯经射线照射后，其吸附性能特别是对免疫球蛋白的吸附性能增加良好的ELISA板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之间、同一板各孔之间性能相近。ELISA载体的形状主要有三种：微量滴定板、小珠和小试管。以85ELISA基本原理1.抗原抗体反应在固相支持物上进行；2.反应结果的判断以酶与其底物作用后的显色或产生荧光或发光反应为准则；3.显色强度产生荧光或发光反应与临床标本中待测物的浓度成正比或反比关系。国内试剂盒均以酶的显色反应来完成测定。ELISA基本原理1.抗原抗体反应在固相支持物上进行；86酶学ELISA基本原理1.抗原或抗体的固相化抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，并保持其免疫学活性；2.抗原或抗体的酶标记抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性；

3.酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。酶学ELISA基本原理1.抗原或抗体的固相化87ELISA试剂盒包含以下各组分：

1.已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）；

2.酶标记的抗原或抗体（结合物）；

3.酶的底物；

4.阴性对照品和阳性对照品（定性测定中），参考标准品和控制血清（定量测定中）；

5.结合物及标本的稀释液；

6.洗涤液；

7.酶反应终止液。ELISA试剂盒包含以下各组分：88在测定时受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。在测定时89灵敏度和特异性由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。特异性：1.抗原与相应的抗体的结合具有高度特异性2.酶标记物与相应抗原或抗体结合具有高度特异性3.酶的催化具有高度特异性灵敏度和特异性由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结90临床ELISA测定的常用模式一、检测抗原：（1）双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。抗体的来源为多克隆抗体即抗血清时，包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物。应用单克隆抗体，一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗，分别用于包被固相载体和制备酶结合物。这种双位点夹心法具有很高的特异性。临床ELISA测定的常用模式一、检测抗原：91两步法双抗体夹心法测抗原酶标抗体固相抗体待测抗原EE温育洗板温育洗板温育两步法双抗体夹心法测抗原酶标抗体固相抗体待测抗原EE温育洗板92两步法中抗原抗体遵循下述规律1.Ab＋AgAb·Ag（复合物）2.Ab·Ag＋Ab*Ab·Ag·Ab*（复合物）两步法中抗原抗体遵循下述规律1.Ab＋Ag93随着待测抗原浓度的增加，显色程度也逐步加深，当抗原浓度增加到一定程度时，反应显色达到平台，不再加深，呈S形变化曲线吸光度抗原两步法ELISA抗原浓度与显色变化的反应曲线图吸光度抗原两步法ELISA抗原浓度与显色变化的反应曲线图94临床工作中多采用一步法将待测样本和酶标抗体同时加入，从而仅有一步温育和洗板过程，即为通常所说的“一步法”。EEE温育洗板温育固相抗体待测抗原酶标抗体临床工作中多采用一步法将待测样本和酶标抗体同时加入，从而仅有95一步法测定时结合形式Ab＋Ag＋Ab*Ab·Ag·Ab*---aAb·Ag---bAg·Ab*---cAb*·Ag·Ab*---d

a为最后测定结果的显色之源，当待测种抗原浓度增加时，无疑会使b，c和d复合物增加，从而消耗有限的Ab*，使a复合物相应减少，显色降低，吸光度对抗原浓度的变化曲线呈钟形。一步法测定时结合形式96钩状效应抗原浓度与显色变化的反应曲线为钟形曲线测定显色随着待测标本中抗原浓度的增加升高至一定程度后，测定吸光度即随抗原浓度的增加而开始下降直至不显色，出现假阴性结果。一步法抗原浓度与显色变化的反应曲线抗原吸光度钩状效应抗原浓度与显色变化的反应曲线为钟形曲线一步法抗原浓度97因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）时，应注意可测范围的最高值。用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应。如包被使用一种单抗，酶标记使用另一种单抗，同时充分混匀反应液，并适当延长反应温育时间，则可使b,c和d复合物减少至最低程度，大大减轻钩状效应。

因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质（例如血清98测定标本中HBeAg时

多克隆抗－HBe包被反应板

加入代测标本，同时加入单克隆抗－HBe－HRP

形成抗－HBe－HBeAg－抗－HBe－HRP复合物

加入TMB低物显色反应

测OD值测定标本中HBeAg时99测定HBsAg时：单克隆抗－HBs包被反应板加入待测标本，同时加入多克隆抗－HBs－HRP形成抗－HBs－HBsAg－抗HBs-HRP复合物加入TMB低物产生显色反应测OD值测定HBsAg时：100类风湿因子（RF）的干扰RF是一种自身抗体，多为IgM型，能和多种动物IgG的Fc段结合。用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有RF，它可充当抗原成份，同时与固相抗体和酶标抗体结合，表现出假阳性反应。类风湿因子（RF）的干扰RF是一种自身抗体，多为IgM型，能1012.改良双抗体夹心法

特异性抗体a包被于固相载体洗涤加入含有欲测抗原之待检样品孵育洗涤再加一次未标记的特异性抗体b孵育洗涤再加酶标记抗b抗体，孵育洗涤加底物显色进行测定注：加入的抗体b于第一次包被于固相载体上的特异性抗体a对被测抗原来说都是特异性的，但不是用同种动物免疫制备的，否则可出现非特异性反应。2.改良双抗体夹心法102

这种方法与双抗体夹心法不同之处是多加了一层抗体。因此，放大的倍数更高，故比双抗体夹心法更加灵敏。同时避免标记特异性抗体，而另一优点是只要标记一种抗抗体，即可达到多种应用。这种方法与双抗体夹心法不同之处是多加了一层抗体。因此，1033.竞争抑制法测抗原

适用于小分子抗原或半抗原测定如地高辛、茶碱等药物以及T3、T4及睾酮等激素，因其只有一个抗原决定簇，无法使用双抗体夹心法测定，只能采用竞争抑制法测定。原理：是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅。3.竞争抑制法测抗原适用于小分子抗原或半抗原测定104固相抗体EEE酶标抗原待测抗原E底物E显色反应（弱）固相抗体EEE酶标抗原底物显色反应（强）EEEEEE竞争法ELISA测小分子抗原固相抗体EEE酶标抗原待测抗原E底物E显色反应（弱）固相抗体105测定模式缺点：1.小分子酶结合物制备上不如抗体酶结合物简便2.纯化困难，结合小分子的酶与游离酶之间难分离。双抗体夹心竞争ELISA方法测定小分子抗原，测定的灵敏度和特异性均有所提高。测定模式缺点：106双抗体夹心竞争ELISA方法测定小分子抗原二或多聚体小分子待测抗原酶标抗体EEEE温育洗板温育双抗体夹心竞争ELISA方法测定小分子抗原二或多聚体小分子待107二、检测抗体间接法测抗体

间接法是检测抗体常用的方法。原理：利用酶标记的抗抗体（抗人免疫球蛋白抗体）以检测与固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法。目前应用最多的是抗HCV、抗HIV以及梅毒螺旋体抗体等检测。二、检测抗体间接法测抗体108酶标抗体固相抗原待测抗体EE间接法测抗体酶标抗体固相抗原待测抗体EE间接法测抗体109测定HCV抗体时包被合成多肽抗原和基因工程抗原（包括病毒结构区核心抗原和非结构区抗原)加入待测样本形成抗原抗体复合物加入酶结合物加入底物显色测OD值测定HCV抗体时包被合成多肽抗原和基因工程抗原（包括病毒结构110影响因素1.严格讲所测定的仅为抗体的IgG类，不涉及IgM和IgA类，这是有酶标二抗体决定的。2.间接法成功的关键在于抗原的纯度。一般为基因工程重组抗原，如HCV的NS3,NS4,NS5,HIV的GP41和GP120等。3另一种干扰因素为正常血清中所含的高浓度的非特异性IgG。病人血清中受检的特异性IgG只占总IgG中的一小部分。IgG的吸附性很强，非特异IgG可直接吸附到固相载体上，有时也可吸附到包被抗原的表面。在检测过程中标本须先行稀释，以避免过高的阴性本底影响结果的判断。

影响因素1.严格讲所测定的仅为抗体的IgG类，不涉及IgM和1112.双抗原夹心法测抗体

反应模式与双抗体夹心法类似。原理：用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体。此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。乙肝标志物中抗HBs的检测常采用本法。2.双抗原夹心法测抗体反应模式与双抗体夹心法类似。112双抗原夹心法测抗体也可采用“一步法”。由于机体产生抗体IgG的滴度有限，因而不会产生“钩状效应”。固相抗原EE待测抗体酶标抗原温育洗板EE温育EE双抗原夹心法测抗体也可采用“一步法”。固相抗原EE待测抗体酶113测定HBsAb时采用纯化的HBsAg包被反应板加入待测标本，同时加入HBsAg-HRP形成HBsAg-抗－HBs-HBsAg-HRP复合物加入TMB低物显色测OD值测定HBsAb时1143.竞争法测抗体

当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。标本中抗体量越多，结合在固相上的酶标抗体愈少，因此阳性反应呈色浅于阴性反应。如抗原为高纯度的，可直接包被固相。3.竞争法测抗体当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到115HBcAb的竞争法测定EE待测抗体酶标抗体温育洗板E温育E底物固相抗原HBcAb的竞争法测定EE待测抗体酶标抗体温育洗板E温育E底116竞争法测抗－HBe采用多克隆抗－HBe、基因工程重组HBeAg包被反应板，加入待测标本，同时加入单克隆抗－HBe-HRP，与抗原形成竞争结合，如待测标本中抗抗－Hbe含量高，则抗－HBe-HRP与HbeAg结合少，加入TMB显色时低物显色淡，反之显色深。竞争法测抗－HBe采用多克隆抗－HBe、基因工程重组HBeA117EE待测抗体酶标抗体温育洗板E温育E底物E竞争法测HBeAbEE待测抗体酶标抗体温育洗板E温育E底物E竞争法测HBeAb1184.捕获包被法测抗体

如抗原中会有干扰物质，直接包被不易成功，可采用捕获包被法，即先包被与固相抗原相应的抗体，然后加入抗原，形成固相抗原。在临床检验中测定抗体IgM时多采用捕获包被法。原理：先用抗人IgM抗体包被固相，以捕获血清标本中的IgM（其中包括针对抗原的特异性IgM抗体和非特异性的IgM）。然后加入抗原，此抗原仅与特异性IgM相结合。继而加酶标记针对抗原的特异性抗体。再与底物作用，呈色即与标本中的IgM成正相关。此法常用于病毒性感染的早期诊断。急性甲型肝炎的诊断的血清抗-HAV的IgM检测、急性乙型肝炎病毒感染的血清抗HBcIgM检测和TORRCH系列的IgM检测等。4.捕获包被法测抗体如抗原中会有干扰物质，直接包被不易成119

抗人IgMμ链作为固相抗体加入待测标本IgM类抗体被固相捕获再加入特异抗原，与固相上捕获的IgM抗体结合加入酶标抗特异抗原的抗体加入底物显色测OD值抗人IgMμ链作120戌型肝炎病毒（HEV）IgM抗体检测

鼠抗人IgMμ链作为固相抗体

加入待测标本IgM类抗体固相捕获加入HRP标记的HEV抗原

形成包被二抗-IgM抗体-酶标抗原复合物加入底物显色测OD值戌型肝炎病毒（HEV）IgM抗体检测121甲型肝炎病毒（HAV）IgM抗体检测鼠抗人IgMμ链作为固相抗体

加入待测标本IgM类抗体固相捕获加入HRP标记的HAV抗原