蛋白质的十种提取方法

蛋白质的十种提取方法.txt大人物的悲哀在于他们需要不停地做出选择；而小人物的悲哀在于他们从来没有选择的机会。男人因沧桑而成熟，女人因成熟而沧桑。男人有了烟，有了酒，也就有了故事；女人有了钱，有了资色，也就有了悲剧。蛋白质提取方法列举10种方法[来源：绿谷生物网点击数：4587更新时间：2008年05月30日][收藏本文]一、植物组织蛋白质提取方法（summer）1、根据样品重量（1g样品加入3.5ml提取液，可根据材料不同适当加入），准备提取液放在冰上。2、把样品放在研钵中用液氮研磨，研磨后加入提取液中在冰上静置（3-4小时）。3、用离心机离心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃4、提取上清夜，样品制备完成。蛋白质提取液：300ml1、1Mtris-HCl（PH8）45ml2、甘油（Glycerol）75ml3、聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpolypyrrordone）6g这种方法针对SDS，垂直板电泳！二、植物组织蛋白质提取方法(summer)三氯醋酸—丙酮沉淀法1、在液氮中研磨叶片2、加入样品体积3倍的提取液在-20℃的条件下过夜，然后离心（4℃8000rpm以上1小时）弃上清。3、加入等体积的冰浴丙酮（含0.07%的β-巯基乙醇），摇匀后离心（4℃8000rpm以上1小时），然后真空干燥沉淀，备用。4、上样前加入裂解液，室温放置30分钟，使蛋白充分溶于裂解液中，然后离心（15℃8000rpm以上1小时或更长时间以没有沉淀为标准），可临时保存在4℃待用。5、用Brandford法定量蛋白，然后可分装放入-80℃备用。药品：提取液：含10%TCA和0.07%的β-巯基乙醇的丙酮裂解液：2.7g尿素0.2gCHAPS溶于3ml灭菌的去离子水中（终体积为5ml），使用前再加入1M的DTT65ul/ml。这种方法针对双向电泳，杂质少，离子浓度小的特点！当然单向电泳也同样适用，只是电泳的条带会减少！三、组织：肠黏膜（newinbio）目的：WESTERNBLOT检测凋亡相关蛋白的表达应用TRIPURE提取蛋白质步骤：含蛋白质上清液中加入异丙醇：（1.5ml每1mlTRIPURE用量）倒转混匀，置室温10min离心：12000g，10min，4度，弃上清加入0.3M盐酸胍/95％乙醇：（2ml每1mlTRIPURE用量）振荡，置室温20min离心：7500g，5min，4度，弃上清重复0.3M盐酸胍/95％乙醇步2次沉淀中加入100％乙醇2ml充分振荡混匀，置室温20min离心：7500g，5min，4度，弃上清吹干沉淀1％SDS溶解沉淀离心：10000g，10min，4度取上清-20度保存（或可直接用于WESTERNBLOT）存在的问题：加入1％SDS后沉淀不溶解，还是很大的一块，4度离心后又多了白色沉定，SDS结晶？测浓度，含量才1mg/ml左右。解决：提蛋白试剂盒，另外组织大小适中，要碎，立即加2XBUFFER，然后煮5－10分钟，效果很好的。四、lysissolution:（yog）Proteinextractionbuffer(Camiolobuffer):100ml=(0.075MPotassiumAcetate)0.736g(0.3M)NaCl1.753g(0.1M)L-argininebasicsalt1.742g(0.01M)EDTA-HCl0.292g(0.25%)TritonX-100250.ulupto100mlwithdH20.pH7.4.Then0.2umfilter.1.Freezetissueinliquidnitrogen.2.RinseinPBSthenmince.3.Add1mlCamioloextractionbufferper100mgoftissue.4.Homogenizefor1minuteat4\'C.5.Spinat3,000.rpm/15minutes/4\'C.6.Removesupernatantandsaveinanothertube.7.Ifnecessary,dializethesupernatantagainstPBSwith50mM/LTris-HClpH7.4.五、植物材料：水稻苗，叶鞘，根（ynibcas）1、200毫克样品置于冰上磨碎2、加lysisbuffer，离心，10000rpm，4度，5min取上清3、重复离心5minlysisbuffer：ureanp-40ampholine2-mepvp-40六、蛋白质样品制备（sigma）秧苗蛋白质样品的提取按Davermal等（1986）的方法进行。100mg材料剪碎后加入10mgPVP-40(聚乙烯吡咯烷酮)及少量石英砂，用液氮研磨成粉，加入1.5ml10%三氯乙酸（丙酮配制，含10mM即0.07%β-巯基乙醇），混匀，-20℃沉淀1小时，4℃，15000r/min离心15min，弃上清，沉淀复溶于1.5ml冷丙酮(含10mMβ-巯基乙醇)，再于-20℃沉淀1小时，同上离心弃上清，（有必要再用80％丙酮(含10mMβ-巯基乙醇所得沉淀低温冷冻真空抽干。按每mg干粉加入20μl（可调）UKS液[9.5M尿素，5mM碳酸钾，1.25%SDS，0.5%DTT(二硫苏糖醇)，2%Ampholine(AmershamPharmaciaBiotechInc，pH3.5-10)，6%TritonX-100]，37℃温育30min，期间搅动几次，28度（温度低，高浓度的尿素会让溶液结冰）16000r/min离心15min，离心力越大时间长一点越好！上清即可上样电泳。或者-70度保存七、植物根中蛋白质的抽取（phenol）(1)sample,液氮研磨(2)装1.5mlcentrifuge用tube(3)加1MKH2PO4+K2HPO4700ul(4)12000rpm,4度,10-15minite(5)取上层液，蛋白质就在里面八、SDSextractionfollowedbyacetoneprecipitation–simpleextractionprotocolthatdoesnotrequirephenol.Recommendedstartprotocolforwholetissueextractions.（hgp）1.Grind1goffreshtissuetoapowderwithliquidnitrogeninamortarandpestle.2.Add5mLofextractionmedia(0.175MTris-HCl,pH8.8,5%SDS,15%glycerol,0.3MDTT)directlytomortarandcontinuegrindingforanadditional30sec.3.Filterhomogenatethroughtwolayersofmiraclothintoa50mLFalcontubeatroomtemperature.4.Immediatelyadd4volumesoficecold100%acetonetofilteredhomogenate,mixbyvortexingandplaceat-20Cforatleastonehourtoprecipitateproteins.5.Centrifugeat5000gfor15mintocollectprecipitatedprotein,decantsupernatant.6.GentlyblotresidualacetonefromcontainerwithKimwipeandthenwashpelletin15-20mLofcold80%acetone.Besuretothoroughlybreak-uppelletbypipetting,vortexingorsonication.7.Repeatsteps5and6.8.Collectfinalproteinprecipitatebycentrifugationat5000gfor15minanddrypelletbyinvertingonKimwipefor15minat37C.9.Resuspendfinalpelletin0.5-1mLofIEFextractionsolution(8Murea,2Mthiourea,2%CHAPS,2%TritonX-100,50mMDTT,0.2%pH3-10ampholytes)bypipettingandvortexingat25-30C.Incubatesamplefor1hatroomtemperaturewithagitation.Donotheatsampleunderanycircumstancesasthiswillleadtocarbamylationofproteins.10.Centrifugefor10minat12000gandusesupernatanttorehydrateIPGstrips.11.Ifproteinquantitationisnecessary,precipitateproteinsamplewithTCAoracetonepriortoperformingBradfordorLowryassayasdetergentsandreducingagentsinterferewiththeseassays.Phenolextractionfollowedbymethanolicammoniumacetateprecipitation–aneffectiveprotocolforsamplepreparationfromprotein-poor,recalcitranttissuessuchasplants(seeHurkmanandTanaka,1986,PlantPhysiology81:802-80九、材料：细菌蛋白（puc18）用甲醇提取的，冻干后用缓冲液溶解的。样品缓冲液是一般的。其中含又2%的SDS，20mmol的2-巯基乙醇。十、线粒体蛋白的提取(bioon)IsolationforMitochondriaModificationbyBioonMaterialsandreagents:homogenizingbuffer:100mMmannitol10mMTris-HClbuffer(pH7.5)5mMMgCl2关于蛋白质1mMEGTA1mMDTTleupeptin(0.1ug/ml)0.1MNa2CO3Methods:-10*6Cellswerewashedwithice-coldPBSandlysedbyhomogenizingin1mlbuffer(ice-cold)containing100mMmannitol,10mMTris,5mMMgCl2,1mMEGTA,1mMDTT,leupeptin(0.1ug/ml)-SubjectedtoPolytronhomogenizationforthree-fourburstsof3-10seachatasettingof6.5.-Intactcellsandnucleiwereseparatedbycentrifugationat120gfor5minat4℃-Supernatantswerecentrifugedat10,000gfor10mintocollecttheheavy(mitochondrial)membranepellet.-Cytoplasmicfractionswereobtainedbycentrifugingsupernatantsat100,000gfor30min.-Resuspendedpelletto0.25mg/mlinfreshpreparationof0.1MNa2CO3(pH11.5)-Incubatedonicefor30min.-Ultracentrifugationat100000gfor1hat4℃toprecipitatethemitochondriamembraneprotein.Andthesupernatantsaremitochondrialmatrix.0.5mgofproteinsinmitochondriacanget100ugofproteins(thealkali-resistantfractions)Ref.:PNAS,2002，99：12825–12830本方法只适用于提大鼠细胞线粒体蛋白，而不适用于线粒体功能检测

考马斯亮蓝染色一产品简介：本考马斯亮蓝染色试剂盒Staining采用了最经典的考马斯亮蓝染色和脱色方法，以考马斯亮蓝为染料，或非变性等蛋白电泳凝胶的常规染色和脱色，或胶上残余蛋白的检测。使用本试剂盒，采用常规染色脱色方法累计时间达到2-3小时后可以观察到蛋白条带；采用快速染色脱色方法20分钟左右即可观察到蛋白条带。观察到最清晰的蛋白条带则需染色脱色更长时间。本试剂盒中的染色液和脱色液经过改良，不含有毒的甲醇，但含有刺激性气味的乙酸。二保存条件：室温保存，至少一年有效。注意事项：可以使用枪头盒或适当大小的培养皿作为染色和脱色的容器。本染色液呈酸性，有轻微腐蚀性，使用时请作必要防护。为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。三使用说明：1.常规染色脱色方法：a.电泳结束后，取凝胶放入适量考马斯亮蓝染色液中，确保染色液可以充分覆盖凝胶。b.置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动，1小时或更长时间。注：具体的染色时间取决于凝胶的厚度和染色时的温度。凝胶较厚，温度较低，则染色时间宜适当延长。凝胶较薄，温度较高，则染色时间可以适当缩短。通常染色至凝胶的颜色和染个小时或更长时间不会对最终的染色效果产生负面影响。c.2-3次。d.加入适量考马斯亮蓝染色脱色液，确保脱色液可以充分覆盖凝胶。e.置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动，室温脱色4-24小时。期间更换脱色液2-4次，直至蓝色背景基本上全部被脱去，并且蛋白条带染色效果达到预期。通常蛋白条带在脱色1-2小时后即可出现。注：脱色期间可以在脱色液中加入一片吸水纸，可以使部分染料吸附在吸水纸上，加快脱色。脱色时间过长也会导致蛋白条带的颜色变浅。f．凝胶保存在水涨。如需避免溶涨，可以把胶保存在含20%甘油的水中。长期保存可以制备干胶。2.快速染色脱色方法：a.电泳结束后，取胶放入适量考马斯亮蓝染色液中，微波炉加热至接近沸腾或刚刚沸腾，立即停止加热。通常对于胶浓度大于10％的胶比较坚韧，在发生煮沸时不易破损；对于胶浓度小于10%的胶，宜尽量避免煮沸，以免出现胶碎裂的情况。b.随后在分钟。c.2-3次。d.加入适量考马斯亮蓝染色脱色液，确保染色液可以充分覆盖凝胶。e.微波炉加热至接近沸腾或刚刚沸腾，立即停止加热。随后在脱色液温度较