色谱柱分类与选择-内部培训讲义资料课件

一、色谱起源石油醚碳酸钙颗粒色素色谱组分1906年俄国植物学家Tsweet发现色谱分离现象一、色谱起源石油醚碳酸钙颗粒色素色谱组分1906年俄国植物12高效液相色谱仪的分析原理高效液相色谱仪的结构色谱柱在高效液相色谱仪中的作用和峰形产生原理高压泵进样器检测器色谱工作站色谱柱2高效液相色谱仪的分析原理高效液相色谱仪的结构高压泵进样器检21Basicprincipleofchromatographicseparation1.1色谱分离基本原理PartitioncoefficientK分配系数1Basicprincipleofchromatog3硅胶颗粒基质合成步骤：1.合成硅胶基质2.键合配体(键合相)3.端基封尾end-capped硅胶颗粒基质合成步骤：4以传统方式制造硅胶色谱填料的过程:

起始原料为矿物硅酸盐（如泡花碱），即A类硅胶90年代以后方式：organosilicapolymer有机单晶硅聚合的硅胶，即B类硅胶以传统方式制造硅胶色谱填料的过程:

起始原料为矿物硅酸盐（5色谱柱分类与选择-内部培训讲义资料课件6填料的端基封尾–封口残余硅羟基–减少不可逆吸附或拖尾–增加碳含量（0.1%-1%）C18键合并端基封尾后还能看见什么？硅羟基!—即使进行高密度键合，硅胶表面仍将残留约50%硅羟基(SiOH)!填料的端基封尾C18键合并端基封尾后7单、双、三官能团键合三官能团键合二官能团键合单官能团键合单、双、三官能团键合三官能团键合二官能团键合单官能团键合8键合键合9常用封尾end-capped：三甲基硅氧烷极性封尾，增加极性保留HypersilODS即没有封尾HypersilODS-2有封尾由于空间位阻的存在，键合反应最多只能覆盖50%的硅羟基，超过一半硅羟基是活性硅羟基，与碱性基团会发生离子交换作用，增加了保留，导致峰形拖尾，用短链氯硅烷（如三甲基氯硅烷）键合活性的硅羟基，可以减小这种影响，这种操作被称为封尾，封端，封口。封尾常用封尾end-capped：三甲基硅氧烷极性封尾，增加极10封尾封尾11空间位阻：异丙基硅氧烷，异丁基硅氧烷空间位阻：异丙基硅氧烷，异丁基硅氧烷12空间位阻空间位阻13极性嵌入polarembedded极性嵌入polarembedded14问题：下列色谱柱如何选择？amidohexadecylsilylsilicagelColumn:

—size:l=0.25m,Ø=4.6mm;

—stationaryphase:diisopropylcyanopropylsilylsilica

gelforchromatographyR(5μm)withaspecific

surfaceareaof180m2/gandaporesizeof8nm;—stationaryphase:sphericaloctadecylsilylsilicagelforchromatographyR(5μm)withaspecificsurfaceareaof170m2/gandaporesizeof12nm.—stationaryphase:aminopropylsilylsilicagelforchromatographyR(5μm),—stationaryphase:end-cappedoctadecylsilylsilicagelforchromatographyR(5μm),—stationaryphase:base-deactivatedoctadecylsilylsilicagelforchromatographyR(3μm).—stationaryphase:octylsilylbase-deactivatedsilicagelforchromatographyR(4μm)withaporesizeof6nm,—stationaryphase:end-cappedpolar-embeddedoctadecylsilylamorphousorganosilicapolymerR(5μm);MobilephaseMix35volumesofacetonitrileRand65volumesofa5.23g/lsolutionofdipotassiumhydrogenphosphateRpreviouslyadjustedtopH7.0withphosphoricacidR.

（答案见备注信息）问题：下列色谱柱如何选择？amidohexadecylsil15以传统方式制造硅胶（A类硅胶）色谱填料的过程:

起始原料为矿物硅酸盐（如泡花碱）Na2SiO3(矿物)+2H+Si(OH)4(silicicacid)+2Na+硅胶颗粒(含金属杂质!)C18/C8bonding+endcappingC18/C8ReversedPhases(最终仍带金属杂质!)以传统方式制造硅胶（A类硅胶）色谱填料的过程:

起始原料为16

与键合相的疏水性作用双重保留机理:1).与键合相的的疏水性作用;2).与残余硅醇基间的离子交换作用O-SiO-SiO-

O-SiO-SiO-

O-SiO-

O-SiO-SiO-SiO-

O--SiO-SiO-SiO-SiOHO-SiO-SiOHO-SiOHO-SiO-SiO-SiOHO-SiO-Si(CH3)2HN+(CH3)2HN+当流动相pH值小于3时,硅醇基呈中性(未解离)

BaseBase对碱性化合物的保留及严重拖尾两实验使用相同的传统C8硅胶柱离子交换作用碱性分析物在硅胶柱上的拖尾机理当流动相为pH6-8时,硅醇基带负电性(大部解离)与键合相的疏水性作用双重保留机理:1).与键合相的的疏水17既然pH<3时硅醇基离解受抑制，为何不在所有情况下采用酸性条件进行分离?低pH可导致分离选择性的完全丧失!pH7.0pH2.0amitriptylinenortriptyline既然pH<3时硅醇基离解受抑制，为何不在所有情况下采用酸性18硅胶晶格中杂质铝对硅醇基酸度的影响质子酸H金属嵌入硅胶晶格中，使硅醇基的酸性大大增强+_硅胶晶格中杂质铝对硅醇基酸度的影响质子酸H金属嵌入硅胶晶格中19硅胶中金属杂质含量对螯合性化合物Hinokitiol峰形的影响Minutes2468流动相:20mMPhosphateBufferpH3.6（含0.05%EDTA):Acetonitrile(50:50)低金属杂质高金属杂质含量硅胶中金属杂质含量对螯合性化合物Hinokitiol峰形的影20

金属杂质的存在可使得硅醇基过度活化，以至某些碱性化合物在酸性条件下仍呈现拖尾峰

分析物:Chlorpheniramine杂质铝含量,ppm12340100200300400拖尾因子

“高纯硅胶”区流动相

:乙腈/KH2PO4pH3.0(20:80)金属杂质的存在可使得硅醇基过度活化，以至某些碱性化合21传统型C18硅胶柱上金属杂质对碱性化合物峰形的影响Minutes515253545AmitriptylineAcenaphthenePropranololandButylparabenNaphthalene铝杂质含量~375ppmTfUSP=6.5

流动相pH7传统型C18硅胶柱上金属杂质对碱性化合物峰形的影响Minut22如何解决碱性化合物和螯合物的峰形问题?从修饰流动相着手改善峰形(例如使用竞争性碱TEA或离子对色谱)1970-1980年代策略从改善反相填料着手降低硅醇基活性自1990年代起至今如何解决碱性化合物和螯合物的峰形问题?从修饰流动相着手改善峰23现代色谱柱三大技术平台亲水AQ柱ECOSILODS-AQAtlantisDc18,T3SynergiHydro-RPHILIC柱Zic-HILICHypersilGOLDHILICAtlantisHILIC柱目的：提高极性化合物保留宽pH色谱柱ECOSILODS-ExtendXbridge/XterraC18/C8GeminiC18ZorbaxODS-Extend目的：提高色谱柱pH使用范围纯硅胶柱ECOSILODS-SHPurospherSTARRP18eSymmetryC18极性嵌入柱ECOSILODS-EPSZorbax-BonusRP18SymmetryshieldRP18目的：改善峰形现代色谱柱三大技术平台亲水AQ柱宽pH色谱柱纯硅胶柱24Tetraethoxysilane(TEOS)Polyethoxysilane(PEOS)B类超纯硅胶柱基体颗粒的化学合成过程无金属杂质的超纯起始原料TetraethoxysilanePolyethoxysil25常见品牌C18柱在pH7下的性能比较品牌Acenaphk'Amitrip/AcenapaAmitriptyline拖尾因子(美国药典法)EcosilC18-SH161.31.4InertsilODS-2161.42.5PuresilC18141.53.3ZorbaxRxC18161.86.0PurospherRP-18164.86.0KromasilC18AlltimaC1819231.53.5

9.413Nova-PakC18162.35.5NucleosilC18154.3

10HypersilODS112.8

10ZorbaxODS21无法测得结果!常见品牌C18柱在pH7下的性能比较品牌Acenaphk'A262.6常见品牌C18柱在pH3下的性能比较柱品牌Toluamidek'Chlorph/ToluamaChlorpheniramineECOSILC18SHPurospherRP181.40.711.4AlltimaCInertsilODS-ZorbaxRxCPuresilCNova-PakC181.33.9NucleosilCZorbaxODSHypersilODS1.511

11KromasilC18

1.5

3.61.8拖尾因子(美国药典法)2.6常见品牌C18柱在pH3下的性能比较柱品牌Toluam27对碱性化合物的峰对称性

pH7

pH3

Symmetry

Symmetry(极佳)

Inertsil

Purospher

LiChrospherRPselectB

Alltima

YMCbasic

Inertsil

Puresil

kromasil

Purospher

YMCbasic

ZorbaxRx

ZorbaxRx

Nova-Pak

LiChrospherRPselectB

kromasil

Puresil

Alltima

Nova-Pak

Nucleosil

Nucleosil

Hypersil

Zorbax

Zorbax

Hypersil

(差)

常见品牌柱在pH3和pH7下的峰形优劣排序EcosilODS-SHEcosilODS-SH对碱性化合物的峰对称性pH7pH3Symmet28具有极性嵌入基团的反相填料结构示意

OSiCH3CH3极性基团极性嵌入基团键合配体OSiCH3CH3传统直链型烷基键合配体具有极性嵌入基团的反相填料结构示意OSiCH3CH3极性极29内嵌极性基团固定相：水表面层可能机理水“屏蔽”层改善与水的浸润性－100%水溶液兼容降低了碱性化合物的保留降低了拖尾现象屏蔽了带负电的硅羟基极性基团增加了表面层水的浓度内嵌极性基团固定相：水表面层可能机理水“屏蔽”层改善与水的3001020304050用于浸润固定相的甲醇水溶液的比例%020406080100在1mL/min流速下的浸润率%C18键合相硅胶柱填料需要合适的湿润度注意：需要有机溶剂来保证反相填料有合适的湿度,反之停流速后易出现“疏水塌陷”问题01020304050用于浸润固定相的甲醇水溶液的比例%0231未湿润的孔湿润的孔注意：保留时间与填料表面积与配体有关。然而，如果硅胶表面未湿润，那么有效的色谱表面积会减少95%，因此，减少被分析物的保留时间即等于“疏水塌陷”，记住：几乎所有的表面积都在孔内！低比例有机溶剂或纯水溶液流动相C18

硅胶什么是“疏水塌陷”？未湿润的孔湿润的孔注意：保留时间与填料表面积与配体有关。然而32分0246810流动相：0.1%醋酸水溶液阿莫西林Vo：被分析物没有保留“湿润时”“去湿后”疏水塌陷分0246810流动相：0.1%醋酸水溶液阿莫西林Vo：被33停流速后(孔去湿:~3%)流动相：0.1%醋酸水溶液Minutes0246810初始时保留时间无变化阿莫西林极性嵌入色谱柱：无疏水塌陷现象发生内嵌极性基团键合相：使用高比例水溶液流动相时色谱性能稳定停流速后(孔去湿:~3%)流动相：0.1%醋酸水溶液M34EcosilC18-EPSTfUSP=1.1分0102030阿米替林EcosilC18-SHTfUSP=1.4注意：对碱性化合物而言，可以减少保留时间并且改善色谱峰形相同硅胶基质(配体不同)内嵌极性基团的配体与直链烷烃配体的比较EcosilC18-EPS分0102030阿米替林Ecos35注:使用相同的流动相EcosilC8-EPSEcosilC8-SH选择性不同呋喃唑酮(痢特灵)杂质分析注:使用相同的流动相EcosilC8-EPSEcosil36极性基团嵌入技术（屏蔽技术）的历史沿革1990:Supelcosil™pKb-100(嵌入酰胺键),专利(两步合成法)1992:Prism®RP(嵌入脲结构)和Supelcosil™LC-ABZ(两步合成法)1993:Supelcosil™ABZ+Plus(两步合成法)1995/1996:WatersSymmetryShield™RP18/RP8(氨基甲酸酯结构),专利(一步合成法)1999:WatersXterra™RP18/RP8(氨基甲酸酯结构),专利(一步合成法)1998/1999(Supelco放弃了基于酰胺键嵌入技术的两步合成法专利):Discovery™RPAmideC16(一步合成法)许多其他公司开始仿制.2000:ECOSILC18-EPS/C8-EPS(酰胺基十六烷基结构)(一步合成法)极性基团嵌入技术（屏蔽技术）的历史沿革1990:Supel37多种品牌色谱柱对碱性化合物的峰形比较USPTailingFactor(amitriptyline,pH7)3.44.355.66.491013579EcosilC8-EPSEcosilC18-EPSSymmetryShield™RP8SymmetryShield™RP18YMC-Pack™PolymericC18™Luna™C18(2)Supelcosil™ABZ+PlusDiscovery™RPAmideC16ECOSILC18SHLuna™C18Zorbax®BonusRPYMC-Pack™CNNova-Pak®CNHPYMC-Pack™ProC8™Symmetry®C18Symmetry®C8YMC-Pack™ProC18™Nova-Pak®PhenylZorbax®ExtendC18YMC-Pack™PhenylYMC-Pack™ODS-AWatersSpherisorb®ODSBNova-Pak®C18WatersSpherisorb®ODS2µBondapak™C18多种品牌色谱柱对碱性化合物的峰形比较USPTailing38Atlantis®

dC18Column:

揭开人类酿酒历史之谜(2004)

古埃及十二世王Tutankhamen(约公元前1346-1327)1922年发掘Tut王墓葬时所发现的具象形文字的残片,疑为盛酒器皿上的标签说明TartaricAcid(酒石酸)

SyringicAcid(丁香酸):是红葡萄中的两个内源性标记物Atlantis®dC18Column:

揭开人类酿酒历39AQ柱的极性保留秘诀表面峰端键合密度键合相连接方式微孔大小防微孔脱水峰形保留性能柱寿命1、极性封尾2、极性嵌入3、低碳载量4、保留硅羟基5、增加极性嵌入键合相AQ柱的极性保留秘诀表面峰端键合密度键合相连接方式微孔大小防AQ色谱柱的特点对极性与非极性化合物的优异保留特性在100％水溶液流动相中运行保持色谱性能稳定峰形优异超低键合相流失，质谱兼容酸性条件下稳定性良好在高水相、低pH条件下具有较长的色谱柱寿命极佳的色谱柱间重现性AQ色谱柱的特点对极性与非极性化合物的优异保留特性41AtlantisâdC18柱对极性化合物的优异保留性能对嘌呤碱表现良好峰形(因对填料进行了彻底封端)Compounds:

1.Cytosine2.5-Fluorocytosine3.Uracil4.5-Fluorouracil5.Guanine6.Thymine7.Adenine123456Minutes1.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.007V0=1.83minConditionsColumn:AtlantisTMdC184.6x150mm,5µmMobilePhaseA:H20MobilePhaseB:ACNMobilePhaseC:100mMCH3COONH4,pH5.0FlowRate:1.0mL/minGradient: Time Profile (min) %A%B %C 0.0 900 10 10.0 846 10InjectionVolume:10µLTemperature:30oCDetection:UV@254nmInstrument::AllianceTM2695,2996PDA尿嘧啶(Uracil)

是测试反相柱最广泛采用的死体积标记物,但在AtlantisâdC18柱上具显著保留AtlantisâdC18柱对极性化合物的优异保留性能对嘌42AtlantisdC18:丙毒(丙烯酰胺)分析色谱柱：AtlantisdC18色谱柱5μm，2.1×150mm流动相：0.1%甲酸+甲醇=98+2流速：0.2mL/min进样体积：20ml数据来源：北京CDCAtlantisdC18:丙毒(丙烯酰胺)分析色谱柱：At43条件色谱柱：AtlantisTMdC184.6x150mm,5µm流动相A:0.1%TFA水溶液流动相B:0.1%TFA乙腈溶液流速:1.4mL/min梯度: 时间 梯度组成 (min) %A%B 0.0 1000 5.0 973 6.0 8515 10.0 8020 12.0 0100 25.0 0100进样体积:10.0µL温度:30oC检测:UV@268nm仪器:AllianceTM2695,2996PDA极性与非极性化合物保留的完美平衡化合物：

浓度(µg/mL)1.L-抗坏血酸(VC) 19.62.烟酸(niacin) 9.83.硫胺(VB1) 19.64.吡哆醛 39.25.吡哆醇(VB6) 39.26.叶酸(VB11) 23.57.咖啡因 9.88.核黄素(VB2) 3.99.视黄醇(VA) 19.610.生育酚(VE) 39.211.麦角钙化甾醇(VD2) 9.8Grumbach,DiehlMinutes2.004.006.008.0010.0012.0014.0016.0018.0020.0022.0024.0012345876V0=1.37min10911对于水溶性维生素的极佳保留对于脂溶性维生素不过度保留注：无需离子对试剂！条件极性与非极性化合物保留的完美平衡化合物： 浓度(µg44问题AQ柱有哪些不足之处？？问题AQ柱有哪些不足之处？？45HILICHydrophilicInteractionLiquidChromatography(HILIC)亲水作用液相色谱

其他HILC柱硅胶柱氨基柱丙基酰胺柱亲水键合硅胶柱（多羟基等）问题：为什么不考虑SCX或SAXHILICHydrophilicInteractionLHILIC柱特性HILIC柱用于在AQ柱上依然无有效保留的场合分离机制为“反反相色谱”技术HILIC柱与C18柱上的出峰顺序刚好相反由于使用含高有机溶剂成分的流动相进行分离，在LC/MS应用中的检测灵敏度比AQ柱上显著提高可直接将样品溶于纯有机溶剂中进样，省却了将样品溶剂蒸干再定容的麻烦。HILIC保留特性1、固定水，利用氢键作用2、离子交换作用洗脱能力：water>methanol>ethanol>propanol>

acetonitrile

>acetoneHILIC柱特性HILIC柱用于在AQ柱上依然无有效保留的三聚氰胺和三聚氰酸同时检测FDA推荐Zic-HILIC三聚氰胺和三聚氰酸同时检测FDA推荐Zic-HILIC色谱柱分类与选择-内部培训讲义资料课件49突破高纯硅胶柱局限性的必要性硅胶柱pH适用极限0102030400123456789101112kpH硅醇基解离,带负电荷硅醇基未解离碱性化合物具良好峰形但保留不足对碱性化合物的保留增强,但需严格控制流动相pH值。封端不佳的反相柱会面临峰拖尾的问题。pH10NortriptylineAmitriptylineMinutes0123Minutes0123pH2硅醇基完全解离,硅胶基体逐步溶解！碱性化合物呈中性，保留强,峰性佳。需要全新的柱技术突破高纯硅胶柱局限性的必要性硅胶柱pH适用极限010203050宽pH值色谱柱

突破硅胶柱应用禁区的有力手段优点缺点无机基质(C18–硅胶)

机械强度高柱效高保留稳定有限的pH应用范围对碱性分析物拖尾化学不稳定性有机基质(高聚物)

很宽的pH应用范围无离子型作用化学稳定性好机械强度不佳柱效低保留行为难以预测宽pH值色谱柱宽pH值色谱柱

突破硅胶柱应用禁区的有力手段优点缺点无机基质51宽pH值色谱柱的几种类型双齿键合，Agilent宽pH值色谱柱的几种类型双齿键合，Agilent52四乙氧基硅烷(TEOS)硅甲基嵌入型聚乙氧基硅烷(MPEOS)甲基三乙氧基硅烷(MTEOS)Waters专利技术荣获2000年全球R&D100大奖杂化颗粒柱(XTerra®)的合成过程示意四乙氧基硅烷硅甲基嵌入型聚乙氧基硅烷(MPEOS)甲基三乙53Tetraethoxysilane(TEOS)Bis(triethoxysilyl)ethane(BTEE)+4Polyethoxysilane(BPEOS)在硅胶聚合物网络中嵌入的乙烷基桥键Anal.Chem.2003,75,6781-6788U.S.PatentNo.6,686,035B2第二代杂化颗粒技术TetraethoxysilaneBis(triethoxy54高pH条件下柱稳定性的强化测试结果

柱寿命比超纯硅胶柱提高十倍以上!高pH条件下柱稳定性的强化测试结果

柱寿命比超纯硅胶柱提高十55pH对填料稳定性的影响高pH实验pH>8时,许多C18硅胶基质过早地丧失柱效由于填料颗粒溶解,色谱柱内产生空隙随着键合相覆盖率的增加，色谱柱寿命延长低pH实验pH<2时,许多C18硅胶基质过早地丧失柱效由于键合相之水解作用,被测物丧失保留行为使用三官能团键合相可获得最佳的稳定性pH对填料稳定性的影响高pH实验56灵敏度与选择性的改变色谱柱:XTerra™RP18,4.6.x150mm,3.5µm检测:254nm(相同进样量)流动相:50%乙腈/40%水/10%含100mM

CAPSO,

pH10流动相:30%乙腈/60%水/10%含100mM磷酸钠,

pH2.0MinutespH100.000.2524681012酮康唑阿司咪唑0酮康唑阿司咪唑AUpH2色谱图重叠pH2与10：阿司咪唑与酮康唑分析灵敏度与选择性的改变色谱柱:XTerra™RP18,457简化方法开发过程123456789101112pH中间pH硅胶柱低pH硅胶柱高pH聚合物基质柱宽pH范围填料色谱柱宽pH值色谱柱之宽pH范围(以一当三)简化方法开发过程123456789101112pH中间pH58温度pH宽pH值色谱柱：高温稳定性温度pH宽pH值色谱柱：高温稳定性59高温寿命试验PeakNumber

USPTailingFactor1.多虑平1.22.去甲替林1.13.阿米替林1.14.三甲丙咪嗪1.0AU-0.0050.10Minutes1.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.00AU-0.020.48Minutes1.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.001234123412341234AU0.000.26Minutes1.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.00AU-0.0050.10Minutes1.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.00第二十一天第二天XTerra™RP18普通硅胶C18

Conditions:Column:XTerra™RP18,5µm,4.6X150mmMobilePhase:40%pH7,10mMNa2PO4,60%ACNColumnTemp.:60°CFlowRate:1.5mL/minDetector:254nm三环抗抑郁药物分离高温寿命试验PeakNumberUSP60宽pH值色谱柱的优点为方法开发提供了极其有效且方便的工具宽pH范围良好色谱峰形高稳定性宽pH值色谱柱的优点为方法开发提供了极其有效且方便的工具61基于杂化颗粒的XTerraRP18柱与普通C18硅胶柱

在分离酸性、碱性化合物时的拖尾因子比较基于杂化颗粒的XTerraRP18柱与普通C18硅胶柱

在62为何杂化颗粒柱可增强在高pH下的柱寿命？硅胶快速溶解严重的柱失效柱寿命短暂SurfacemodifiedSilicaParticles因嵌入硅甲基的阻挡,颗粒表面溶解速度明显减缓柱寿命大大延长XTerra®HybridParticles普通硅胶柱基于杂化颗粒的Xterra柱为何杂化颗粒柱可增强在高pH下的柱寿命？硅胶快速溶解Sur63基质溶解度

(ppm)12345678910 12240-220-200-180-160-140-120-100-80-60-40-20-0-pH基质溶解度曲线传统硅胶柱适用范围pH2-7

各种基质的液相柱在高pH中溶解速率的比较液相柱基体材料的溶解导致柱前端形成空腔，由此而造成色谱峰畸形、分叉。现代超纯硅胶柱适用范围pH2-8宽pH值色谱柱适用范围pH1-12基质溶解度(ppm)12364宽pH值色谱柱对创建稳定可靠的HPLC分析方法的独特价值

Note:ColumnParticle,Temperatureand%OrganicHeldConstant0.111010002468101214pHkAcetaminophenIbuprofenNortriptylineLidocaineDoxepinImipraminep-ToluamideMobilePhase:35%MeCN,65%20mMBuffer稳定保留区稳定保留区硅胶柱宽pH值色谱柱宽pH值色谱柱对创建稳定可靠的HPLC分析方法的独特价值NDibucaine

(局部麻醉药-碱性化合物)美国药典USP28上所推荐的色谱方法淋洗剂:1.2g十二烷基磺酸钠(SDS),0.2g醋酸钠,2.0ml三乙基胺溶于300ml水中,调pH至5.6，然后加700ml甲醇3.9x300mmL1柱，要求拖尾因子<3.0

SDS:表面活性剂/离子对试剂

TEA:竞争碱为对抗峰拖尾而加入?文献pKa=8.9Dibucaine

(局部麻醉药-碱性化合物)美国药典US66Minutes012分析柱:XTerra®RP18,4.6.x150mm,3.5µm检测波长:254nm流动相:50%ACN/40%Water/10%aqueous100mMNH4HCO3,pH10.3USPTF1.026

GoodPeakShapeNoAdditivesSimplemobilephase用杂化柱在高pH下分析Dibucaine

拖尾问题迎刃而解Minutes012分析柱:XTerra®RP18,467Altretamine

(三嗪类抗癌药物-强碱性化合物)美国药典USP28上所推荐的色谱方法流动相:制备甲醇与缓冲液的混合液(790mg碳酸铵(NH4)2CO3溶于1000mL水中，调节pH至8.0±0.05)(65:35)色谱柱:一根以USPL1填制的4.6-mmx30-cm分析柱。USP拖尾因子不得大于1.5。pKa=10.3正确的做法是用碳酸氢铵而不是碳酸铵来配制缓冲液pH需要控制在±0.05范围内

Altretamine

(三嗪类抗癌药物-强碱性化合物)美68Minutes0612分析柱:XTerra®RP18,4.6.x150mm,3.5µm检测波长:227nm流动相:50%ACN/40%Water/10%aqueous100mMNH4HCO3,pH10.0USPTF=1.08用杂化柱在高pH下分析Altretamine

柱寿命、峰拖尾和方法重现性问题迎刃而解Minutes0612分析柱:XTerra®RP18,69您在日常HPLC分析工作中所面临的常见问题PeakTailingRetention

ReproducibilityProduct

QualityPriceWatersPeakTailingRetention

Reproducibility峰拖尾:28%保留时间不重现:25%分离不佳:24%柱寿命太短11%极性化合物保留不佳:12%您在日常HPLC分析工作中所面临的常见问题PeakTail70我的色谱分离为何重现性不佳?仪器系统问题

泵精度、维修保养状况色谱柱是否置于恒温箱中

系统滞后体积发生改变(仅影响梯度分离!)

柱与柱间分离表现发生改变您的色谱柱是否购自可靠的生产和销售厂家?

源自方法本身的问题

流动相的配制方法在无意中发生了改变分离可离子化化合物（酸、碱）未在流动相中使用缓冲液(或缓冲液的浓度不足)

流动相的pH值与被分析酸性、碱性化合物的pKa相近

我的色谱分离为何重现性不佳?仪器系统问题71梯度分离时系统滞后体积变化对分离时间的影响

10.0015.0020.0025.001234510.0015.0020.0025.00Minutes12345系统

A:泵滞后体积800µL系统

B:泵滞后体积

>1000µL分离在同一根色谱柱上进行!解决方案:1.在梯度表的每一个时间段中加入相应的补偿时间

2.在Empower软件上启动‘柱前体积’功能梯度分离时系统滞后体积变化对分离时间的影响10.001572**需指明哪个溶剂先加（如将甲醇加入水中还是水加入甲醇中？）关于流动相pH的提醒:缓冲液的pH需在加入有机溶剂前调试！需要清楚地记录并遵循流动相的配制顺序!60/40600400流动相的配制顺序:您常常忽视的细节**需指明哪个溶剂先加（如将甲醇加入水中还是水加入甲醇中？73pH0.111010002468101214保留因子(k)酸(未离子化)中性化合物碱1碱

1+2(完全离子化)酸(完全离子化)碱2NA,B1B2(未离子化)B1NAB2pH5.5pH6.0您的分析方法为何重现性不佳?流动相缓冲pH值是否靠近分析物的pKa范围?

如图所示,在靠近中性pH区间分析可离子化化合物时需要对流动相pH进行非常仔细的控制!!

pH0.111010002468101214保留因子(k)740.0000.401.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.00pH5.01230.0000.401.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.00pH5.4312pH5.20.0000.401.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.00132pH5.61320.0000.401.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.001.p-Toluamide2.Lidocaine3.IbuprofenGrumbach,Diehl分析方法对pH敏感度的测试-糟糕的结果Column:XTerra®RP184.6x100mm,5µmMobilePhaseA:20mMAmmoniumAcetate(pH5.0to5.8) or20mMAmmoniumBicarbonate(pH6.8to7.0)MobilePhaseB:ACNFlowRate:0.5mL/minIsocraticMobilePhaseComposition:40%A;60%BInjectionvolume:10µLTemperature:30oCDetection:UV@230nmInstrument:AllianceTM2690,996PDA0.0000.401.002.003.750.0000.401.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.00pH7.03120.0000.401.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.00pH6.83121.p-Toluamide2.Lidocaine3.IbuprofenGrumbach,Diehl132pH5.81.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.000.0000.40Column:XTerra®RP184.6x100mm,5µmMobilePhaseA:20mMAmmoniumAcetate(pH5.0to5.8) or20mMAmmoniumBicarbonate(pH6.8to7.0)MobilePhaseB:ACNFlowRate:0.5mL/minIsocraticMobilePhaseComposition:40%A;60%BInjectionvolume:10µLTemperature:30oCDetection:UV@230nmInstrument:AllianceTM2690,996PDA分析方法对pH敏感度的测试-糟糕的结果0.0000.401.002.003.76分析方法对pH敏感度的测试-优异的结果分析方法对pH敏感度的测试-优异的结果77杂化颗粒柱对创建稳定可靠的HPLC分析方法的独特价值

Note:ColumnParticle,Temperatureand%OrganicHeldConstant0.111010002468101214pHkAcetaminophenIbuprofenNortriptylineLidocaineDoxepinImipraminep-ToluamideMobilePhase:35%MeCN,65%20mMBuffer稳定保留区稳定保留区硅胶柱Xterra&X-Bridge杂化颗粒柱杂化颗粒柱对创建稳定可靠的HPLC分析方法的独特价值Not您在日常HPLC分析工作中所面临的常见问题PeakTailingRetention

ReproducibilityProduct

QualityPriceWatersPeakTailingRetention

Reproducibility峰拖尾:28%保留时间重现性不佳:25%分离不佳:24%柱寿命太短11%极性化合物保留不佳:12%您在日常HPLC分析工作中所面临的常见问题PeakTail79我的色谱柱寿命为何不长?您是否有恰当的样品前处理手段?

样品前处理(净化和富集)的好坏不仅影响分析结果的灵敏度和可靠性，而且直接影响色谱柱的寿命

您的色谱柱是否有适当的保护措施?

在线过滤器保护柱

您的色谱柱是否曾暴露在过于剧烈的分离条件?

使用某些对填料基体有腐蚀性的高浓度缓冲盐

(如在中性或碱性pH区域使用高浓度缓冲盐的磷酸盐或硼酸盐)

柱温过高

将色谱柱暴露在极端pH的流动相中

我的色谱柱寿命为何不长?您是否有恰当的样品前处理手段?80您在日常HPLC分析工作中所面临的常见问题PeakTailingRetention

ReproducibilityProduct

QualityPriceWatersPeakTailingRetention

Reproducibility峰拖尾:28%保留时间不重现:25%分离不佳:24%柱寿命太短11%极性化合物保留不佳:12%您在日常HPLC分析工作中所面临的常见问题PeakTail81()()1kk14NRs22+´a-a´÷øöçèæ=影响分离度的若干因素柱效N­2,R­40%分离选择性(方法开发归根结底是如何使得a¹1)保留因子K最佳=5()()1kk14NRs22+´a-a´÷øöçèæ=影响分82如何在实践中调控

‘a’?

这是方法开发的根本!低高pH甲醇乙腈溶剂类型C18RP18C8RP8苯基色谱柱化学a选择性如何在实践中调控‘a’?

这是方法开发的根本!低高pH甲醇83溶剂选择性常用溶剂:甲醇(MeOH)乙腈(MeCN)其他溶剂:异丙醇(IPA)乙醇(EtOH)THF(Tetrahydrofuran)使用不同溶剂，可以改变选择性和洗脱强度溶剂选择性常用溶剂:使用不同溶剂，可以改变选择性和洗脱强度84反相色谱中选择性的调节工具

色谱柱选择溶剂pH

a

选择性1不同类型2不同键合相3不同品牌反相色谱中选择性的调节工具色谱柱选择溶剂pH85色谱柱选择色谱柱选择86反相色谱中选择性的调节工具

色谱柱化学溶剂pH

a

选择性反相色谱中选择性的调节工具色谱柱化学溶剂pH87选择性与pH仅影响带离子型官能团的待测物如：胺，羧酸及酚类等pH不影响不能发生电离的中性物质的保留

大多数药物含有一个或多个离子型官能团pH变化引起的选择性变化最大选择性与pH仅影响带离子型官能团的待测物88

pH带来的保留与选择性变化化合物从离子化状态变化到非离子化状态其保留因子变化10到30倍上述变化相当于有机溶剂的比例变化20%pH带来最显著的选择性变化pH是方法开发最强有力的选择性调节工具

pH带来的保留与选择性变化化合物从离子化状态变化到非离子化89方法开发的基本思路

哪一根色谱柱可以在低PH下得到:所有杂质峰基线分离?所有杂质峰之峰形良好?主峰与杂质完全分离(用PDA或MS确定峰纯度)?次要色谱峰足够的信噪比(S/N)?如果答案是肯定的，则选择此色谱柱，并在此基础上进一步优化方法(有机相比例)如果答案是否定的，尝试使用高pH分离条件90方法开发的基本思路哪一根色谱柱可以在低PH下得到:9090运行低pH快梯度：在选择性不同的所有色谱柱上确定等度分离条件在选择性不同的几根色谱柱上运行低pH等度分离实验－药物破坏性实验产物(降解原料药)对上述结果满意吗?运行高pH快梯度：

硅胶基质色谱柱@pH7

杂化基质色谱柱@pH10确定等度分离条件在选择性不同的几根色谱柱上运行高pH等度分离实验－药物破坏性实验产物(降解原料药)对上述结果满意吗?选择色谱柱并优化等度方法选择色谱柱并优化等度方法是是否其他选择：1.考虑用甲醇替换乙腈2.考虑采用更高的温度否HPLC方法开发思路91运行低pH快梯度：在选择性不同的所有色谱柱上确定等度分离条件91频繁切换分析柱、流动相溶剂和缓冲液过于繁琐？

自动方法开发系统（AMDSsystem）可帮您解决问题…

ACBDSolventSelector:ControlledviaContactClosuresD3D2D1MobilePhases:A H2OB MeCNC MeOHD1 pH3NH4COOHD2 pH10NH4HCO3D3 10%MeCN(valvewash)Totalof6bottlescanbeusedforlineD.3/6columnselectorNote:Forfullcontrolviacomputer,upgradetoEmpowersoftware.频繁切换分析柱、流动相溶剂和缓冲液过于繁琐？

自动方法开发系92探索性HPLC方法开发

优化条件甲醇,低pH

乙腈,

低pH甲醇,高pH乙腈,

高pH

XTerra®

RP18

XTerra®

MSC18

XTerra®

Phenyl探索性HPLC方法开发优化条件甲醇,乙腈,甲醇,乙93色谱条件色谱柱规格4.6mmx50mm,3.5mm梯度洗脱0%to80%,tg=15minMeOH和MeCNpH3(甲酸铵缓冲液)或pH9(碳酸氢铵缓冲液)流速=2mL/min温度=30oCAlliance®HPLC系统色谱条件色谱柱规格94例:利尿剂分离极性相差很大的9种物质用梯度方法考察pH、固定相，及流动相对分离的影响选择最佳色谱条件，最终获得梯度分离结果例:利尿剂分离极性相差很大的9种物质95梯度分离测试混合物：利尿剂

5

Benzthiazide(WA)8

Bumetanide(Z)7利尿酸(Ethacrynicacid,A)6丙磺舒(Probenecid,A)4利尿磺胺(Furosemide,Z)2氯噻酮(Chlorthalidone,WA)9Canrenoicacid(A)1氨苯喋啶(Triamterene,B)3Althiazide(WA)梯度分离测试混合物：利尿剂5Benzthiazide96利尿剂:使用乙腈的起始梯度分离pH3.64

pH9.0Minutes0.001.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.00124397568XTerra®Phenyl0.001.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.00XTerra®RP1812358974612439,57680.001.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.00XTerra®MSC180.001.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.0012965,387XTerra®MSC1843Minutes0.001.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.00XTerra®Phenyl4162,9,8,750.001.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.00XTerra®RP184126985,73Wagrowski,Tran利尿剂:使用乙腈的起始梯度分离pH3.64 97pH3.64

pH9.0436,1,587,9XTerra®PhenylMinutes0.002.004.006.008.0010.0012.0014.002Minutes0.002.004.006.008.0010.0012.0014.00XTerra®RP18123,458,9Minutes0.002.004.006.008.0010.0012.0014.00123456,78,9XTerra®PhenylMinutes0.002.004.006.008.0010.0012.0014.0043,215,689,7XTerra®MSC1842,16,3859,7XTerra®RP18Minutes0.002.004.006.008.0010.0012.0014.00Minutes0.002.004.006.008.0010.0012.0014.00XTerra®MS73Wagrowski,Tran利尿剂:使用甲醇的起始梯度分离pH3.64 pH9.0436,1,587,9XTe98两种条件下的分离结果考察没有任何起始条件可以完全分离所有化合物pH带来最大的选择性变化碱性pH条件下色谱峰间隔较小

酸性pH条件下色谱峰的分离度较大两种条件下的分离结果考察没有任何起始条件可以完全分离所有化合99利尿剂酸性pH条件下的起始梯度分离比较:Wagrowski,Tran乙腈

甲醇Minutes0.002.004.006.008.0010.0012.0014.00XTerra®RP18123,456,78,9Minutes0.002.004.006.008.0010.0012.0014.00123456,78,9XTerra®PhenylMinutes0.001.002.003.004.005.006.007.008.009.0010124397568XTerra®Phenyl0.001.002.003.004.005.006.007.008.009.0010XTerra®RP181258974630.001.002.003.004.005.006.007.008.009.001012439,5768XTerra®MSC18Minutes0.002.004.006.008.0010.0012.0014.00XTerra®MS尿剂酸性pH条件下的起始梯度分离比较:Wagrowski,100甲醇体系：最终梯度优化结果色谱柱:XTerra®MSC18;4.6x50mm3.5µm.柱温：30°C.流速:2.0mL/min.检测:254nm.进样体积:20µl.运行时间:20min.流动相:A:100mM甲酸铵pH3.64.B:水;C:甲醇

样品浓度:20μg/mL0.015Minutes0.002.004.006.008.0010.0012.0014.00XTerra®MSC18起始梯度1245678930.060Minutes0.001.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.0011.0012.00123456789XTerra®MSC18最终梯度分离结果Time(min)%A%B%C0 109001 105040310464410 10464411 109001510900TriamtereneChlorthalidoneAlthiazideFurosamideBenzthiazideProbenecidEthacrynicacidBumetanideCanrenoicacidWagrowski,Tran甲醇体系：最终梯度优化结果色谱柱:XTerra®MSC1101利尿剂分离样品复杂：样品中含有9种化合物基于起始梯度实验的结果，优化了色谱柱类型，有机相比例及pH平梯度获得最终满意分离结果利尿剂分离样品复杂：样品中含有9种化合物102pH9.0条件下的溶剂选择性：

等度分离条件探索Wagrowski,Tran3,5Minutes0.002.004.006.008.0010.0012.0014.001.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.00129687XTerra®MSC184乙腈42,315,689,7甲醇pH9.0条件下的溶剂选择性：

等度分离条件探索Wagro103利尿剂：

pH9条件下最终的等度分离条件流动相:A:乙腈;B:甲醇;C:水;D:100mM甲酸铵,pH9.0等度条件:A:13%(乙腈);B:4%(甲醇);

C:73%(水);D:10%(甲酸铵)XTerra®

MSC184.6x50mm,3.5µmAU0.000.020.04Minutes0.02.04.06.08.010.012.014.016.01423659871.Triamterene2.Chlorthalidone3.Althiazide4.Furosemide5.Benzthiazide6.Probenecid7.Ethacrynicacid8.Bumetanide9.Canrenoicacid利尿剂：

pH9条件下最终的等度分离条件流动相:A:104等度分离利尿剂碱性pH条件下的峰间隔较小(色谱峰紧密排列)的洗脱状况，使得等度分离成为可能通过溶剂选择性进行微调，最终实现完全分离使用小颗粒短柱(5cm,3.5µm)，在pH9可实现色谱峰的完全分离等度分离利尿剂碱性pH条件下的峰间隔较小(色谱峰紧密排列)的105重要的方法开发为何要从新色谱柱开始？

随使用条件和样品洁净度的不同，多数色谱柱在使用过程中可发生化学污染、表面状态改变、基体材料部分溶解等等潜在变化。此类改变可导致柱内填料的活化或钝化，使其对某些化合物的分离选择性加强或变劣。此类特殊分离选择性常常是无法重复的。在此类旧色谱柱建立起来的方法将无法在新柱和其他旧色谱柱上得以重现，造成未来可能需要重新开发方法或进行大量针对仪器系统、色谱柱和流动相的不必要的诊断工作。

重要的方法开发为何要从新色谱柱开始？随使用条件和样品洁净度106反相色谱柱的选择小结:(1)常规应用现代高纯硅胶色谱柱：优点：峰形好，重现性高，寿命长限制：pH2-8流动相中含有大量水溶液采用AQ技术：优点：在含有大量水溶液（100％水溶液）流动相中性能稳定：峰形好反相色谱柱的选择小结:(1)常规应用107需要使用宽pH值或高温条件－如生物碱分离宽pH值色谱柱：pH1-12优点：pH范围宽，高温条件下填料稳定性好，色谱峰形好，寿命长采用质谱检测器:窄内径/小颗粒/短柱反相色谱柱的选择小结:(2)需要使用宽pH值或高温条件－如生物碱分离反相色谱柱的选择小108结语现代液相色谱柱技术在改善分析物峰对称性、提高在严苛分析条件（如高、低pH）下的柱寿命、简化分离方法的建立和提高分析实验室生产力方面均扮演着不可替代的作用。应用现代多平台色谱柱技术(EcosilC18-SH、C18-EPS、C18-AQ、C18-Extend以及Zic-HILIC系列)，结合对流动相溶剂和pH的系统化调控，是方便快速地进行分析方法开发的最佳途经。广州绿百草以为色谱工作者提供最优质、最稳定可靠的柱产品为己任。我们丰富的应用经验为达致以上目标提供了坚强保障。结语现代液相色谱柱技术在改善分析物峰对称性、提高在严苛分析条109一、色谱起源石油醚碳酸钙颗粒色素色谱组分1906年俄国植物学家Tsweet发现色谱分离现象一、色谱起源石油醚碳酸钙颗粒色素色谱组分1906年俄国植物110111高效液相色谱仪的分析原理高效液相色谱仪的结构色谱柱在高效液相色谱仪中的作用和峰形产生原理高压泵进样器检测器色谱工作站色谱柱2高效液相色谱仪的分析原理高效液相色谱仪的结构高压泵进样器检1111Basicprincipleofchromatographicseparation1.1色谱分离基本原理PartitioncoefficientK分配系数1Basicprincipleofchromatog112硅胶颗粒基质合成步骤：1.合成硅胶基质2.键合配体(键合相)3.端基封尾end-capped硅胶颗粒基质合成步骤：113以传统方式制造硅胶色谱填料的过程:

起始原料为矿物硅酸盐（如泡花碱），即A类硅胶90年代以后方式：organosilicapolymer有机单晶硅聚合的硅胶，即B类硅胶以传统方式制造硅胶色谱填料的过程:

起始原料为矿物硅酸盐（114色谱柱分类与选择-内部培训讲义资料课件115填料的端基封尾–封口残余硅羟基–减少不可逆吸附或拖尾–增加碳含量（0.1%-1%）C18键合并端基封尾后还能看见什么？硅羟基!—即使进行高密度键合，硅胶表面仍将残留约50%硅羟基(SiOH)!填料的端基封尾C18键合并端基封尾后116单、双、三官能团键合三官能团键合二官能团键合单官能团键合单、双、三官能团键合三官能团键合二官能团键合单官能团键合117键合键合118常用封尾end-capped：三甲基硅氧烷极性封尾，增加极性保留HypersilODS即没有封尾HypersilODS-2有封尾由于空间位阻的存在，键合反应最多只能覆盖50%的硅羟基，超过一半硅羟基是活性硅羟基，与碱性基团会发生离子交换作用，增加了保留，