氨基酸发酵工艺学

第三章氨基酸发酵工艺学

学习氨基酸发酵工艺学的目的、研究对象、任务及内容

氨基酸发酵是典型的代谢控制发酵，由发酵所生成的产物——氨基酸，都是微生物的中间代谢产物，它的积累是建立在对微生物正常代谢的抑制。在脱氧核糖核酸(DNA)的分子水平上改变、控制微生物的代谢，使有用产物大量生成、积累。

以探讨氨基酸发酵工厂的生产技术为主要目的。氨基酸的生产以发酵为主，发酵过程的控制是整个生产的关键，产物的提纯及设备选用当否，也会影响产物得率。氨基酸发酵工艺学研究的对象应该包括从投入原料到最终获得产品的整个过程，其中有微生物生化问题、生化工程问题，也有分析与设备问题。

今后的发展是采用诱变、细胞工程、基因工程的手段选育出从遗传角度解除了反馈调节和遗传性稳定的更理想菌种，提高产酸；采用过程控制，优化工艺进行连续、自动化生产获得稳产高产；探求新工艺、新设备,以提高产率；研究发酵机制问题，以便能更好地控制氨基酸微生物中间代谢产物的发酵。

绪论第一节、氨基酸概论1、氨基酸简介构成蛋白质的基本分子单元。α碳原子分别以共价键连接氢原子、羧基和氨基及侧链。侧链不同，氨基酸的性质不同。目前世界上可用发酵法生产氨基酸有20多种。2、氨基酸的用途（1）食品工业：强化食品：赖氨酸，苏氨酸，色氨酸于小麦中增鲜剂：谷氨酸单钠和天冬氨酸苯丙氨酸与天冬氨酸可用于制造低热量二肽甜味剂(α-天冬酰苯丙氨酸甲酯),此产品1981年获FDA批准,现在每年产量已达数万吨。（2）饲料工业：甲硫氨酸等必需氨基酸可用于制造动物饲料，添加蛋氨酸、赖氨酸、精氨酸等必须氨基酸可促进动物生长发育、改善肉质、节省蛋白饲料、降低成本等。（3）医药工业：多种复合氨基酸制剂可通过输液治疗营养或代谢失调氨基酸注射液由1985年的100万瓶增长到2003的1.5万瓶，每年以15-20%的速度递增，全行业的年产值预计能达到10亿元苯丙氨酸与氮芥子气合成的苯丙氨酸氮芥子气对骨髓肿瘤治疗有效,且副作用低。（4）化学工业：谷氨基钠作洗涤剂,丙氨酸制造丙氨酸纤维（合成高分子化合物）。能保持皮肤湿润的润肤剂——焦谷氨酸钠和质量接近天然皮革的聚谷氨酸人造革，以及人造纤维和涂料。表3--8

世界氨基酸主要生产厂家生产能力品名厂家生产能力品名厂家生产能力蛋氨酸日本曹达20000谷氨酸味之素60000蛋氨酸日本住友化学5000谷氨酸日本旭化成15000蛋氨酸日本化药2500谷氨酸协和发酵15000蛋氨酸德国迪高沙85000谷氨酸日本武田药品15000蛋氨酸法国AEC105000色氨酸味之素100蛋氨酸美国孟山都45000色氨酸昭和电工200蛋氨酸墨西哥阿尔拜梅克斯5000色氨酸三井东压100蛋氨酸西班牙Sodeti4000色氨酸田造制药50蛋氨酸苏联Volgograd4000色氨酸日本化药50

色氨酸协和发酵50赖氨酸日本味之素55000甘氨酸日本有机合成化学6000赖氨酸日本协和发酵20500甘氨酸协和发酵5000赖氨酸日本东丽6500甘氨酸日本化药1000赖氨酸南朝鲜味元10000丙氨酸武藏野化学研究所——

丙氨酸日本化药——3、氨基酸的生产方法发酵法：直接发酵法：野生菌株发酵、营养缺陷型突变发酵、抗氨基酸结构类似物突变株发酵、抗氨基酸结构类似物突变株的营养缺陷型菌株发酵和营养缺陷型回复突变株发酵。包括添加前体发酵法：如用邻氨基苯甲酸，生产L-色氨酸；甘氨酸生产L-丝氨酸。酶法：利用微生物细胞或产生的酶来制造氨基酸。延胡索酸和铵盐为原料，经天冬氨酸酶催化生产L-天冬氨酸。提取法：常用毛发、血粉等蛋白质原料水解，从中提取。如胱氨酸、半胱氨酸和酪氨酸合成法：合成法获得DL-蛋氨酸、不对称合成法获得L-氨基酸。如丙氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸。传统的提取法、酶法和化学合成法由于前体物的成本高，工艺复杂，难以达到工业化生产的目的。第二节、氨基酸发酵菌株的育种是氨基酸代谢控制发酵的基本策略之一发酵工程要求微生物大量地合成特定的代谢产物，这一目的只有当微生物的部分代谢调控机制遭到破坏时才能达到。用人工诱变的方法有目的地改变微生物固有的调节机制，使合成产物的途径畅通无阻，最大限度地积累特定产物，这种发酵称为代谢控制发酵。1、用野生菌株的方法分离的野生菌株具备积累产物的特性，可用于直接发酵（产率低）。如谷氨酸发酵。通过转换发酵，可延伸获得其它产物。主要采用改变培养条件。如谷氨酸发酵中改变铵离子浓度、磷酸浓度，使谷氨酸转向谷氨酰胺和缬氨酸发酵。2.用用营养缺缺陷变异异株的方方法通过诱变变出菌体体内氨基基酸生物物合成某某步反应应阻遏的的营养缺缺陷型变变异体，，使生物物合成在在中途停停止，不不让最终终产物起起调控作作用。如用高丝丝氨酸缺缺陷株的的赖氨酸酸发酵，，谷氨酸酸缺陷株株的鸟氨氨酸发酵酵，异亮亮氨酸缺缺陷菌株株的脯氨氨酸发酵酵。谷氨酸棒棒状杆菌菌的苏氨氨酸、异异亮氨酸酸、甲硫硫氨酸和和赖氨酸酸的合成成是与分分枝途径径相联系系的(图图4-8)，筛筛选高丝丝氨酸营营养缺陷陷型后，，限量供供给苏氨氨酸时，，就能解解除由苏苏氨酸和和赖氨酸酸的协同同反馈抑抑制作用用，而获获得赖氨氨酸的过过量生产产。这是是因为仅仅有赖氨氨酸或苏苏氨酸存存在时，，天冬氨氨酸激酶酶不被抑抑制，只只有两者者的协同同效应才才能造成成抑制。。在限量量供给苏苏氨酸的的情况下下，即使使赖氨酸酸过剩，，抑制作作用也很很难发生生。3.类类似物抗抗性变异异株的方方法用一种与与自己想想获得的的氨基酸酸结构相相类似的的化合物物加入培培养基内内，使其其发生控控制作用用，从而而抑制微微生物的的生长。。这样，，就可以以得到在在这种培培养基中中能够生生长的变变异株，，而这种种变异株株正是解解除了调调控机制制的，能能够生成成过量的的氨基酸酸。利用此方方法发酵酵的有:苏氨酸酸、赖氨氨酸、异异亮氨酸酸、组氨氨酸和精精氨酸。。高丝氨酸酸脱氢酶酶例如，在在黄色短短杆菌的的赖氨酸酸、苏氨氨酸和异异亮氨酸酸生物合合成中（（图5-16所所示），，选育抗抗苏氨酸酸结构类类似物2-氨基基-3-羟基戊戊酸（AHVr）突变株株，得到到了具有有反馈抑抑制抗性性，高丝丝氨酸脱脱氢酶活活性提高高1300倍，，能积累累14g/L苏苏氨酸的的突变株株。4.体内内及体外基因因重组的方法法基因工程包括括细胞内基因因重组方法和和试管内的体体外基因重组组方法。体内基因重组组在应用上又又称为杂交育育种，主要方方法包括：转转化、转染、、接合转移、、转导和细胞胞融合等，这这都是在细胞胞内暂时地产产生染色体的的局部二倍体体，在两条DNA链之间间引起两次以以上的交叉，，是遗传性重重组现象。细胞内基因重重组技术的缺缺点是，现在在只在同种或或有近缘关系系的微生物之之间进行并较较难成功。代谢工程在阐明代谢途途径及其调控控规律的基础础上，应用重重组DNA技技术可以改变变代谢途径分分支点上的流流量或引入新新的代谢步骤骤与构建新的的代谢网络。。其主要步骤为为:鉴定目标代谢谢途径涉及的的酶(特别是是限速酶);取得酶基因，，必要时可用用蛋白质工程程技术，如定定点诱变，基基因剪接等，，使蛋白具有有新的特点(增强活性或或稳定性、解解除反馈抑制制等);将一种或多种种异源的或改改造后的酶基基因与调节元元件一起克隆隆进目标生物物;使调节元件的的作用及培育育条件最优化化。5、基因工程程菌通过基因工程程技术，构建建理想的工程程菌株5.1载体-受体系统及及克隆表达的的研究受体的获得目前使用的氨氨基酸工程菌菌受体主要是是大肠杆菌K-12及棒棒状杆菌家族族，通常是通通过诱变选育育出的基础产产率较高的菌菌株。大肠杆菌遗传传背景研究得得清楚，载体体系统完善，，利于工程菌菌的构建，但但它含有内毒毒素且不能将将蛋白产物分分泌至胞外，，为应用带来来困难。棒状杆菌能克克服这两个缺缺点，但载体体受体系统研研究较晚且有有限制修饰系系统的障碍，，所以获得利利于外源基因因导入及表达达且能稳定遗遗传的受体菌菌是尚待解决决的问题。5.2载体体的构建有效的载体需需要有在受体体菌中可启动动的复制起始始位点，这可可从棒状杆菌菌家族内源小小质粒中获得得;载体所需的筛筛选标记及外外源基因插入入的多克隆位位点，可从常常用的克隆载载体中获得。。5.3基因因转移手段通常采用的方方法有:原生生质体转化、、转导，电转转化，接合转转移。原生质体转化化的方法是较较早采用的方方法，由于受受到原生质体体再生条件的的局限，效率率不高;电转化方法由由于高效，快快速被广泛使使用，目前它它的转化效率率可达到原生生质体转化法法的100-1000倍倍。接合转移可用用于基因在亲亲缘关系远的的物种之间的的转移，并且且可将外源基基因整合于染染色体上，易易于稳定遗传传。第三节氨氨基酸发酵的的代谢控制控制发酵的条条件控制细胞渗透透性控制旁路代谢谢降低反馈作用用物的浓度消除终产物的的反馈抑制与与阻遏作用促进ATP的的积累，以利利氨基酸的生生物合成一、菌种的代代谢调控是氨基酸代谢谢控制发酵的的基本策略之之二1、控制发酵酵环境条件专性需氧菌，，控制环境条条件可改变代代谢途径和产产物。2、控制细胞胞渗透性生物素、油酸酸和表面活性性剂，引起细细胞膜的脂肪肪酸成分的改改变。细胞内生物素素水平高，Glu不能通通过细胞膜青霉素：抑制制细胞壁的合合成，由于细细胞面内外的的渗透压而泄泄露出来。表面活性剂增增加细胞膜通通透性氨基酸发酵必必须考虑的重重要因素细胞透性的调调节细胞透性的调调节，一般通通过向培养基基中添加化学学成分（如生生物素、油酸酸、甘油、表表面活性剂、、青霉素等，，达到抑制磷磷脂、细胞膜膜的形成或阻阻碍细胞壁的的正常生物合合成，使谷氨氨酸生产菌处处于异常生理理状态，解除除细胞对谷氨氨酸向胞外漏漏出的渗透障障碍。生物素：影响响磷脂的合成成及细胞膜的的完整性。油酸：直接影影响磷脂的合合成及细胞膜膜甘油：甘油缺缺陷型菌株丧丧失α-磷酸甘油油脱氢酶，不不能合成α-磷酸甘油和和磷脂。限量供应，控控制了细胞胞膜中与渗透透性直接关系系的磷脂含量量，使谷氨酸酸排出胞外而而积累。表面活性剂：：对生物素有有拮抗作用，，拮抗不饱和和脂肪酸的合合成，导致磷磷脂合成不足足，影响细胞胞膜的完整性性，提供细胞胞膜对谷氨酸酸的渗透性。。青霉素：抑制制细菌细胞壁壁的后期合成成，形成不完完整的细胞壁壁，使细胞膜膜失去保护，，使胞内外的的渗透压差导导致细胞膜的的物理损伤，，增大谷氨酸酸向胞外漏出出的渗透性、、生物素阻断脂肪酸的的合成影响细胞膜的的合成表面活性剂对生物素有拮拮抗阻断脂肪酸的的合成影响细胞膜的的合成在对数生长期期添加青霉素素抑制细胞壁合合成细胞膜损伤甘油缺陷型磷脂的合成受受阻影响细胞膜的的合成油酸缺陷型阻断不饱和脂脂肪酸的合成成影响细胞膜的的合成提高细胞膜的的谷氨酸通透性性控制磷脂的合合成使细胞膜受损损（如表面活活性剂）青霉素损伤细细胞壁，间接接影响细胞膜膜控制磷脂含量量通过油酸的合合成通过甘油合成成直接控制磷脂脂合成3、控制旁路路代谢4、降低反馈馈作用物的浓浓度利用营养缺陷陷型突变株进进行氨基酸发发酵必须限制制所要求的氨氨基酸的量。。限制瓜氨酸的的浓度可解除除反馈抑制，，实现鸟氨酸酸的生物合成成。5、消除终产产物的反馈抑抑制与阻遏作作用使用抗氨基酸酸结构类似物物突变株的方方法或者通过过选育营养缺缺陷型菌株。。6、促进ATP的积累，，以利氨基酸酸的生物合成成ATP的积累累可促进氨基基酸的生物合合成第四节、谷氨氨酸生物合成成及其发酵生生产调控代谢控制发酵酵是用遗传学或或其他生物化化学的方法，，人为地在分子水平平上改变和控控制微生物的的代谢，打破破微生物正常的代代谢调节，使使有用产物大大量生成和积积累。氨基酸发酵是是典型的代谢谢控制发酵，，发酵技术的的关键是打破微生物的的正常代谢调调节，人为控控制微生物的的代谢。一.谷氨酸的生物物合成途径异柠檬酸裂解酶α-酮戊二酸脱氢酶1、谷氨酸生生物合成中的的几个途径（（正常途径））（1）糖酵解解途径（EMP）（2）磷酸已已糖途径（（HMP)（3）三羧酸酸循环(TCA环)（4）乙醛酸酸循环（DCA环）（5）二氧化化碳固定反应应PEP+CO2+GTP草草酰乙酸+GDP丙酮酸+CO2+NADH苹苹果酸+NAD草草酰乙酸CO2NAD+NADH+H+（6））αα-KGA的的还还原原氨氨基基化化反反应应PEP羧羧化化酶酶苹果果酸酸酶酶苹果酸脱脱氢酶C6H12O6+NH3+O2→C5H9O4N+CO2+3H2O在GA产产生菌菌菌体内CO2固固定反应应有以下下两条途途径：①苹果酸酸酶②丙酮酸酸羧化酶酶③磷酸烯烯醇丙酮酮酸羧化酶酶CO2固固定反应应(丙酮酮酸羧化化支路)2、GA生物合合成的理理想途径径（1）GA产生生菌必须须具备以以下条件件（内在在因素）α-酮戊二酸脱氢酶的活性微弱或缺失TCA环阻断，α-酮戊二酸积累琥珀酸辅酶ATCA环正常

GA产生菌体内的NADPH的氧化能力欠缺或丧失积累NADPH，抑制α—KGA的脱羧氧化

GA产生菌体内必须有乙醛酸循环（DCA）的关键酶——异柠檬酸裂解酶通过该酶酶活性调节实现DCA循环的封闭，GA发酵积累菌体有强强烈的L—谷氨氨酸脱氢氢酶活性性α—KGA+NH4++NADPH==GA+NADP提供NADPH,用于于还原α-酮戊戊二酸生生成谷氨氨酸，形形成氧化化还原共共扼体系系该反应的的关键是是与异柠柠檬酸脱脱羧氧化化相偶联联3/2GlucoseEMP丙丙酮酮酸+丙丙酮酸酸+丙丙酮酸酸乙酰辅酶酶A+乙酰辅酶酶A+乙酰酰辅酶A柠檬酸则有：3/2C6H12O6+NH4+==C5H9O4N+4CO2产率：147/（180*3/2）==54.4%CO2谷氨酸在前述GA合合成所必必需的条条件的基基础上，，体系不不存在CO2固固定反应应，则有有：体系存在在CO2的固定反反应结论通过DCA环提提供C4二羧酸酸时谷氨氨酸对糖糖的转化化率仅为为54.4%在谷氨酸酸发酵中中，DCA环可可以作为为TCA循环有有缺陷时时C4二二羧酸的的补充.在前述述GA合合成所所必需的的条件的的基础上上（封闭闭乙醛酸酸循环））存在CO2固固定反应应，则有有：GlucoseEMP丙丙酮酸酸+丙丙酮酮酸CO2则有：C6H12O6+NH4+==C5H9O4N+CO2（来自何何方）产率：147/180==81.7%乙酰辅酶酶A+C4二二羧酸CO2草酰乙酸酸（草酰酰乙酸羧羧化酶））苹果酸（（苹果酸酸激酶））柠檬酸（（DCA循环封封闭）谷氨酸四碳二羧羧酸的来来源Δ在生产产菌中检检出CO2固定反应应酶活性性磷酸烯醇醇丙酮酸酸(PEF)羧羧化酶和和苹果酸酸酶谷氨酸对对糖的转转化率达达到81.7%C6H12O6+NH3+1.5O2──C5H9O4N+CO2+3H2O需要Mn+做催催化剂，，所以，，在GA发酵过过程中需需要向培培养基中中补充Mn+实际上，，发酵过过程中不不可能控控制柠檬檬酸合成成所需的的C4二二羧酸完完全来自自于CO2固定定反应，，体系也也不可能能完全不不存在CO2固固定反应应，因此此，GA发酵酵的糖酸酸转化率率应在：：54.4%———81.7%。目前前，国内内的GA生产企企业的糖糖酸转化化率通常常都在50%以以内：提高GA的潜力力是很大大的，具具体表现现在：（1）强强化CO2固定反应应，具体体措施：：Mn+，生物素素？（2）控控制溶氧氧浓度是是非常重重要的低的溶氧氧浓度，，则丙酮酮酸向乳乳酸方向向转化………高的溶氧氧浓度，，则NADPH有被被氧化的的可能，，……氨的导入入合成谷氨氨酸的反反应有3种：α-酮戊二酸+天冬氨酸或丙氨酸谷氨酸转氨酶AT谷氨酸α-酮戊二酸+α-酮戊二酸+谷氨酰胺NADPH+2谷氨酸NADP+谷氨酸合成酶GSα-酮戊二酸NH4+NADPH谷氨酸H2ONADP+谷氨酸脱氢酶GHD+++（2）影影响谷氨氨酸合成成的外在在因素a、生物物素对糖糖代谢的的影响生物素参参与糖代代谢作用用：增加糖代代谢的速速度(对对TCA有促进进作用））乳酸积累累碳源利用用率降低低，发酵酵液的pH值下下降。而丙酮酸氧化脱羧的速度未改变丙酮酸积累A、生物物素对GA发酵酵的影响响主要影响响糖降解解速度，，不影响响EMP与HMP途径径的比率率。生物物素充足足的条件件下，丙丙酮酸以以后的氧氧化活性性虽然也也得到提提高，但但由于糖糖降解速速度显著著提高，，打破了了糖降解解速度与与丙酮酸酸氧化速速度之间间的平衡衡，丙酮酮酸趋于于生成乳乳酸的反反应，引引起乳酸酸的溢出出。研究表明，异柠檬酸裂解酶活性

为醋酸诱导

受琥珀酸的阻遏，抑制当VH缺乏时：：（1）丙丙酮酸的的有氧氧氧化就会会减弱？？则：乙乙酰辅酶酶A的生生成量就就会少，，醋酸浓浓度降低低，它的的诱导作作用降低低；通过过控制生生物素亚亚适量，，几乎看看不到异异柠檬酸酸裂解酶酶的活性性（2）VH对TCA循环的的促进作作用的降降低，使使得其中中间产物物琥珀酸酸的氧化化速度降降低，其其浓度得得到积累累，这样样它的阻阻遏和抑抑制作用用加强；；乙醛酸酸循环基基本上是是封闭的的，代谢谢流向异异柠檬酸酸→α-酮戊二二酸→谷谷氨酸的的方向高高效率地地移动两者综合合的作用用使得，，异柠檬檬酸裂解解酶的活活性丧失失，DCA循环环得到封封闭。b、控制制VH的浓度，，以实现现对于乙乙醛酸循循环的封封闭c、生物物素对氮氮代谢的的影响VH丰富时，，出现““只长菌，，不产酸酸”的现象象GA发酵酵过程中中，前期期，菌体体的增殖殖期，一一定的量量的生物物素是菌菌体增殖殖所必需需的；而而在产物物合成期期，则要要限制生生物素的的浓度，，以保证证产物的的正常合合成。结论氨的导入入时生物素缺缺乏，NH4+影响糖代代谢速度度：提高高糖代谢谢速度高效合成成谷氨酸酸生物素充充足时，，NH4+不影响糖糖代谢速速度关于氮代代谢的调调节：控制谷氨氨酸发酵酵的关键键之一就就是降低低蛋白质质的合成成能力，，使合成成的谷氨氨酸不能能转化成成其他氨氨基酸或或参与蛋蛋白质合合成。在生物素素亚适量量的情况况下，几几乎没有有异柠檬檬酸裂解解酶，琥琥珀酸氧氧化能力力弱，苹苹果酸和和草酰乙乙酸脱羧羧反应停停滞，在在铵离子子适量存存在下，，生成积积累谷氨氨酸。生生成的谷谷氨酸也也不通过过转氨作作用生成成其他氨氨基酸和和合成蛋蛋白质。。在生物素素充足的的条件下下，异柠柠檬酸裂裂解酶活活性增强强，琥珀珀酸氧化化能力增增强，丙丙酮酸氧氧化力加加强，乙乙醛酸循循环的比比例增加加，草酰酰乙酸、、苹果酸酸脱羧反反应增强强，蛋白白质合成成增强，，谷氨酸酸减少，，合成的的谷氨酸酸通过转转氨作用用生成的的其他氨氨基酸量量增加。。d、VH对菌体细细胞膜通通透性的的影响通常谷氨氨酸发酵酵采用的的菌种都都是VH-，而VH又是菌菌体细细胞膜膜合成成的必必须物物质，，因此此，可可以通通过控控制VH的浓度度（干扰磷磷脂中中的脂脂肪酸酸的生生物合合成））来实现现的来来实现现对菌菌体细细胞膜膜通透透性的的调节节。。葡萄糖糖丙酮酸酸+丙酮酸酸乙酰辅辅酶A乙酰辅辅酶ＡＡ乙酰辅辅酶A羧化化酶（辅酶是是VH）CO2丙二酰酰辅酶酶A丙二酰酰辅酶酶AC4C6CO2培养基基中生生物素素限量量时，，胞内内AA92%胞外培养基基中生生物素素丰富富时，，胞内内AA12%胞外CO2Glu生产产菌大大多是是生物物素缺缺陷型型，发发酵时时控制制生物物素亚亚适量，使使细胞胞变形形拉长长，改改变了了细胞胞膜的的通透透性引引起代代谢失失调使Glu得以以积累累。生物素素贫乏乏时，，细胞胞内的的Glu含含量少少而且且容易易析出出，而而培养基中中积累累大量量的Glu；生生物素素丰富富时，，培养养基中中几乎乎不积累Glu，而而细胞胞内却却含有有大量量的Glu，且且不易易被析析出。。这说明明生物物素对对细胞胞膜通通透性性有重重要影影响。。谷氨酸酸发酵酵的关关键在在于发发酵培培养期期间谷谷氨酸酸生产产菌细细胞膜膜结构构与功功能发发生特特异性性变化化，使使细胞胞膜转转变成成有利利于谷谷氨酸酸向膜膜外渗渗透的的形态态，使使终产产物不不断排排出细细胞外外，胞胞内谷谷氨酸酸不能能积累累到引引起反反馈调调节的的浓度度，胞胞内谷谷氨酸酸源源源不断断被优优先合合成，，分泌泌到发发酵培培养基基中积积累。。B、供供氧浓浓度过量：：NADPH的再再氧化化能力力会加加强，，使αα-KGA的还还原氨氨基化化受到到影响响，不不利于于GA的的生成成。供氧不不足：：积累大大量的的乳酸酸，使使发酵酵液的的pH值下下降，，不利利于GA的的产生生，同同时，，一部部分葡葡萄糖糖转成成了乳乳酸，，影响响了糖糖酸转转化率率，降降低了了产物物的提提出率率。C、NH4+浓度（1））影响响到发发酵液液的pH值值（2））与产产物的的形成成有关关：过低，，不利利于αα-KGA的还还原氨氨基化化；过过高，，产生生谷氨氨酰胺胺。NH4+的的供给给方式式：（1））液氨氨（2））流加加尿素素D、磷磷酸盐盐过量：：（1）促促进EMP途径径，打打破EMP与TCA之间间的的平衡衡，积积累丙丙酮酸酸，产产生乳乳酸等等………（2））产生生并积积累Val，Glucose丙酮酸丙酮酸+活性乙醛α-乙酰乳酸ValVal（1））可以以抑制制葡萄萄糖丙丙酮酮酸，，使GA的的生物物合成成受到到阻止止（2））消耗耗了丙丙酮酸酸，降降低了了糖酸酸转化化率（3）发酵酵液中中的Val存在，，严重重的影影响GA的结晶晶、提提出研究证证明：：谷氨酸酸生产产菌种种存在在EMP途途径的的全部部酶和和HMP途途径有有关的酶TCA循环环中的的柠檬檬酸、、顺乌乌头酸酸、异异柠檬檬酸能能定量量地生生成谷氨氨酸，，其相相应的的酶与与谷氨氨酸合合成有有关以醋酸酸和乙乙醇为为原料料进行行谷氨氨酸发发酵时时，DCA循环环是C4二羧酸酸的唯唯一补补充来来源；；但是是以葡葡萄糖糖为原原料时时，在在谷氨酸生生成期期此循循环应应关闭闭谷氨酸酸菌存存在CO2固定生生成草草酰乙乙酸的的PEP羧羧化酶酶和苹苹果酸酶，，与谷谷氨酸酸得率率正相相关第五节节谷氨酸酸生物物合成成的调调节机机制一、谷谷氨酸酸生物物合成成的调调节①谷氨氨酸脱脱氢酶酶②-酮酮戊二二酸脱脱氢酶酶③磷酸酸烯醇醇丙酮酮酸羧羧化酶酶④柠檬檬酸合合成酶酶⑴优先先合成成在微生生物的的代谢谢中，，Glu比比Asp优优先合合成；；合成过过量时时则抑抑制谷谷氨酸酸脱氢氢酶，，使代代谢转转向合合成Asp；Asp过量量时反反馈抑抑制PEP羧化化酶的的活力力，停停止合合成草草酰乙乙酸。。⑵谷氨氨酸脱脱氢酶酶(GDH)的的调节节谷aa脱氢氢酶谷aa对其其反馈馈抑制制和反反馈阻阻遏⑶柠檬檬酸合合成酶酶的调调节柠檬酸酸合成成酶TCA的关关键酶酶，受受能荷荷调节节，谷谷aa反馈馈阻遏遏，乌乌头酸酸反馈馈抑制制所以，，正常常代谢谢不积积累Glu⑷异柠柠檬酸酸脱氢氢酶的的调节节细胞内内α-酮戊二二酸的的量与与异柠柠檬酸酸的量量需维维持平平衡。。当αα-酮戊二二酸过过量时时,将对异异柠檬檬酸脱脱氢酶酶发生生反馈馈抑制制作用用，停止合合成αα-酮戊二二酸。。异柠檬檬酸脱脱氢酶酶α-酮戊戊二酸酸反馈馈抑制制⑸α-酮戊戊二酸酸脱氢氢酶:谷氨酸酸产生生菌中中先天天性的的丧失失或微微弱。。⑹磷酸酸烯醇醇式丙丙酮酸酸羧化化酶PEP受天天冬aa反反馈抑抑制，，受谷谷aa和天天冬aa反馈馈阻遏遏丧失或或有微微弱的的-酮酮戊二二酸脱脱氢酶酶活力力，使使-酮戊戊二酸酸不能能继续续氧化化；CO2固定能能力强强，使使四碳碳二羧羧酸全全部由由CO2固定反反应提提供，，而不不走乙乙醛酸酸循环环；谷氨酸酸脱氢氢酶的的活力力很强强，并并丧失失谷氨氨酸对对谷氨氨酸脱脱氢酶酶的反反馈抑抑制和和反馈馈阻遏遏，同同时，，NADPH2再氧化化能力力弱，，这会会使-酮酮戊二二酸到到琥珀珀酸的的过程程受阻阻；有过量的NH4+存在，-酮酮戊二酸经氧氧化还原共轭轭氨基化反应应而生成谷氨氨酸却不形成成蛋白质，从从而分泌泄漏漏于菌体外；；同时，谷氨酸酸生产菌应不不利用体外的的谷氨酸，使使谷氨酸成为为最终产物。。生产菌株还应应该具有生物物素合成缺陷陷、油酸合成成缺陷和甘油油合成缺陷等等特点。二.谷氨酸酸高产菌模型型特征三、谷氨酸生生产的代谢调调控1.切断或减弱支支路代谢2.解除自身的反反馈抑制3.增加前体物的的合成4.提高细胞膜的的渗透性5.强化能量代谢谢6.利用基因工程程技术构建谷谷氨酸工程菌菌株（一）、谷氨氨酸生产菌的的具体育种思思路（谷氨酸代谢谢控制发酵的的基本方法和和实现的途径径）1.切断或减弱支支路代谢⑴选育减弱αα-酮戊二酸进一一步氧化能力力的突变株减弱α-酮戊二酸脱氢氢酶复合体的的活性，可以以使代谢流向向谷氨酸，从从而使谷氨酸酸得到积累。。⑵选育减弱HMP途径后段酶活活性的突变株株从葡萄糖到丙丙酮酸的反应应由EMP途径和HMP途径组成。但但通过HMP也可生成核糖糖、核苷酸、、莽草酸、芳芳香族氨基酸酸、辅酶Q、维生素K、叶酸等物质质。消耗了葡葡萄糖，使谷谷氨酸的产率率降低。如削削弱或切断这这些物质的合合成途径，就就会使谷氨酸酸的产率增加加。可通过选选育莽草酸缺缺陷型或添加加芳香族氨基基酸能促进生生长的突变株株以及抗嘌呤呤、嘧啶类似似物或核苷酸酸类抗生素，，如德夸菌素素、狭霉素C抗性突变株来来实现。⑶选育不分解解利用谷氨酸酸的突变株（不分解）积累谷氨酸，，必须使菌种种不能分解利利用谷氨酸，，可通过选育育以谷氨酸为为唯一碳源，，菌体不长或或生长微弱的的突变株来实实现。⑷选育减弱乙乙醛酸循环的的突变株四碳二羧酸是是由CO2固固定反应和乙乙醛酸循环所所提供的。减减弱乙醛酸循循环，CO2固定反应所所占的比例就就会增大，谷谷氨酸的产率率就高。可通通过选育琥珀珀酸敏感型突突变株、不分分解利用乙酸酸突变株、异异柠檬酸裂解解酶活力降低低菌株实现。。⑸阻止谷氨酸酸进一步代谢谢（不代谢）细胞还可以谷谷氨酸为前体体继续向下合合成谷氨酰胺胺等，必然导导致谷氨酸的的积累量减少少。要避免谷谷氨酸被菌体体利用，还需需要切断谷氨氨酸向下的代代谢途径。2.解除菌体自身身的反馈调节节⑴选育耐高渗渗透压突变株株菌种高产谷氨氨酸,应具备在高糖、、高谷氨酸的的培养基中能能正常生长、、代谢的能力力，即在高渗渗培养基中菌菌体的生长和和谷氨酸的合合成不受影响响或影响很小小。可通过选选育耐高糖、、耐高谷氨酸酸及耐高糖+高谷氨酸突变变株来实现。。⑵选育解除谷谷氨酸对谷氨氨酸脱氢酶反反馈调节的突突变株谷氨酸合成达达到一定量时时，谷氨酸会会反馈抑制和和阻遏谷氨酸酸脱氢酶，使使谷氨酸的合合成停止，使使代谢转向天天冬氨酸的合合成。若解除除了谷氨酸对对谷氨酸脱氢氢酶的反馈调调节，菌体就就会不断的合合成谷氨酸。。可通过选育育酮基丙二酸酸抗性、谷氨氨酸结构类似似物抗性（如如谷氨酸氧肟肟酸盐）、谷谷氨酰胺抗性性突变株来实实现。3.增加前体物的的合成⑴选育强化三三羧酸循环中中从柠檬酸到到α-酮戊二酸代谢谢的突变株这可通过选育育柠檬酸合成成酶活力强突突变株及抗氟氟乙酸、氟化化钠、重氮丝丝氨酸、柠檬檬酸抗性等突突变株来实现现。⑵选育强化CO2固定反应的突突变株这可通过选育育以琥珀酸或或苹果酸为唯唯一碳源生长长良好的突变变株、氟丙酮酮酸敏感突变变株以及丙酮酮酸或天冬氨氨酸缺陷突变变株来实现。。4.提高细胞膜的的渗透性⑴选育抗Vp类衍生物突变变株选育抗Vp类衍生物，如如香豆素、卢卢丁等突变株株，都能遗传传性的改变细细胞膜的渗透透性。生物素缺陷株株（生物素亚亚适量）⑵选育溶菌酶酶敏感突变株株。⑶选育二氨基基庚二酸缺陷陷突变株。⑷选育温度敏敏感突变株谷氨酸温度敏敏感突变株的的突变位置是是在决定与谷谷氨酸分泌有有密切关系的的细胞膜结构构基因上，发发生碱基的转转换或颠换，，一个碱基为为另一个碱基基所置换，这这样为该基因因所指导的酶酶，在高温下下失活，导致致细胞膜某些些结构的改变变。当控制培培养温度为最最适生长温度度时，菌体正正常生长；当当温度提高到到一定程度时时，菌体便停停止生长而大大量产酸。（5）油酸缺缺陷型（油酸酸亚适量）（6）甘油缺缺陷型（甘油油亚适量）5.强化能量代谢谢谷氨酸高产菌菌的两个显著著特点是:α-酮戊二酸继续续向下氧化的的能力微弱和和乙醛酸循环环微弱，使能能量代谢受阻阻，TCA循环前一阶段段的代谢减慢慢。强化能量量代谢可弥补补上述两点不不足，使TCA循环前一段代代谢加强，谷谷氨酸合成的的速度加快。。⑴选育呼吸吸链抑制剂抗抗性突变株如可选育丙二二酸、氧化丙丙二酸、氰化化钾、氰化钠钠抗性突变株株来实现。⑵选育ADP磷酸化抑制剂剂抗性突变株株如可选育2,4-二硝基酚、羟羟胺、砷、胍胍等抗性突变变株来实现。。（3）选育抑制能量量代谢的抗生生素的抗性突突变株如可选育缬氨氨霉素、寡霉霉素等抗性突突变株来实现现。第六节、谷氨氨酸的生产工工艺我国与国外谷谷氨酸生产的的现状及存在在问题菌种的性能：：我国产酸8.6－10％，转化率率55％；日日本10－12％，转化化率55％。。工艺和过程控控制：我国低低糖和中糖发发酵，日本高高糖发酵并流流加、提高罐罐压，保证溶溶氧。对温度、压力力、空气流量量、蛋白质、、溶氧采用计计算机控制。。一、谷氨酸生产菌菌的特征、育育种及扩大培培养（一）、谷氨氨酸生产菌的的主要特征与与菌学性质现有谷氨酸生生产菌主要是是棒状杆菌属属、短杆菌属属、小杆菌属属及节杆菌属属中的细菌。。1.棒状杆菌属(Corynebacterium)：谷氨酸棒棒杆核菌Cornebateiumgho-tamlkns）2.短杆菌属(Brevibacterium)：黄色短杆杆菌（Bteuibaterunflavum）、乳乳糖发酵短杆杆菌（Bra.lactofementum））3.小杆菌属(Microbacterium)：嗜氨小杆杆菌（Micrbateriumammoniaphilmn）4.节杆菌属(Arthrobacterium)菌种形态G属性呼吸类型碳源基质棒状杆菌属直或微弯，一端膨大。折断分裂呈八字排列或枷状排列，不运动G＋好氧或厌氧葡萄糖发酵产酸，少数利用乳糖产酸短杆菌属短的不分支直杆菌，多数不运动，少数运动有鞭毛。G＋好氧葡萄糖发酵产酸小杆菌属杆状，形态与排列与棒状杆菌相似G＋好氧发酵糖产酸弱，主要产乳酸，不产气节杆菌属培养过程细胞形态易变化，先由球菌变杆菌，随后由杆菌变球菌，不运动G＋变G－，后由G－变G＋好氧发酵糖产酸极少或不产酸。表1谷谷氨酸发酵微微生物特征及及菌学比较（二）、谷氨氨酸生产菌形形态与生理的的共同特征细胞形态为球球形、棒形以以至短杆形。。革兰氏染色阳阳性，无芽孢孢、无鞭毛、、不运动都是需氧形微微生物，在通通气条件下才才能产生谷氨氨酸。都是生物素缺缺陷型，需要要生物素作为为生长因子脲酶强阳性不分解淀粉、、纤维素、油油脂、酪蛋白白及明胶发酵中菌体发发生明显形态态变化和细胞胞渗透性的变变化CO2固定反应酶系系活力强，异异柠檬酸裂解解酶活力欠缺缺或微弱、乙乙醛酸循环弱弱，α-酮酮戊二酸氧化化能力缺失或或微弱；柠檬檬酸合成酶、、乌头酸酶、、异柠檬酸脱脱氢酶以及谷谷氨酸脱氢酶酶活力强，还还原性辅酶ⅡⅡ进入呼吸链链具有向环境中中泄漏谷氨酸酸的能力不分解利用谷谷氨酸，能耐耐受高浓度的的谷氨酸，产产量在5％以以上。（三）、国内谷氨酸生生产菌及其比比较1、北京棒杆杆菌(AS1299)的形态和生理理特征2、钝齿棒杆杆菌(AS1542)的形态和生理理特征3、天津短杆杆菌(T6-13)的形态和生理理特征4、北京棒杆杆菌(7338)与钝齿棒杆菌菌(B9)的比较5、天津短杆杆菌(T6-13)与钝齿杆菌(B9)的比较6、目前味精精行业采用的的主要菌株S9114华南理工大学学FD415上海复旦大学学TG961天津科技大学学二、谷氨酸生产菌菌在发酵过程程中的形态变变化1、种子的菌菌体形态斜面和一、二二级种子培养养在不同培养养条件下，细胞形态基本本相似。斜面面培养的菌体体较细小，一、二级种子子比斜面菌体体大而粗壮，革兰氏染色深深。多为短杆杆至棒杆状，有的微呈弯曲曲状，两端钝圆，无分枝；细胞排列呈单单个、成对及及“V”字形，有栅状或不规规则聚块；分裂的细胞大大小为0.7～0.9*1.0～3.4um。由由于于生生物物素素充充足足，繁殖殖的的菌菌体体细细胞胞均均为为谷谷氨氨酸酸非非积积累累型型细细胞胞。。2、、谷谷氨氨酸酸发发酵酵不不同同阶阶段段的的菌菌体体形形态态从谷谷氨氨酸酸发发酵酵中中菌菌体体形形态态的的变变化化来来看看，大致致可可以以分分为为长菌菌型型细细胞胞、转移移期期细细胞胞和产产酸酸型型细细胞胞3种不不同同时时期期的的细细胞胞形形态态.3、、谷谷氨氨酸酸发发酵酵感感染染噬噬菌菌体体后后的的菌菌体体形形态态发酵酵前前期期感感染染噬噬菌菌体体后后，菌体体细细胞胞明明显显减减少少，细胞胞不不规规则则，发圆圆、、发发胖胖,缺乏乏“Ｖ”字形形排排列列，有明明显显的的细细胞胞碎碎片片，严重重时时出出现现拉拉丝丝、、拉拉网网，互相相堆堆在在一一起起，几乎乎找找不不到到完完整整的的菌菌体体细细胞胞，类似似蛛蛛网网或或鱼鱼翅翅状状。。在发发酵酵中中、、后后期期感感染染噬噬菌菌体体后后，菌体体细细胞胞形形态态不不规规则则，边缘缘不不整整齐齐，有的的边边缘缘似似乎乎有有许许多多毛毛刺刺状状的的东东西西，有细细胞胞碎碎片片。谷氨氨酸酸发发酵酵过过程程中中菌菌体体形形态态变变化化及及代代谢谢特特征征发酵时间/h细胞类型细胞形态特征代谢特点0－8长菌形细胞菌体形态与种子相似，短杆、棒形、椭圆形，单个、成对，八字形，绝大多数为V形分裂耗糖加快，代谢旺盛，温度上升，产生CO2，菌体不产酸8－16转移期细胞细胞开始伸长、膨大，细胞边缘不完整、边缘褶皱，细胞形态急剧变化，由长菌形细胞转化成产酸形细胞生物素含量由“丰富转向贫乏”通风量达到最大值，OD达到最大值并稳定，放热也达到最大值，菌体开始产酸16－30产酸期细胞细胞形态几乎都伸长、膨大，伸长拉大2－4倍，不规则，缺乏八字形排列大量积累谷氨酸，耗糖、好氨与产酸相适应，风量逐渐下降三、、菌种种的的扩扩大大培培养养和和种种子子的的质质量量要要求求斜面菌种一级种子培养二级种子培养

发酵罐

1.种子子培培养养过过程程菌种种：：菌菌种种钝钝齿齿棒棒杆杆菌菌和和北北京京棒棒杆杆菌菌及及各各种种诱诱变变株株。。生长长特特点点：：糖糖质质原原料料，，需需氧氧，，以以生生物物素素为为生生长长因因子子。。斜面面培培养养基基：：蛋蛋白白胨胨、、牛牛肉肉膏膏、、氯氯化化钠钠组组成成的的pH7.0-7.2琼琼脂脂培培养养基基，，32℃℃培培养养18-24h。。一级级种种子子培培养养：：由由葡葡萄萄糖糖、、玉玉米米浆浆、、尿尿素素、、磷磷酸酸氢氢二二钾钾、、硫硫酸酸镁镁、、硫硫酸酸铁铁及及硫硫酸酸锰锰组组成成。。pH6.5-6.8。。1000ml三三角角瓶瓶装装量量200－－250ml，，震震荡荡，，32℃℃，，培培养养12h。。二级级种种子子培培养养：：用用种种子子罐罐培培养养，，料料液液量量为为发发酵酵灌灌投投料料体体积积的的1％％，，用用水水解解糖糖代代替替葡葡萄萄糖糖，，于于32℃℃进进行行通通气气搅搅拌拌7－－10h。。2、、种种子子质质量量要要求求一级级种种子子质质量量标标准准：：一一级级种种子子为为摇摇瓶瓶种种子子。。质量要要求：：显微镜镜检查查，无无杂菌菌，菌菌体粗粗壮、、均匀匀、排排列整整齐涂平板板检查查无杂杂菌、、无噬噬菌斑斑OD值值净增增0.6左左右。。种子营营养液液pH在6.7左右右种子营营养液液残糖糖在0.5%以以下。。二级种种子质质量标标准：：二级级种子子为生生产车车间的的种子子罐中中培养养的。。对其其质量量要求求平板检检查无无杂菌菌、无无噬菌菌体污污染，，菌体体大小小均一一，呈呈单个个或八八字排排列。。活菌数数108－109/ml。pH在在7.2左左右，，残残糖含含量在在1.5左左右。。其它各各项指指标与与一级级种子子相同同。种龄和和种量量的控控制一级种种子控控制在在11-12h，二二级控控制在在7-8h。种量为为1％％。过过多，，菌体体娇嫩嫩，不不强壮壮，提提前衰衰老自自溶，，后期期产酸酸量不不高。。四、谷谷氨酸酸的生生产工工艺磷酸盐盐、玉玉米浆浆、镁镁盐等等分过滤滤器发酵灌灌调和配料预处理理（水解解）发酵培培养基基调pH连消菌种罐罐等电沉沉淀粗谷氨氨酸中和摇瓶菌菌种原料种子培培养基基空气斜面尿素贮贮罐空气净净化系系统脱色结晶浓缩成品味味精（一））、谷氨酸酸发酵酵工艺艺流程程淀粉葡萄糖糖糖蜜稀释蜜蜜配料料种种子罐罐玉米浆浆糖蜜蜜磷酸二二氢钾钾硫酸镁镁无菌空空气Fe2+、Mn2+NH3菌种发酵罐罐等电提提取中和和除铁铁脱色色浓缩、、结晶晶离心心干燥燥味精精发酵罐罐Na2CO3（二））、原原料的的预处处理1.淀粉水水解糖糖的制制备：：酸水水解或或酶水水解酸水解解法调浆：：干淀淀粉用用水调调成10-110Bx的的淀粉粉乳，，加盐盐酸0.5-0.8％至至pH1.5。。糖化：：蒸汽汽加热热，加加压糖糖化25min。冷冷却至至80℃下下中和和。中和：：烧碱碱中和和，至至pH4.0-5.0脱色：：活性性炭脱脱色和和脱色色树脂脂。活活性炭炭用量量为0.6-0.8％，，在70℃℃及酸酸性条条件下下搅拌拌后过过滤。。酶法：：以大大米或或碎米米为原原料时时采用用调浆配配料：：大米米进行行浸泡泡磨浆浆，将将淀粉粉乳调调成15－－20°Bè，，用Na2CO3调pH6.4-6.5，，用CaCl2调节浆浆中的的Ca2+至50mg/L。加加细菌菌a-淀粉粉酶（（10－12u/g，干干淀粉粉计算算)。喷射液液化：：一次次喷射射温度度100－－105℃℃，层层流罐罐维持持95－100℃，，液化化时间间1h。典典色反反应棕棕红色色。液液化液液经二二次喷喷射，，维持持温度度130－－140℃℃，灭灭酶5－10min，再再经板板式换换热器器冷却却至70℃℃以下下，进进入糖糖化罐罐。糖化：：糖化化温度度60±1℃，pH4.0-4.4；糖糖化酶酶（100－120u/g，干干淀粉粉计算算)糖化过滤：：糖液液先用用Na2CO3水溶液液调pH4.8-5.0，过过滤。。糖化液液的质质量要要求色泽淡淡黄黄色透透明液液糊精反反应无无还原糖糖含量量25－28％％DE值值95－－98％透光率率60％％pH4.6-5.0淀粉转化化率95－－98％％糖蜜原料料：不宜宜直接用用来作为为谷氨酸酸发酵的的碳源，，因含丰丰富的生生物素。。预处理方方法：活活性碳或或树脂吸吸附法和和亚硝酸酸法吸附附或破坏坏生物素素。也可可以在发发酵液中中加入表表面活性性剂吐温温60或或添加青青霉素。。(三)、、谷氨酸酸发酵控控制发酵培养养基1、碳源源：葡萄萄糖、果果糖、蔗蔗糖、麦麦芽糖作用：菌体生长长繁殖；；新陈代代谢的能能源；产产生a-硐戊二二酸转化化为谷氨氨酸低中糖发发酵：初初始糖浓浓度12.5-13%.中高糖发发酵：初始糖浓浓度14-16%。补糖发酵酵：初始始糖浓度度12-13%，中后后期补糖糖2-4％。目前，较较多采用用低糖浓浓度流加加发酵控控制。碳碳源浓度度过高时时，对菌菌体生长长不利，，氨基酸酸的转化化率降低低。2、氮源源：无机氮源源:(1)尿尿素(2)液氨氨(3)碳酸氢氢铵；有机氮源源:玉米米浆、麸麸皮水解解液、、豆饼水水解液和和糖蜜等等。作用：是是合成菌菌体、蛋蛋白质、、核酸等等含氮物物质和合合成氨基基酸来源源氮源；；调节pH尿素灭菌菌时形成成磷酸铵铵镁盐，，须单独独灭菌，，分批流流加。氨水用pH自动动控制连连续流加加C:N，，谷氨酸酸发酵所所需比为为100：15～213、无机机盐：磷酸盐、、硫酸酸镁、、钾盐盐、微微量元素素作用：构构成细胞胞成分，，酶的组组成成分分；激活活或抑制制酶活性性；调节节培养基基渗透压压；调节节培养基基的pH；调节节培养基基的氧化化还原电电位。磷酸盐：：对发酵酵有显著著影响，，不足时时糖代谢谢受抑制制。控制制在0.005-0.01mol/L硫酸镁：：是已糖糖磷酸化化酶、柠柠檬酸脱脱氢酶和和羧化酶酶的激活活剂，促促进葡萄萄糖-6-磷酸酸脱氢酶酶活力。。G＋要求镁离离子浓度度最低25ug/L；G-要求4-6ug/L。钾盐：钾钾盐多，，有利于于产酸；；钾盐少少，有利利于菌体体生长微量元素素：主要要是锰（（许多酶酶的激活活剂）、、铁（细细胞色素素、细胞胞色素氧氧化酶和和过氧化化氢酶活活性基团团组分，，可促进进谷氨酸酸产生菌菌的生长长），10-6－10-4mol/L。严严格控制制铜、汞汞含量，，以免对对发酵产产生毒害害作用。。4、生长长因子：：主要参参与细胞胞膜的代代谢，进进而影响响膜的透透性。(1)生生物素素（2－－5ug/ml））(2)维生生素B1生物素：：乙酰CoA的的辅酶，，参与脂脂肪酸的的生物合合成，影影响磷酯酯的合成成。当磷酯含含量减少少到正常常时的一一半左右右时，细细胞发生生变形，，谷氨酸酸能够从从胞内渗渗出，积积累于发发酵液中中。生物素过过量，则则发酵过过程菌体体大量繁繁殖，不不产或少少产谷氨氨酸，你你谢产物物中乳酸酸和琥珀珀酸明显显增多。。当生物物素缺乏乏时，菌菌种生长长缓慢。。因此，，一般将生生物素控控制在亚亚适量条条件下，，才能得得到高产产量的谷谷氨酸。。成分菌种AS-1.299AS-1.542B9D110糖12.512.51015玉米浆0.5～0.70.5～0.70.3磷酸氢二钠0.170.170.160.35硫酸镁0.06～0.070.070.06Fe2＋、Mn2＋初尿1.8～2.01.01.03.4流加尿1～1.21.8～2.21.8～2.2pH7.07.06.86.7表4—1不不同生产产菌谷氨氨酸发酵酵培养基基配方（四）谷氨酸发发酵工艺艺控制1、温度对谷谷氨酸发发酵的影影响微生物在在一定条条件下，都有一个个最适的的生长温温度范围围。谷氨氨酸产生生菌的最最适生长长温度为为30～32℃，产生谷氨氨酸的最最适为34～37℃。菌体体生长期期温度过过高,易造成成菌体衰老老。生产产上表现现为OD值增长慢慢，pH值高，耗糖慢，发酵周期期长，谷氨酸生生成少。。在发酵酵中、后后期，菌菌体生长长基本停停止，适适当提高高温度可可促进产产生谷氨氨酸。因因此根据据菌种特特点，温温度采用用二级或或三级管管理。即即发酵前前期控制制在30-32℃；中中、后期期34-37℃℃。菌种AS-1.299617AS-1.542T6-13生长温度30－32℃30－34℃32－34℃32－36℃发酵温度34℃34～36℃34～36℃36～38℃表4—2菌菌谷氨酸酸产生菌菌的培养养温度发酵阶段发酵前期发酵中、后期pH控制7.57.2－7.42、pH对氨氨基酸发发酵的影影响及其其控制作用机理理：主要要影响酶酶的活性性和菌的的代谢。。控制pH方法：：流加尿尿素和氨氨水流加方式式：根据据菌体生生长、pH变化化、糖耗耗情况和和发酵阶阶段等因因素决定定控制：（1）菌菌体生长长或耗糖糖慢时，，少量多多次流加加尿素，，避免pH过高高（2）菌菌体生长长或耗糖糖过快时时，流加加尿素可可多些，，以抑制制菌体生生长。（3）发发酵后期期，残糖糖少，接接近放罐罐时，少少加或不不加尿素素，以免免造成氨氨基酸提提取困难难。（4）氨氨水对pH影响响大，应应采取连连续流加加。3、供氧对谷谷氨酸发发酵的影影响溶解氧的的控制：：大小是由由通风与搅拌两方面决决定的，，与搅拌拌器的型型式、直直径大小小、搅拌拌转速、、搅拌器器在发酵酵罐内的的相对位位置因素素等有关关。一般般搅拌器器直径大大，转速速快，溶溶氧系数数大。所所以，增增大搅拌拌转速比比增加通通风量对对溶氧系系数提高高更为显显著。具体操作作：发酵前期期，以低低通风量量为宜；；发酵中、、后期，，以高通通风量为为好。当培养基基浓度高高、营养养丰富、、生物素素用量大大时，应应采用高高通风量量。当菌菌体生长长缓慢、、pH偏偏高时，，应减少少通风量量，或停停止搅拌拌，以利利于长菌菌。当菌菌体生长长快、耗耗糖快时时，应提提高通风风量，以以抑制生生长和满满足合成成谷氨酸酸所必须须的足够够能量。。项目发酵罐容积10m320m350m3搅拌转速（r/min）160140110通风比（m3/m3·min）1:0.16～0.171:0.151:0.12具体风量量：前期期1:0.12（V/V)；；中期1:0.22-0.26；后后期1:0.15-0.18发酵通风风量的控控制4、泡沫的消消除（1）泡泡沫的形形成和性性质搅拌与通通风发酵液中中含有蛋蛋白胨、、玉米浆浆、黄豆豆粉是主主要的发发泡剂。。发酵液感感染杂菌菌和噬菌菌体（2）泡泡沫对发发酵的影影响发酵灌的的装料系系数减少少氧传递系系数减少少发酵液逃逃液，增增加染菌菌机会（3）泡泡沫的消消除（控控制）调整培养养基的成成分（少少加或缓缓加宜起起泡的原原材料））；改变变某些物物理化学学参数（（pH、、温度、、通气和和搅拌；；改变发发酵工艺艺采用机械械消泡或或消泡剂剂消泡机械消泡泡：利用用机械振振动或压压力变化化使泡沫沫破裂消泡剂：：属表面面活性剂剂，天然然油脂（（豆油、、玉米油油）；脂脂肪酸和和酯类；；聚醚类类（氧化化丙烯和和氧化乙乙烯与甘甘油的聚聚合物））；硅酮酮类5、发酵酵过程主主要变化化及中间间代谢控控制1.适应期2.对数生长长期3.转化期4.产酸期谷氨酸的的发酵过过程曲线线（1）适适应期：：尿素分解解出氨使使pH上上升。糖糖不利用用。2-4h。。措施：接接种量和和发酵条条件控制制使适应应期缩短短。（2）对对数生长长期：糖耗快，，尿素大大量分解解使pH上升，，氨被利利用后pH又迅迅速下降降。溶氧氧急剧下下降后维维持在一一定水平平。菌体体浓度迅迅速增大大，菌体体形态为为排列整整齐的八八字形。。不产酸酸。12h。措施：及及时供给给菌体生生长必须须的氮源源及调节节pH，，维持温温度30-32℃（3）菌菌体生长长停止期期：谷氨酸合合成。措施：提提供必须