枸杞多糖对CCl4引起的建鲤急性肝损伤的保护作用,渔业论文

枸杞多糖对CCl4引起的建鲤急性肝损伤的保护作用,渔业论文肝脏是鱼体内最大的本质性器官，其功能很强大，对来自体内外的很多非营养性物质，如各种药物、毒物以及体内某些代谢产物等有生物转化作用［1］，具有很好的解毒功能和代谢功能，因而，肝脏更容易遭到外环境、病毒、细菌等因素的影响。当前，随着集约化养殖的不断发展，难免会出现对鱼类日常管理的疏忽，如强化投饲和乱用药物，饲喂霉变饲料等［2］，而这些因素会对鱼类肝脏造成比拟严重的损害，出现以肝胆综合症为主要特征的鱼类疾病，即所谓的鱼类肝病(Theliverdiseaseoffishes)［3］。关于本病，并没有有效地治疗药物，死亡率较高，且治疗主要是以西药为主，而西药容易出现药物残留等问题，会间接影响鱼的品质，进而影响到人类的健康，因而研究开发出绿色环保的中成药就显得迫在眉睫。近年来，由于中草药具有绿色无污染、毒副作用小，以及能够提高机体的免疫和防御功能等特点［4］，现已广泛的应用于水产动物的病害防治及健康养殖中［5－6］。枸杞(LyciumchinenseMill-er)为茄科枸杞属(LyciumLinn．)植物，含有多糖、粗蛋白、亚油酸等多种营养成分，而枸杞多糖(Lyciumbarbarumpolysaccharide，LBP)为枸杞中的主要活性成分之一［7］。当代药理研究表示清楚，枸杞多糖具有护肝、保卫生殖系统、降血脂、降血糖、免疫调节等多种功能［8－11］。当前，关于枸杞多糖的研究报道主要有:王远吉［12］研究发现，枸杞多糖能够提高鲫鱼血清溶菌酶活力，且与枸杞多糖呈浓度依靠性关系。宋毅等［13］研究发现，枸杞多糖能够加强机体非特异性免疫功能。然而，水产领域有关枸杞多糖的保肝作用却鲜有报道。四氯化碳(CCl4)作为一个评价天然药物保肝作用的肝毒性模型药物，已广泛应用于科学研究当中。本研究以化学药物CCl4来进行造模，通过测定一些肝功能生化指标的变化来评价枸杞多糖对建鲤急性肝损伤的保卫作用，为枸杞多糖在水产肝胆疾病的防治提供理论根据。1材料与方式方法1．1材料1．1．1供试鱼建鲤来自于中国水产科学院淡水渔业研究中心渔场，体质健康，6月龄，大小规格基本一致，150g左右，饲养于循环水系统中，25oC，商品饲料(40%粗蛋白、10%粗脂肪、10%灰分、能量21KJg－1DM)饲喂一周，天天投喂2次。1．1．2药品和试剂枸杞多糖(Lyciumbarbarumpolysaccharide，LBP)购自南通四海植物提取有限公司。谷丙转氨酶(GPT)、谷草转氨酶(GOT)、乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物岐化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)、白蛋白(Alb)、谷胱甘肽(GSH)及总抗氧化能力(T-AOC)等试剂盒购自于南京建成生物工程研究所科技有限公司;总蛋白(TP)测定试剂盒购自于碧云天生物技术研究所。CCl4(分析纯)购于国药集团化学试剂有限公司。1．2方式方法1．2．1枸杞多糖的提纯枸杞多糖通过经典的水煮醇沉方式方法［14－15］分离提纯:取300g粗枸杞多糖室温下浸润于1000mL超纯水中过夜处理，然后加热煎煮2h用定性滤纸过滤除去不溶杂质，上清液进行离心(500g，10min)，再用0.22m的过滤器进行过滤，将上清液收集起来，用乙醇进行3次沉淀。其间有絮状沉淀产生，静置1h，将静置后固形物依次以95%乙醇、无水乙醇、丙酮洗涤除杂，待絮状沉淀分离出来后，转速2500rmin－1，离心时间3min，95%乙醇洗涤沉淀3次，在温度为80oC的烘箱中烘干。1．2．2分组及处理将循环水系统内饲养1周的建鲤随机分为6组，分别设为空白对照组(CK)、模型组(CCl4)、枸杞多糖药物对照组(LBPCK)、处理组(枸杞多糖0.1，0.5，1.0gkg－1组)，华而不实CK组及CCl4模型组:饲喂普通商品饲料;枸杞多糖药物对照组(LBPCK):饲喂含1.0gkg－1枸杞多糖的饲料;处理组:分别饲喂含0.1，0.5，1.0gkg－1枸杞多糖的饲料。天天投喂2次，每次投喂量为试验鱼质量的2%。饲喂60d后，Ctrl组及LBPCtrl组腹腔注射橄榄油，CCl4组及加药处理组经腹腔注射含30%CCl4的橄榄油，每10g鱼注射0.05mL，注射72h后采肝组织及血样。1．2．3样品处理(1)制备血清。所有试验鱼经尾部静脉采血后，血样于5000rmin－1离心5min，收集血清，－20℃储藏备用，测定TP、GOT、GPT、LDH、Alb等生化指标。(2)制备肝组织匀浆。采血后试验鱼解剖取肝，置于预冷生理盐水中漂洗，滤纸拭干后按肝重∶生理盐水体积=1∶9的比例参加生理盐水后匀浆研磨，3000rmin－1离心10min，收集上清，－20℃储藏备用，测定GSH、SOD、CAT、GSH-Px、T-AOC及MDA等生化指标。1．2．4数据分析试验数据采用平均值标准误差表示，采用SPSS19.0软件包中的One-way-ANOVA(单因素方差分析)进行分析处理。P＜0.05为显着差异;P＜0.01为极显着差异。2结果与分析2．1枸杞多糖对CCl4致建鲤肝损伤血清中GPT、GOT及LDH的影响如此图1所示，建鲤经CCl4作用后，血清内GPT、GOT及LDH含量显着比空白对照组高(P＜0.01)。饲喂含三种不同浓度枸杞多糖饲料后，GPT、GOT及LDH含量较CCl4组降低，枸杞多糖0.1gkg－1组作用不明显，0.5gkg－1组可显着抑制GPT酶活性，但对LDH及GOT活性降低没有显着作用;枸杞多糖1.0gkg－1对三种酶活性的降低都有显着作用，分别降低为CCl4组的73.4%，65.89%，63.13%。枸杞多糖对GPT、GOT及LDH酶活性的抑制作用呈现浓度依靠性，随着浓度的加大，呈现降低趋势。2．2枸杞多糖对CCl4致建鲤肝损伤血清中Alb和TP的影响【1】由图2能够看出，与空白对照组相比，血清中TP及Alb的含量因CCl4的作用而显着降低(P＜0.05)，饲喂3种不同浓度含枸杞多糖饲料后，TP和Alb含量的降低趋势被抑制，且TP有随着药物浓度增加，含量呈现升高趋势。在图2-A中，与CCl4组相比，枸杞多糖1.0gkg－1组，TP的降低趋势被明显的抑制(P＜0.05)，在图2-B中，枸杞多糖0.5gkg－1组对Alb的减少有显着抑制作用。【2】2．3枸杞多糖对CCl4致建鲤肝损伤组织匀浆上清中SOD、GSH-Px、MDA、GSH的影响如此图3-A，B所示，与空白对照组相比，CCl4组抗氧化酶(GSH-Px、SOD)含量显着降低(P＜0.05)。饲喂含不同浓度枸杞多糖饲料后，这些抗氧化指标降低的趋势得到抑制，华而不实枸杞多糖三个浓度组对SOD的降低有显着的抑制作用，枸杞多糖1.0gkg－1组对GSH-Px提高有显着作用。同时，枸杞多糖药物对照组与空白对照组相比，SOD的活力显着提高。如此图3-C，D所示，与空白对照组相比，用CCl4-植物油腹腔注射建鲤72h后，CCl4的损伤作用使得肝细胞受损，导致MDA大量的生成。【3】饲喂含枸杞多糖的饲料后，MDA的释放量得到有效的抑制。与CCl4组相比，枸杞多糖1.0gkg－1组对MDA的抑制作用显着(P＜0.05)。肝组织受损也引起了GSH含量的显着降低。饲喂含枸杞多糖饲料后，GSH的降低趋势被抑制，华而不实1gkg－1组对GSH含量的提高有显着作用(P＜0.05)。2．4枸杞多糖对CCl4致建鲤肝损伤组织匀浆上清中CAT及T-AOC的影响如此图4-A，B所示，与空白对照组相比，CCl4作用后使得肝组织匀浆上清中CAT及T-AOC的含量显着降低。饲喂含枸杞多糖饲料后，这些指标的含量得到了不同程度的提高。华而不实，0.5gkg－1枸杞多糖对CAT及T-AOC均有显着的提高作用(P＜0.05)，1.0gkg－1组显着提高了T-AOC的含量(P＜0.05)。【4】3讨论利用CCl4来制备肝组织损伤模型是一种比拟经典的损伤模型，常被用来挑选保肝药物。其造模机理主要是CCl4进入机体内经细胞色素P450酶进行代谢，产生三氯甲基自由基(CCl3)，三氯甲基自由基与氧反响生成氯甲基过氧化氢自由基(CCl3O2)等氧活性产物［13］，这些自由基通过攻击生物膜脂发生不可逆共价结合，导致脂质过氧化反响和氧化应激，进而毁坏细胞的膜构造［16－19］，造成了肝组织(细胞)的损伤与死亡。肝脏是物质和能量代谢的重要器官，富含大量的代谢酶，具有解毒、代谢等功能，一旦机体遭到损伤或药物等外界刺激，肝脏内相关指标就会发生一系列变化。LDH、GPT、GOT作为评价CCl4致肝损伤的标志性指标，可评价CCl4诱导的肝毒性及枸杞多糖的保肝作用［20］。由图1知，经CCl4作用后血清内的LDH、GPT、GOT含量明显增加，枸杞多糖1%浓度组抑制了其含量的增加。表示清楚枸杞多糖能显着抑制化学毒物引起的建鲤肝损伤。类似的结果在小鼠的肝损伤保卫中也有报道，DayeCheng等［21］曾在枸杞多糖对酒精致小鼠氧化应激的影响研究中以为，枸杞多糖对酒精致肝损伤引起的LDH及转氨酶含量的增加有明显的抑制作用。这种抑制作用可能与枸杞多糖促进微粒体膜的活性，减少胞浆内转氨酶外渗，进而维持肝微粒体功能，保证细胞构造的完好性有关［22］。建鲤肝组织经CCl4作用后，TP、Alb的含量出现明显下降，但用枸杞多糖饲喂的建鲤，这种降低被明显地抑制。邢雁霞等［23］也有相关类似的报道，枸杞多糖能够升高小鼠血清内CCl4引起的蛋白含量降低。这种保卫作用可能与枸杞多糖能够修复细胞内质网损伤，促进核糖体合成蛋白有关。MDA是膜脂质过氧化的重要产物，其含量高低是检测脂质过氧化的重要指标［24］。CCl4作用使得肝细胞受损，释放出大量MDA。饲喂含枸杞多糖饲料后，MDA含量明显减少，讲明枸杞多糖能够减少MDA释放量，提高抗脂质过氧化的能力。甘璐等［22］也曾报道，枸杞多糖可显着提高荷瘤鼠免疫细胞的活力及降低脂质过氧化值。这可能与枸杞多糖能够加强生物膜脂质的生物活性，降低自由基对细胞的亲脂攻击有关。GSH是一种低分子去除剂，在肝脏的生化代谢中发挥重要的作用，对自由基具有较强的去除作用，保卫肝细胞功能正常。机体遭到氧化损伤时，GSH不断消耗，以致自由基不能及时被去除，构成自由基的损伤［25］。由图3数据显示，枸杞多糖显着的抑制了肝损伤造成的GSH含量的降低。在对小鼠的研究中发现，枸杞多糖能够有效的抑制镉致大鼠肝氧化性损伤中GSH的降低［26］，这可能与GSH通过与GSH-Px共同作用，进而抑制脂质过氧化的发展，来阻断新自由基的产生有关。SOD、CAT、GSH-Px存在于所有的氧化代谢细胞内，作为自由基去除系统可防止自由基对细胞的损害并且对损害的细胞进行修复［22］。由图3和图4数据显示，枸杞多糖显着提高了这些抗氧化酶的活性。在小鼠体内试验表示清楚，枸杞多糖可通过一系列的生理生化机制，活化机体抗氧化酶，提高机体的抗氧化能力，进而保卫细胞免受自由基攻击。T-AOC是反响机体抵御自由基攻击，抗氧化能力强弱的关键指