黄曲霉毒素测定法-高效液相色谱法

中药制剂分析技术黄曲霉毒素测定法——高效液相色谱法ShandongCollegeofTraditionalChineseMedicine黄曲霉毒素测定法-高效液相色谱法黄曲霉毒素主要由曲霉菌黄曲霉、寄生曲霉、集封曲霉和伪溜曲霉四种真菌产生，是一组化学结构类似二氢呋喃香豆素的衍生化合物《中国药典》收载黄曲霉毒素检查法有：高效液相色谱法（第一法）和高效液相色谱-质谱法（第二法）。一、测定原理本法的基本原理为样品经有机溶剂提取、免疫亲和柱净化后，利用高效液相色谱分离，柱后碘衍生—荧光检测器或柱后光化学衍生—荧光检测器检测进行分析测定。黄曲霉毒素测定法——高效液相色谱法黄曲霉毒素测定法——高效液相色谱法二、仪器与用具高速匀浆器、振荡器、高效液相色谱系统、柱后衍生系统、光化学衍生器、离心机、超纯水处理系统、超声波提取器、黄曲霉总量（B1、B2、G1、G2）免疫亲和柱、固相萃取装置、离心管、具塞锥形瓶、刻度浓缩瓶、移液管、容量瓶等黄曲霉总量（B1、B2、G1、G2）免疫亲和柱高速匀浆器光化学衍生器黄曲霉毒素测定法——高效液相色谱法柱后衍生又称柱后反应(Post-columnDerivatization)，利用衍生反应使被测物与相应的试剂发生反应，以改变其物理或化学性质，使其被检测到。例如将发色基团或荧光基团键合到样品中去，多极放大检测灵敏度，柱后衍生系统开创了柱后衍生系统性能、价格及外形的新标准。柱后衍生系统固相萃取装置三、操作方法1.色谱条件与系统适应性试验填充剂：十八烷基硅烷键合硅胶流动相：甲醇-乙腈-水（40:18:42）检测方法：柱后衍生化：碘衍生法和光化学衍生法两个相邻色谱峰的分离度应大于1.5黄曲霉毒素测定法——高效液相色谱法2.混合对照品溶液的制备精密量取黄曲霉毒素混合对照品溶液（黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2标示浓度分别为1.0µg/ml、0.3µg/ml、1.0/µg/ml、0.3µg/ml）0.5ml，置10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，作为贮备溶液。精密量取贮备溶液1ml，置25ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得。黄曲霉毒素测定法——高效液相色谱法3.供试品溶液的制备供试品粉末15g加氢氧化钠3g75ml供试品甲醇溶液70%甲醇11000转/min搅拌2min2500转/min离心5min取上清15mL置50ml量瓶中水稀释至刻度，摇匀，微孔滤膜滤过取续滤液20ml通过免疫结合柱20ml水洗脱，3ml/min，弃洗脱液，再用适量甲醇洗脱收集洗脱液，置2ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度摇匀，即得供试品黄曲霉毒素测定法——高效液相色谱法4.测定法分别精密吸取上述混合对照品溶液5µl、l0µl、15µl、20µl、25µl，注入液相色谱仪，测定峰面积，以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，绘制标准曲线。另精密吸取上述供试品溶液20〜25µl，注入液相色谱仪，测定峰面积，从标准曲线上读出供试品中相当于黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2的量，计算，即得。黄曲霉毒素测定法——高效液相色谱法PHRE-15光化学衍生器衍生效果图黄曲霉毒素测定法——高效液相色谱-质谱法黄曲霉毒素测定法——高效液相色谱法图1：陈皮项目四种黄曲霉毒素标准样品色谱图（从左到右依次为G2，G1，B2，B1，浓度为0.75ppb，2.5ppb，0.75ppb，2.5ppb）图2：陈皮样品色谱图四、注意事项本实验应有相应的安全、防护措施，并不得污染环境。残留有黄曲霉毒素的废液或废渣的玻璃器皿，应置于专用贮存容器（装有10%次氯酸钠溶液）内，浸泡24小时以上，再用清水将玻璃器皿冲洗干净。当测定结果超出限度时，采用第二法进行确认。黄曲霉毒素测定法——高效液相色谱法1.高效液相色谱法测定黄曲霉毒素的原理是样品经有机溶剂提取、免疫亲和柱净化后，利用高效液相色谱分离，柱后碘衍生—荧光检测器或柱后光化学衍生—荧光检测器检测进行分析测定。2.黄曲霉毒素主要由曲霉菌黄曲霉、寄生曲霉、集封曲霉和伪溜曲霉四种真菌产生，是一