酪氨酸酶抑制剂筛选课件

酪氨酸酶抑制性实验

酪氨酸酶底物产物（++++++）多酪氨酸酶底物产物（++）少或无

抑制剂酪氨酸酶来源EC.1.14.18.1EC.1.10.3.2EC.1.10.3.1EC是各种酶的编号可在TheComprehensiveEnzymeInformationSystem（BRENDA）数据库中找到对应的酶信息

Enzyme-LigandInteractions酶信息Substrate/ProductInhibitorsKMValue

KiValueIC50ValuepHOptimum

酪氨酸酶概述酪氨酸酶（TYR）含铜酶是黑素代谢和儿茶酚胺的关键酶。酪氨酸酶活性高，黑色素生成增多。因此，抑制酪氨酸酶活性是有效减少黑色素生成的一种途径研究酪氨酸酶抑制剂主要运用于美容行业，防止植物水果的褐变症。酪氨酸酶结构中心的两个Cu+是活性中心抑制剂种类1.含酚基的化合物与酪氨酸酶的双铜离子活性中心结合,大多数是酪氨酸酶的竞争性抑制剂.2.芪类及其类似物

只有一个羟基取代基时,该羟基芪没有抑制酪氨酸酶的活性;当结构中有两个羟基时,对酪氨酸酶的抑制活性显著增强3.黄酮类物质

螯合酶活性中心的铜来抑制酶活力.4.醛类化合物羰基与酪氨酸酶活性中心周围的亲核基团，

形成稳定的螯合配体结构(席夫碱结构),生成的产物在酪氨酸酶的疏水性环境中能稳定存在,并在活性中心周围形成空间位阻,阻止底物与活性中心作用,从而抑制酪氨酸酶的催化活性,抑制黑色素的合成.实验原理

酪氨酸酶催化的反应为：475nm酶活的定义1.酪氨酸酶的酶活定义:以每分钟催化生成1umol多巴色素的酶量为一个活力单位。

通过测定酶催化反应体系OD475随时间的增长曲线,从曲线斜率即可得到酶活=106kv/ε

(k斜率v体积lε消光系数)

酶比活=106

kv/εm(k斜率,v体积L,ε消光系数,m酶质量mg

)2.剩余酶活％=Kt/K×100％3.抑制酶活％（被抑制的活力）=（K-Kt)/K×100％Kt=有抑制剂的曲线的斜率

K=没有抑制剂的曲线的斜率酶活的推导1.Beer定律A=kbc，公式A=kbckbc

εc

我们测得的动力学曲线斜率△A/t=ε△c/t=ε△M/tV

△M/t=△AV/tε△M/t=kv/ε

△M/t：每分钟多巴色素的生成（mol/min），等同于每分钟的分解量

酶活测量步骤1.抑制剂对酪氨酸酶单酚酶（二酚酶）影响

缓冲液（不含抑制剂）

记录每分钟

含底物缓冲液++酶液的OD值

不同浓度的抑制剂30度水浴10min对酪氨酸酶单酚酶（二酚酶）影响以OD值—时间作图曲线的切线反向延长与X轴相交点即为—延滞时间若均相交于一点—抑制剂对延滞时间没有影响若不交于一点—抑制剂对延滞时间有影响曲线1为无抑制剂的对照组曲线2—7抑制剂浓度由低到高切线斜率即为酶活延滞时间的原理（多巴为例）对酪氨酸酶单酚酶（二酚酶）影响Vss为酶的活力百分比=Vt/V×100％IC50即为酶失去一半活力时的抑制剂抑制剂浓度—延滞时间作图抑制剂浓度—Vss作图IC50结论上述三个图标我们可以得出几点结论1.抑制剂浓度对酶的延滞时间是否有影响？2.计算出酶的活力（酶的剩余活力）3.计算酶的抑制酶活4.酶的IC50酶在不同浓度抑制剂下的作用

该次的测量主要断定此抑制是否可逆？

酶浓度抑制剂浓度OD值

AE对照

AEAFAGAHBFBEBFBGBHCGCECFCGCHDHDEDFDGDH酶在不同浓度抑制剂下的作用以酶浓度—OD值作图

转换

酶浓度—酶活力（剩余活力）可逆性抑制作用1.曲线1-5代表不同浓度（有低到高）的抑制剂，曲线1不加抑制剂的对照组Y轴是酶活活力,是剩余酶活。所以酶活达不到1002.该图是可逆型的，酶活随抑制剂浓度上升而下降3.Vm值不变Km值随浓度上升而上升上图即为可逆型抑制不可逆性抑制作用Km值不变，Vm值与抑制剂量成反比，增大抑制剂量可使反应速度变为0抑制类型的判断

可逆型抑制类型分为1.竞争性抑制2.非竞争性抑制3.反竞争性抑制三种类型图示使1/v（酶速度）对1/S（酶浓度）作图，可以获得一条直线。抑制常数：1.Km为米氏常数2.Ki为与酶结合的抑制常数3.Kis为与酶底物复合物的抑制常数

Km值测定:米氏双倒数作图法

1.竞争性抑制

抑制剂和底物在结构上有某些相似之处，二者可能竞争与酶分子的同一部位结合。竞争性抑制一.特点：抑制剂与底物竞争酶的活性部位，当抑制剂与酶的活性部位结合后，底物就不能再与酶结合，同样反之。二.竞争性抑制的机理

1抑制剂与底物在结构上有类似之处

2可能结合在底物所结合的位点（如结合基团）上，从而阻断了底物和酶的结合

3降低酶和底物的亲和力。竞争性图

抑制剂只与酶结合Ki竞争：

两线K相交于（0，1/Vm）

曲线相交一点且在Y轴上Vm值不变，Km值随浓度

上升而变大以抑制剂浓度—该抑制剂曲线的截

距作图，该图的斜率即为Ki

2.非竞争性

非竞争性抑制剂和底物可能分别与酶的不同部位结合。抑制剂与酶的结合并不妨碍酶再与底物结合，但所形成的酶—底物—抑制剂复合非竞争性

1.非竞争性抑制作用：抑制剂不能与游离酶结合，但可与ES复合物结合并阻止产物生成，使酶的催化活性降低2.特点为：a.抑制剂与底物可同时与酶的不同部位结合；b.必须有底物存在，抑制剂才能对酶产生抑制作用；c.动力学参数

非竞争性

抑制剂既于酶又与底物结合KiKis非竞争：

两线K相交于（-1/Km，0）

曲线1-5抑制剂浓度逐渐上

升（曲线1为对照品）

曲线相交一点且在X轴上Km值不变，Vm值随浓度

上升而变小

非竞争性图1.以抑制剂浓度—该抑制剂曲线的斜率作图，该图的斜率即为Ki2.以抑制剂浓度—该抑制剂曲线的截距作图，该图的斜率即为Kis3.非竞争抑制中Ki，Kis的值是一致的3.反竞争性对酶活性的一种抑制作用，其特征是反应的最大速度比未加抑制剂时反应的最大速度低，当以速度的倒数相对底物浓度的倒数作图，所得图线与未被抑制反应的图线平行抑制剂只与酶-底物复合物结合，而不与游离酶结合的一种酶促反应抑制作用。反竞争性图

抑制剂只与酶底物复合物结合Kis反竞争：

两线K相差0.01截距相差0.1

Km值变小，Vmax值变小，但

Vmax/Km值不变

以抑制剂浓度—该抑制剂曲线的截