一种鼻咽癌筛查的新方法

一种鼻咽癌筛查的新方法

温鑫编写1《鼻咽部上皮细胞稳定性检测技术》鼻咽部渗液细胞游离亚铁原卟啉检测2

鼻咽癌在医学上也称鼻腔癌，在人的鼻腔之后，有一个腔道，通常称之为“鼻咽腔”。凡是生长在此处粘膜上的恶性肿瘤，一律称之为鼻咽癌。34好发部位

鼻咽顶后壁咽隐窝5粘膜下型鼻咽癌：鼻咽顶后壁及侧壁见一弥漫隆起的肿物。6结节型鼻咽癌：右侧咽隐窝的结节状鼻咽癌，肿物较大，挡住右后鼻孔，但未侵犯鼻腔。7结节型鼻咽癌8

菜花型鼻咽癌：右半腔菜花型鼻咽癌伴坏死9

浸润型鼻咽癌：右侧局限性浸润型癌10

混合型鼻咽癌：结节+浸润+溃疡坏死1112

鼻咽癌是中国常见的恶性肿瘤之中的一种，死亡率在癌症中排第8位。可从全世界范围来看，中国鼻咽癌的发病率却居世界之冠，据世界卫生组织的调查显示说明，世界上80%的鼻咽癌发生在中国。我国鼻咽癌的死亡率占全国恶性肿瘤死亡率的2.81%，总发病率约占全世界的80%之多，年发病率为10~25/10万，而全世界平均年发病率在1/10万以下；其男女发病之比约为2.5：1。13NPC发病率全国分布图14

在所有的恶性肿瘤中，鼻咽癌的治疗效果是比较好的。第一期的患者只要得到及时治疗，五年生存率可高达80%以上；即使是中晚期的鼻咽癌病人，只要未发生远处转移，五年生存率亦可达70%以上，有些患者可生存20年、30年甚至相当于正常寿命。15

由于鼻咽癌病因尚未完全清楚，无法进行一级预防，因此寄希望于二级预防，即早发现、早诊断与早治疗。鼻咽癌的预后与分期密切相关。粗略估计，鼻炎癌病人发现时的临床分期能够降低一期，则总的5年生存率可以提高20%。另外，早期治疗相对简单，费用低，生存质量也高。因此，提高鼻咽癌的早诊率是提高生存率的关键因素之一。16

为加强我国癌症的预防与控制工作，落实《中国癌症预防与控制规划纲要》（２００４—２０１０）的工作目标，在中央财政支持下，卫生部在2007年组织制定了《鼻咽癌早诊早治项目技术方案》，决定在部分省、直辖市开展癌症早诊早治项目。17

目前，国内外鼻咽癌诊断方法有：EB病毒壳抗原（VCA）血清学检查、血清EB病毒多种抗体检测、间接鼻咽镜、鼻咽纤维镜、间接鼻咽镜活检、直接鼻咽纤维镜活检鼻和咽细针穿刺活检。另外还有鼻咽及颈部MRI扫描和CT扫描。以上检查方法操作繁琐，不适于大规模筛查。因此，研发敏感性高、特异性强、经济便捷的鼻咽癌筛查技术非常迫切。18

使用《鼻咽部上皮细胞稳定性检测技术》进行鼻咽癌临床筛查，在鼻咽部上皮细胞异常增生及癌变起始阶段即可显示阳性结果，能发现早期病人，精准度高。该技术无采样创伤、无采样漏诊、无需仪器设备和专业实验室，可用于经济条件较弱的人群。该法操作简单，经费投入低，适合于大规模鼻咽癌普查活动。19

《鼻咽部上皮细胞稳定性检测技术》是通过检测鼻咽部渗液中是否含有细胞游离亚铁原卟啉（CellsFreeFerrousProtoporphyrinFH）而了解鼻咽部细胞是否癌变的一种检测技术。20

细胞游离亚铁原卟啉是鼻咽癌发生过程中产生的因果性生物标志因子。FH是含亚铁原卟啉蛋白的分解产物。FH具有强氧化作用，导致细胞自稳调节功能紊乱。

FH含量具有连续可测量性，且与细胞癌变程度呈密切正相关。采用直接生物学介质（鼻咽部渗液）进行靶向定位检测，即可显示鼻咽细胞恶变过程。21

诺贝尔奖获得者德国生物化学家奥托.海因里希.瓦博格（OttoHeinnichWarburg）发现肿瘤细胞的耗糖速度是正常细胞的10倍，却仅产生1/10的能量。肿瘤细胞主要通过磷酸戊糖途径产能，使即便在有氧情况下有氧氧化过程也不能对糖酵解产生抑制，这称为瓦博格氏效应（Warburgeffect）。

以6-磷酸葡萄糖开始，在6-磷酸葡萄糖脱氢酶催化下形成6-磷酸葡萄糖酸，进而代谢生成以磷酸戊糖为中间代谢物的过程，称为磷酸戊糖途径，简称PPP途径。反应部位：胞浆

重要反应产物：NADPH、5-磷酸核糖

限速酶（启动因子）：6-磷酸葡萄糖脱氢酶23

6-磷酸葡萄糖脱氢酶的活性与抑癌基因p53有关。p53基因因编码一种分子质量为53kDa的蛋白质而得名，是一种抑癌基因。一旦p53基因发生突变，P53蛋白失活，细胞分裂失去节制，发生癌变。24

在正常情况下,p53与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶相结合,抑制它的活性，阻止磷酸戊糖途径进行,细胞中的葡萄糖主要通过三羧酸循环产生能量。

在p53发生突变或缺失的肿瘤细胞中,失去了对葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的抑制,该酶作为戊糖磷酸途径的启动因子，使葡萄糖通过戊糖磷酸途径代谢。1、耗能；2、产生大量还原型辅酶Ⅱ（NADPH）,进行生物合成；3、改变细胞微环境。

致癌因素阻抑蛋白p53葡萄糖-6-磷酸脱氢酶P53突变突变的p53葡萄糖-6-磷酸脱氢酶葡萄糖-6-磷酸脱氢酶激活启动因子葡萄糖戊糖磷酸代谢途径TACNADPH果糖-6-磷酸3-磷酸甘油醛二氧化碳抑制瓦博格氏效应2728

细胞内氧化还原状态的变化在很大程度上受到GSH/GSSG的影响，它是机体的主要内源性氧化-还原调控因子，其-SH和-S-S-间的转换调控着许多生物大分子的活性，被称为“分子开关”。29

Warburg效应形成的细胞微环境紊乱

低氧（氧稳态紊乱）

酸性环境（酸碱平衡紊乱）

还原性状态（氧化-还原平衡紊乱）

FH位于细胞含亚铁原卟啉蛋白的肽链靠近表面的一个疏水核内，它主要依靠Fe2+与F8His的咪唑氮配位而挂在Pr链上。但是它之所以能固定在蛋白质的固定位置上而且取向一定，主要是因为还有大约21个残基逼近FH，距离在4A°之内，这些残基中有60多处与FH比较靠近，可以发生极性与非极性的相互作用，足以保持FH在细胞蛋白中的位置。

FH的极性部分丙酸基侧链伸向亲水的表面，在生理pH下解离成负离子，在α链中，有一个丙酸基与CD3His相连；在β链中，FH的两个丙酸基分别与CD3Ser和E10Lys相连。FH与肽链之间的静电引力对于维持FH在细胞含亚铁原卟啉蛋白中的位置有很大作用。

谷胱甘肽过氧化物酶以还原型谷胱甘肽(GSH)作为供氢体来分解H2O2，生成氧化型谷胱甘肽(GSSG)，使细胞内GSH:GSSG的比率下降。GSH生成GSSG过程中形成肿瘤细胞的低氧状态，激活氧感受器和缺氧信号传导通路。34

氧感受器分子导致蛋白质的巯基由氧化型向还原型转变，促使缺氧特异性转录因子-低氧诱导因子（hypoxia-induciblefactor；HIF）

HIF-1a的磷酸化并与HIF-1b结合而形成一个完整的HIF-1转录复合体，从而与相应靶基因上的缺氧反应元件(HRE)结合，促进基因的表达.并通过第二信使-活性氧族(ROS)与激酶系统发生联系，激活下游酶系统。35

细胞在代谢过程中通过Fenton反应产生产生一系列活性氧族（reactiveoxygenspecies,ROS），包括：O2-、H2O2及HO2·、·OH等。ROS可双向调控细胞的凋亡和增殖，机体内的自由基通过其浓度调节着机体细胞的生死平衡，对转录因子的激活以及对细胞增殖的促进。36

由于瓦格博效应，在低氧诱导因子（hypoxiainduciblefactor，HIF）的介导下，血管内皮生长因子（VEGF）mRNA转录和稳定性增加，且VEGF受体表达上调，VEGF的生物学效应增强。其表达的结果是增加血管分支形成,增强血流量。

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HIF-1a、ROS、VEGF表达上调，使一种亲脂性物质（Hydrophilicfattymolecules）进入细胞含亚铁原卟啉蛋白疏水核内，它所带的负电荷中和了肽链上His、Lys所带的正电荷，使它们不再与FH丙酸基侧链保持静电吸引，从而使FH在细胞蛋白中脱落。

瓦博格效应NADPH增加GSH增加激活氧感受器和缺氧信号传导通路缺氧特异性转录因子HIF-1a活性增强激活第二信使-ROS与激酶系统EPO基因表达水平升高NADPH氧化酶H2O2下降cGMP抑制激活鸟苷酸环化酶VEGF表达上调血红素氧合酶及NOS活性抑制内源性CO及NO下降FH释放39

代谢改变

HIF-1

VEGF不典型增生癌前病变原位癌浸润癌细胞增生

形态学改变低氧、还原态

ROS瓦博格效应

α链CD3His

β链CD3Ser、E10Lys酶蛋白

FH

p53等基因突变

致癌因素

Hfm细胞高增生低凋亡低分化低氧代谢通路致癌因素细胞能量代谢重编程细胞内环境紊乱细胞形态紊乱细胞功能紊乱氧稳态紊乱酸碱平衡紊乱氧化-还原态平衡紊乱细胞周期功能紊乱线粒体功能紊乱囊泡运输功能紊乱表型遗传修饰机制紊乱细胞对称分裂抑制机制紊乱干细胞不对称分裂机制紊乱细胞癌变瓦博格氏效应41

采用一种脂溶性较强的物质，使之很容易进入细胞与细胞器中，其与FH物质的氧化-还原产物使上皮细胞内含有的内源性过氧化物酶等酶染色。作为筛查手段，观察鼻咽部渗液上皮细胞中FH物质对细胞内酶的染色情况，即可显示鼻咽部上皮细胞是否存有恶变及其程度。因细胞内酶的差异，同一含量FH显色可能略有不同。43

【判定标准】

一、阴性(细胞游离亚铁原卟啉含量低于0.5ng/ml）：不变色。二、弱阳性(细胞游离亚铁原卟啉含量0.5~5ng/ml）：无色变为淡蓝色或黄绿色。三、阳性(细胞游离亚铁原卟啉含量5~200ng/ml）：蓝绿色或蓝色。

四、强阳性(细胞游离亚铁原卟啉含量200ng/ml以上）：深蓝色五、若标本即刻显深蓝色后转为深黄色或棕红色，表明标本内内混有血液，亦应视为强阳性。即刻显深蓝色是FH的征象，转为深黄色或棕红色是血液的征象。46

技术特色1、细胞游离亚铁原卟啉是一种因果性生物标志因子，是细胞稳定性失调、肿瘤发生过程细胞代谢变化的必然产物。因而用以检测鼻咽癌敏感度高。2、本技术采用直接生物