核酸检测基础技术

各类材料的DNA与RNA各类材料的DNA与RNA化学化工与生

教生物科学与技 用于核酸抽提的标 与预处 核酸抽提中需要去除的PCR抑制核酸纯化的DNA提取的原理与方RNA提取的原理与方miRNA提取原理与方提取核 核酸提取标用于核酸抽提的临床标本的处理和保核酸提取是临床PCR检验最为关键的部临床PCR检验操作中标标标 时间对扩增检测结果的影响（过早或过晚可能会出现 结果标 部位的准备（适 标本的类型 采样质量的评价（评价方法：肉眼观察、显微镜下观察和化分析采样标

容器中的防污染

无菌器材,防腐剂,抗凝剂无菌容器，防止混入操作者发，表皮等，如玻璃容器要高压灭菌全痰唾液（全痰唾液（口腔/咽拭子•棉拭尿粪骨组（浆（浆DNA测定：可按照一般 标本处理程序，对测定影RN测定 ，指血液凝固后，在血浆中除去纤维蛋白分离出的淡黄色透指纤维蛋白已被除去血浆（Plasma）是血液的液体成分，血细胞悬浮于快提取RNA。破红细加入3倍体积的破红细冰浴收集白细收集白细痰痰痰属于分泌物, 常用作为结核杆菌DNA测定标本 本进行初步处理，即用1mol/LNaOH或变性剂液化。如用于非结核杆菌如 支原体的PCR检测痰标本只能室温悬浮于生理盐中，充分振荡混匀，促使大块粘状下，上清离，得到的淀物即用核酸提。液化标本如不立即用于核酸提取,可保存于-70通用模简单模（1）通用标本处理（UniversalsampleprocessingUSP）液4-6mol/L盐酸胍50mmol/LTris-HCl,25mmol/L0.5%十二烷基肌酸钠（Sarkosyl0.1~0.2mol/Lβ-巯基乙（2）0.05%Tween80（3）10%Chelex-100(0.03TritonX-100和0.3Tween

收集菌

DNA分离。加入5倍10%chelex-100，混匀，90℃温育试剂：（1）裂解液:含终浓度0.1mol/LNaOH、50μg酶K和0.05%TritonX-唾液（口腔/唾液（口腔/咽拭子 沉淀用于DNA抽提。或利用Qiagen（天根）等公司开发 在使用PCR方法检 病原体时,临床标本一般棉拭子,可将棉拭子置于适量生理盐水中,充分震荡尿尿 预处理过程也很简单，只需将5mL尿3000rpm离心10分钟，收集细胞沉淀即粪粪增，粪便本身的众多杂质也会导致背景DNA的干,除去除去大颗粒杂↓↓↓收集收集菌↓↓洗涤菌洗涤菌↓↓↓收集收集纯化的菌↓

脱

脱 裂

抽 生理盐水洗两次,然后将其捣碎或切碎，加入生理盐水后盐水将组织洗一次,切成宽度小于1cm的小片,加入适量的石蜡切片用于核酸提取,需先用辛烷或二甲苯脱蜡,再用 内源性的:免疫球蛋白、蛋白酶、血红素及其代在标本中加入肝素酶I1-3U/μg核酸(于5mMTrispH7.5,1mMCaCl2,40URNase25℃21%(V/V)血液可完全抑制Taq酶活NaOH处理可中和临床标本中的TaqDNA聚合酶抑制剂，但加入0.6%(wt/vol)牛 TaqDNA聚合酶的抑制效应，既使在2%（vol/vol）血液存BSA也可增加TaqDNA和肉类标本中抑制物的抵抗能力分别提高10和20•单链DNA结合 核酸分离纯化技术于二十世纪五十年代，在处理、提取及乙醇沉淀等步骤。一般核酸提取试剂促使靶核酸从细胞内释出核酸的DNARNA和核苷酸都是极性化合物在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱碱性溶液中天然状态的DNA是以脱氧核 白(DNP)形式存在于细胞核中DNP和RNP（核 白）在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响而不同。 主要试1M化钠溶液，氯常用的方法是用1M氯化钠抽提,得到的DNP粘液与含有少量辛醇的 也可用0.15MNaCL液反复洗涤细胞破碎液除去RNP,再以提取脱氧核糖蛋白,再按氯仿---异醇法除去蛋白主要试剂：苯用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA联结键已断,蛋白利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀DNA。此时DNA 用于DNA用于DNAChelex100：在低离子强度、碱性及煮沸的条件下，可以使细胞xDNA分离。用于DNA用于DNA基带负DEAE带正电DNA可以在0.1～1.4mol/L的相当大的盐浓度范围内仍与DEAE合,当低盐溶液平衡纯化柱后,即可加样,用利用裂解液促使细胞破碎，使细胞中的把吸附在特定载体上的核酸洗脱下来RNARNA提取的RNA提取所用器皿的处RNA提取所用溶液的准RNA提取中RNaseRNA提取的临床标本及 环境中,存在大量对RNA具有强烈用N，Rs高。如何避免RNase对标本的污染及防止RNase对提取RNARNA经高压灭菌 使用的塑料制品如试管,离心管等基上无RNase,可以不经预处理，直接用 RNA 180℃干烤8小时以上,或用0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)的水溶液浸泡用于RNA的烧杯,试管和其它用品。DEPC是RNase的强烈抑制剂。灌满DEPC的器皿于37℃下放置后高压蒸汽下15分钟。上述处理可除去器皿上痕量的RNARNA对于RNA提取所需溶液的配制,必须用高压灭菌的水和RNA研究的化学试剂配制溶液,用干烤过的药匙称取试剂,将溶液装入无RNase的玻璃器皿。可能的话,溶液均应用的Tris试剂以无RNase的溶液。RNA提取中RNaseRNA提取中RNase在准备用于RNA纯化的实验材料和溶液时,以及在涉及RNA的整个提取操作过程中,都应戴手异异酸胍结合氯仿-酚抽提Trizol方法胍盐提取结合玻璃粉、二氧化硅等异硫酸胍结合氯仿-酚抽提法异硫酸胍结合氯仿-酚抽提法异硫酸胍是一种强有力的蛋白质变性剂， 富富 颗↓↓↓弃上清，加500µl裂解液（含异硫酸胍、-β巯基乙醇等）↓↓↓↓↓↓↓↓Trizol一步法提取Trizol一步法提取Trizo能完全抑制To酸胍、βRsR酶）。To能保持N回收RNATRIzol提取TRIzol提取样本预组织样再加少量液氮，再研磨，如此三次，按50-100mg组织/mlTrizol加入Trizol，2匀浆：组织样品按50-100mg/mlTrizolTrizol，用电动匀浆器充分匀浆2细胞可直接收集、裂解，每1mlTrizol可裂解5×106动物、植物或酵母 ↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓胍盐结合玻璃粉提取Ambion公司的mirVanamiRNAIsolationKit是最早上市 miRNAmiRNARNAisoforsmallRNA（Takara公司TrizoLC）RRtN和5RRrz完全mN。核酸提取的产率：可在A260核酸纯度：可通过提取物A260/A280比率判RNA的RIN值：通过Agilent2100 测 分光光度（紫外吸收）法检测DNA质度。纯的DNA溶液其OD260/OD280应为1.8，OD260/OD280大于1.9时，表明有RNA污染；小于1.6时表明有