植物生理学预习报告-植物过氧化物酶活性的测定预习报告

植物过氧化物酶活性的测定预习报告一、实验目的过氧化物酶普遍存在于植物组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能有一定关系，它在代谢中调控IAA水平，并可作为一种活性氧防御物质，消除机体内产生的H2O2的毒害作用。故在科研上常加以测定。二、实验原理在过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶竭色4—邻甲氧基苯酚，在470nm波长处测定生成物的吸光度（A）值，即可求出该酶活性。三、材料设备与试剂.材料：植物叶片.仪器设备：分光光度计；离心机；离心管；研钵；移液管；移液管架；试管;试管架；洗耳球。.试剂及配制：0.lmol・L-1磷酸缓冲液（pH7）：反响液（100ml0.Imol・L—1磷酸缓冲液（pH6）中加入0.5ml愈创木酚、1ml30%H202,充分摇匀）。四、实验步骤.酶液提取称取植物叶片1g,剪碎置于已冷冻过的研钵中，加入少量石英砂，分两次加入总量为10mlpH7磷酸缓冲液，研磨成匀浆后，倒入离心管中，在8000r/min离心15min,上清液即为粗酶提取液，倒入小试管低温下放置备用。.酶活性测定吸取反响液3ml于试管中，加入酶提取液0.02ml（视酶活性可增减加入量），迅速摇匀后倒入光径1cm的比色杯中，以未加酶液之反响液为空白对照，在470nm波长处，以时间扫描方式，测定3min内吸光度值变化，取线性变化局部，计算每分钟吸光度变化值（△A470）。五、记录结果并计算按下式计算酶的相对活性△A47o义酶提取液总量（ml）酶活性「•g4Fw•min］）=样品鲜重（g）X测定时酶液用量（ml）六、主要设备工作原理和操作步骤.分光光度计的工作原理：分光光度计采用一个可以产生多个波长的光源，通过系列分光装置，从而产生特定波长的光源，光线透过测试的样品后，局部光线被吸收，计算样品的吸光值，从而转化成样品的浓度。样品的吸光值与样品的浓度成正比。单色光辐射穿过被测物质溶液时，被该物质吸收的量与该物质的浓度和液层的厚度（光路长度）成正比，其关系如下式：A=-lg（I/Io）=-lgT=kLc式中：A为吸光度；Io为入射的单色光强度；I为透射的单色光强度；T为物质的透射率；k为摩尔吸收系数；L为被分析物质的光程，即比色皿的边长；c为物质的浓度；物质对光的选择性吸收波长，以及相应的吸收系数是该物质的物理常数。当某纯物质在一定条件下的吸收系数后可用同样条件将该供试品配成溶液，测定其吸收度，即可由上式计算出供试品中该物质的含量。在可见光区，除某些物质对光有吸收外，很多物质本身并没有吸收但可在一定条件下加入显色试剂或经过处理使其显色后再测定，故又称比色分析。由于显色时影响呈色深浅的因素较多，且常使用单色光纯度较差的仪器，故测定时应用标准品或对照品同时操作。分光光度计的操作步骤：1.接通电源，翻开仪器开关，掀开样品室暗箱盖，预热10分钟。.将灵敏度开关调至〃1〃档（假设零点调节器调不到〃0〃时，需选用较高档。）.根据所需波长转动波长选择钮。.将空白液及测定液分别倒入比色杯3/4处,用擦镜纸擦清外壁,放入样品室内,使空白管对准光路。.在暗箱盖开启状态下调节零点调节器，使读数盘指针指向t=0处。.盖上暗箱盖，调节〃100〃调节器，使空白管的t=100,指针稳定后逐步拉出样品滑竿，分别读出测定管的光密度值，并记录。.比色完毕，关上电源，取出比色皿洗净，样品室用软布或软纸擦净。考前须知.该仪器应放在干燥的房间内，使用时放置在坚固平稳的工作台上，室内照明不宜太强。热天时不能用电扇直接向仪器吹风，防止灯泡灯丝发亮不稳定。.使用本仪器前，使用者应该首先了解本仪器的结构和工作原理，以及各个操纵旋钮之功能。在未按通电源之前，应该对仪器的平安性能进行检查，电源接线应牢固，通电也要良好,各个调节旋钮的起始位置应该正确，然后再按通电源开关。.在仪器尚未接通电源时，电表指针必须于〃0〃刻线上，假设不是这种情况，那么可以用电表上的校正螺丝进行调节。L离心机的工作原理：当含有细小颗粒的悬浮液静置不动时，由于重力场的作用使得悬浮的颗粒逐渐下沉。粒子越重，下沉越快，反之密度比液体小的粒子就会上浮。微粒在重力场下移动的速度与微粒的大小、形态和密度有关，并且又与重力场的强度及液体的粘度有关。象红血球大小的颗粒，直径为数微米，就可以在通常重力作用下观察到它们的沉降过程。此外，物质在介质中沉降时还伴随有扩散现象。扩散是无条件的绝对的。扩散与物质的质量成反比，颗粒越小扩散越严重。而沉降是相对的，有条件的，要受到外力才能运动。沉降与物体重量成正比，颗粒越大沉降越快。对小于几微米的微粒如病毒或蛋白质等，它们在溶液中成胶体或半胶体状态，仅仅利用重力是不可能观察到沉降过程的。因为颗粒越小沉降越慢，而扩散现象那么越严重。所以需要利用离心机产生强大的离心力，才能迫使这些微粒克服扩散产生沉降运动。离心就是利用离心机转子高速旋转产生的强大的离心力，加快液体中颗粒的沉降速度，把样品中不同沉降系数和浮力密度的物质别离开。2.离心机的操作步骤:1、使用各种离心机时，必须事先在天平上精密地平衡离心管和其内容物，平衡时重量之差不得超过各个离心机说明书上所规定的范围，每个离心机不同的转头有各自的允许差值，转头中绝对不能装载单数的管子，当转头只是局部装载时，管子必须互相对称地放在转头中，以便使负载均匀地分布在转头的周围。2、假设要在低于室温的温度下离心时。转头在使用前应放置在冰箱或置于离心机的转头室内预冷。3、离心过程中不得随意离开，应随时观察离心机上的仪表是否正常工作，如有异常的声音应立即停机检查，及时排除故障。4、每个转头各有其最高允许转速和使用累积限时，使用转头时要查阅说明书，不得过速使用。每一转头都要有一份使用档案，记录累积的使用时间，假设超过了该转头的最高使用限时，那么须按规定降速使用。5、装载溶液时，要根据各种离心机的具体操作说明进行，根据待离心液体的性质及体积选用适合的离心管，有的离心管无盖，液体不得装得过多，以防离心时甩出，造成转头不平衡、生锈或被腐蚀，而制备性超速离心机的离心管，那么常常要求必须将液体装满，以免离心时塑料离心管的上部凹陷变形。每次使用后，必须仔细检查转头，及时清洗、擦干，转头是离心机中须重点保护的部件，搬动时要小心，不能碰撞，防止造成伤痕，转头长时间不用时，要涂上一层上光腊保护，严禁使用显著变形、损伤或老化的离心管。七、容易产生误差的环节及考前须知1.使用离心机时，必须事先在天平上精密地平衡离心管和其内容物。植物过氧化物酶活性的测定预习报告一、实验目的生物体内的一局部氧分子，在参与酶促或非酶促反响时，假设只接受一个电子,会转变为超氧阴离子自由基（02—）。02—既能与体内的蛋白质和核酸等活性物质直接作用，又能衍生为H202羟自由基（・0H）、单线态氧（102）等。可以引发不饱和脂肪酸脂质（RH）过氧化反响，产生一系列自由基，如：脂质自由基（・R）、脂氧自由基（R0•）、脂过氧自由基（R00•）和脂过氧化物（R00H）,自由基积累过多时会对细胞膜及许多生物大分子产生破坏作用。本实验主要掌握植物体内氧自由基的测定原理及方法。。二、实验原理在生物体中，氧作为电子传递的受体，得到单电子时，生成超氧阴离子自由基（02—）o利用羟胺氧化的方法可以测定生物系统中02—含量。02—与羟胺反响生成N02-,N02一在对氨基苯磺酸和a一蔡胺的作用下，生成粉红色的偶氮染料（对一苯磺酸一偶氮一a一蔡胺）。取生成物在530nm波长处测定吸光度（A）值，根据A530值可以算出样品中02—含量。反响式如下：NH2OH+2O2"+h+-NO2-+H2O2+H2O三、材料、设备及试剂.材料：花生、绿豆、大豆黄化幼苗的下胚轴及其他植物叶片.仪器设备：高速冷冻离心机；分光光度计；恒温水浴锅；研钵；试管；移液管；试管架；移液管架；洗耳球等。.试剂：50mmol-L-1磷酸缓冲液（pH7.8）1mmol•L—1盐酸羟胺17mmol-L-1对氨基苯磺酸（以冰醋酸：水二3：1配制）7mmol-L-la—蔡胺（以冰醋酸：水=3：1配制）50nmol•ml-lNaN02母液四、实验步骤.提取液制备称取1g植物叶片放入冰浴的研钵中，加入50mmol-L-1磷酸缓冲液（pH7.8）5ml,研磨成匀浆，在1000r/min,4℃下离心lOmin,取上清液再以15000r/min,4c下离心20min,第二次上清液即为样品提取液。.亚硝酸根标准曲线的制作1系列浓度NaN02溶液的配制取50nmol•ml—lNaN02母液，分别稀释成0、10、20、30、40和50、nmol•ml-1的标准稀释液。.2取7支试管，编0-6号，分别加10、15、20、30、40、50、nmol-nil-lNaN02标准稀释液1mL0号管加蒸储水1mL然后各管再加50mniol•L-1磷酸缓冲液1mL17mmol•L—1对氨基苯磺酸1ml和7mmol•L—1a一蔡胺1mL置于25℃显色20min后，以0号管作空白对照，在530nni波长处测定吸光度（A）值。.3标准曲线绘制以1〜6号管亚硝酸根（N02-）浓度为横坐标，吸光度值作纵坐标，绘制标准曲线。02—含量测定取4支试管，编0〜3号，1〜号管分别加入样品提取液0.5ml（三个重复），0号管加蒸储水0.5mL然后各管加入50mmol-L-1磷酸缓冲液0.5ml,1mmol•L—1盐酸羟胺1ml,混匀，置于25℃lh后，各管再加入17mmol・L-1对氨基苯磺酸1ml和7mmol•L—1a—秦胺1ml,混匀，置于25℃显色20min,以0号管为空白对照，在530nm波长处测定吸光度（A）值。五、记录并计算结果根据所测得的A530值，从标准曲线上查得样品中NO2一浓度，按公式（1）即可计算出样品中NO2一浓度。然后依据羟胺与一的上述反响，从N02一对一进行化学计量，按公式（2）计算，即将按公式（1）计算得到的N02一浓度乘2,得。2一浓度。也可根据被测样品与羟胺反响的时间和样品中蛋白质含量，按公式（3）求得。2一的生产率。从标准曲线查得1\1。2-（nmol）X提取液总量（ml）TOC\o"1-5"\h\zNO2含量（nmol•g_1Fw）=（1）样品重（g）X测定时提取液用量（ml）将所得NO2一含量代入下式计算，即求出。2一含量。。2一含量二NO?（nmol•g-1Fw）X2（2）将公式（2）所得的。2一浓度及样品中蛋白质含量，依下式计算出。2一产生速率。O2(nmol)O2产生速率（nmol•mg1蛋白■minD=（3）蛋白质（mg）X反响时间（min）六、主要设备工作原理和操作步骤.分光光度计的工作原理：分光光度计采用一个可以产生多个波长的光源，通过系列分光装置，从而产生特定波长的光源，光线透过测试的样品后，局部光线被吸收，计算样品的吸光值，从而转化成样品的浓度。样品的吸光值与样品的浓度成正比。单色光辐射穿过被测物质溶液时，被该物质吸收的量与该物质的浓度和液层的厚度（光路长度）成正比，其关系如下式：A=-lg（I/Io）=-lgT=kLc式中：A为吸光度；Io为入射的单色光强度；I为透射的单色光强度；T为物质的透射率；k为摩尔吸收系数；L为被分析物质的光程，即比色皿的边长；c为物质的浓度；物质对光的选择性吸收波长，以及相应的吸收系数是该物质的物理常数。当某纯物质在一定条件下的吸收系数后可用同样条件将该供试品配成溶液，测定其吸收度，即可由上式计算出供试品中该物质的含量。在可见光区，除某些物质对光有吸收外，很多物质本身并没有吸收但可在一定条件下加入显色试剂或经过处理使其显色后再测定，故又称比色分析。由于显色时影响呈色深浅的因素较多，且常使用单色光纯度较差的仪器，故测定时应用标准品或对照品同时操作。分光光度计的操作步骤：1.接通电源，翻开仪器开关，掀开样品室暗箱盖，预热10分钟。.将灵敏度开关调至〃1〃档（假设零点调节器调不到〃0〃时，需选用较高档。）.根据所需波长转动波长选择钮。.将空白液及测定液分别倒入比色杯3/4处,用擦镜纸擦清外壁,放入样品室内,使空白管对准光路。.在暗箱盖开启状态下调节零点调节器，使读数盘指针指向t=0处。.盖上暗箱盖，调节〃100〃调节器，使空白管的t=100,指针稳定后逐步拉出样品滑竿，分别读出测定管的光密度值，并记录。.比色完毕，关上电源，取出比色皿洗净，样品室用软布或软纸擦净。考前须知.该仪器应放在干燥的房间内，使用时放置在坚固平稳的工作台上，室内照明不宜太强。热天时不能用电扇直接向仪器吹风，防止灯泡灯丝发亮不稳定。.使用本仪器前，使用者应该首先了解本仪器的结构和工作原理，以及各个操纵旋钮之功能。在未按通电源之前，应该对仪器的平安性能进行检查，电源接线应牢固，通电也要良好,各个调节旋钮的起始位置应该正确，然后再按通电源开关。.在仪器尚未接通电源时，电表指针必须于〃0〃刻线上，假设不是这种情况，那么可以用电表上的校正螺丝进行调节。L离心机的工作原理：当含有细小颗粒的悬浮液静置不动时，由于重力场的作用使得悬浮的颗粒逐渐下沉。粒子越重，下沉越快，反之密度比液体小的粒子就会上浮。微粒在重力场下移动的速度与微粒的大小、形态和密度有关，并且又与重力场的强度及液体的粘度有关。象红血球大小的颗粒，直径为数微米，就可以在通常重力作用下观察到它们的沉降过程。此外，物质在介质中沉降时还伴随有扩散现象。扩散是无条件的绝对的。扩散与物质的质量成反比，颗粒越小扩散越严重。而沉降是相对的，有条件的，要受到外力才能运动。沉降与物体重量成正比，颗粒越大沉降越快。对小于几微米的微粒如病毒或蛋白质等，它们在溶液中成胶体或半胶体状态，仅仅利用重力是不可能观察到沉降过程的。因为颗粒越小沉降越慢，而扩散现象那么越严重。所以需要利用离心机产生强大的离心力，才能迫使这些微粒克服扩散产生沉降运动。离心就是利用离心机转子高速旋转产生的强大的离心力，加快液体