发酵工业与发酵工程固定化酶与固定化细胞发酵

发酵工业与发酵工程固定化酶与固定化细胞发酵一、固定化酶的定义与优点所谓固定化酶，是指在一定的空间范围内起催化作用，并能反复和连续使用的酶。固定化酶的优点：（1）同一批固定化酶能在工艺流程中重复多次地使用；（2）固定化后，和反应物分开，有利于控制生产过程，同时也省去了热处理使酶失活的步骤；（3）稳定性显著提高；（4）可长期使用，并可预测衰变的速度；（5）提供了研究酶动力学的良好模型。1、固定化酶的活力在大多数情况下比天然酶下降，其专一性也会受到影响发生改变。活力下降的原因：

酶分子在固定化过程中，酶的空间构像发生了变化，甚至活性中心的氨基酸也会参加反应。

固定化后的空间障碍效应的影响。

内扩散阻力的影响使底物分子与活性中心的接近受阻。

包埋法时被高分子物质半透膜包围。

二、固定化酶（细胞）性质的改变固定化后的酶与载体多点连接，可防止酶分子伸展变形。酶活力的缓慢释放。反应开始只有部分酶起作用，其余部分仅在开始起作用的酶变性后才起作用。抑制自降解，提高了酶稳定性。

2、固定化后酶稳定性提高稳定性提高的原因：

酶固定化后，对底物的最适pH曲线常常发生偏移。一般来说，带负电荷载体制备的固定化酶，其最适pH值较游离酶偏高，反之，若使用带正电荷载体的话，其最适pH值较游离酶偏低，即向酸性偏移。

3、固定化酶（细胞）的作用pH变化

酶反应的最适温度是酶热稳定性与反应速度的综合结果。因为固定化后，酶的热稳定性提高，所以最适温度也随之提高，这是很有利的结果。

4、固定化酶（细胞）的最适温度的变化

固定化酶的表观米氏常数Km随载体的带电性能变化。简单说，由于高级结构变化及载体影响引起酶与底物亲和力变化，从而使Km变化。而这种Km变化又受到溶液中离子强度影响：离子强度升高，载体周围的静电梯度逐渐减小，Km变化也逐渐缩小以至消失。5、米氏常数Km的变化三、固定化酶的制备方法固定化酶的制备方法、制备材料多种多样，不同的制备方法和材料，固定化后酶的特性不同。对于特定的目标酶，要根据酶自身的性质、应用目的、应用环境来选择固定化载体和方法。（1）必须注意维持酶的构象，特别是活性中心的构象。酶的催化反应取决于酶本身蛋白质分子所特有的高级结构和活性中心，为了不损害酶的催化活性及专一性，酶在固定化状态下发挥催化作用时，既需要保证其高级结构，又要使构成活性中心的氨基酸残基不发生变化。在具体选择时，一般应遵循以下几个原则。

（2）酶与载体必须有一定的结合程度。酶的固定化既不影响酶的原有构象，又能使固定化酶能有效回收贮藏，利于反复使用。（3）固定化应有利于自动化、机械化操作。这要求用于固定化的载体必须有一定的机械强度，才能使之在制备过程中不易破坏或受损。（4）固定化酶应有最小的空间位阻。固定化应尽可能不妨碍酶与底物的接近，以提高催化效率和产物的量。（5）固定化酶应有最大的稳定性。在应用过程中，所选载体应不和底物、产物或反应液发生化学反应。（6）固定化酶的成本适中。工业生产必须要考虑到固定化成本，要求固定化酶应是廉价的，以利于工业使用。酶的固定化方法主要可分为四类：吸附法、包埋法、共价键结合法和交联法等。吸附法和共价键结合法又可统称为载体结合法。吸附法吸附法是通过载体表面和酶分子表面间的次级键相互作用而达到固定目的的方法，是固定化中最简单的方法。酶与载体之间的亲和力是范德华力、疏水相互作用、离子键和氢键等。吸附法又可分为物理吸附法和离子吸附法。

（1）物理吸附法物理吸附法是通过物理方法将酶直接吸附在水不溶性载体表面上而使酶固定化的方法。是制备固定化酶最早采用的方法，如α-淀粉酶、糖化酶、葡萄糖氧化酶等都曾采用过此法进行固定化。物理吸附法制备固定化酶，操作简单、价廉、条件温和，载体可反复使用，酶与载体结合后，活性部位及空间构象变化不大，故所制得的固定化酶活力较高。（2）离子吸附法离子吸附法是将酶与含有离子交换基团的水不溶性载体以静电作用力相结合的固定化方法，即通过离子键使酶与载体相结合的固定化方法。此法固定的酶有葡萄糖异构酶、糖化酶、β-淀粉酶、纤维素酶等，在工业上用途较广。离子吸附法所使用的载体是某些离子交换剂。常用的阴离子交换剂有DEAE-纤维素、混合胺类(ECTEOLA)-纤维素、四乙氨基乙基(TEAE)-纤维素、等；阳离子交换剂有羧甲基(CM)-纤维素、纤维素柠檬酸盐等。其吸附容量一般大于物理吸附剂。离子吸附法具有操作简便、条件温和、酶活力不易丧失等优点。此外，吸附过程同时可以纯化酶。包埋法包埋法是将酶包埋在高聚物的细微凝胶网格中或高分子半透膜内的固定化方法。前者又称为凝胶包埋法，酶被包埋成网格型；后者又称为微胶囊包埋法，酶被包埋成微胶囊型。凝胶包埋法常用的载体有海藻酸钠凝胶、角叉菜胶、明胶、琼脂凝胶、卡拉胶等天然凝胶以及聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光交联树脂等合成凝胶或树脂。（1）凝胶包埋法

微胶囊包埋即将酶包埋在各种高聚物制成的半透膜微胶囊内的方法。它使酶存在于类似细胞内的环境中，可以防止酶的脱落，防止微囊外的环境直接接触，从而增加了酶的稳定性。常用于制造微胶囊的材料有聚酰胺、火棉胶、醋酸纤维素等。（2）微胶囊包埋法共价键结合法共价键结合法是将酶与聚合物载体以共价键结合的固定化方法。（1）酶蛋白N末端的α-氨基或赖氨酸残基的ε-氨基。（2）酶蛋白C末端的α-羧基、天门冬氨酸残基的β-羧基以及谷氨酸残基的γ-羧基。（3）半胱氨酸残基的巯基。（4）丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基的羟基。（5）组氨酸残基的咪唑基。（6）色氨酸残基的吲哚基。（7）苯丙氨酸和酪氨酸残基的苯环。交联法交联法是使用双功能或多功能试剂使酶分子之间相互交联呈网状结构的固定化方法。由于酶蛋白的功能团，如氨基、酚基、巯基和咪唑基，参与此反应，所以酶的活性中心构造可能受到影响，而使酶失活明显。但是尽可能地降低交联剂浓度和缩短反应时间将有利于固定化酶活力的提高。常用的双功能试剂有戊二醛、己二胺、异氰酸衍生物、双偶氮联苯和N,N′-乙烯双顺丁烯二酰亚胺等，其中使用最广泛的是戊二醛。戊二醛和酶蛋白中的游离氨基发生Schiff反应，形成薛夫碱，从而使酶分子之间相互交联形成固定化酶。以上四种固定化酶方法各有其优缺点（见表4-1）。三、影响固定化酶（细胞）性质的因素

分配效应空间障碍效应扩散限制效应

由于载体和底物的性质差异引起了微环境和宏观环境之间的性质不同。微环境是在固定化酶附近的局部环境，而将主体溶液称为宏观环境。1、分配效应

由这种不同造成的底物、产物和各种效应物在两个环境之间的不同分配，被称为分配效应。

固定化之后，由于酶的空间自由度受到限制(因为载体的空隙太小，或者固定化方式与位置不当，给酶的活性部位造成了空间屏障)，使酶分子的活性基团不易于底物或效应物接触，影响酶分子的分子活性中心对底物的定位作用,所造成的对固定化酶的活力的影响效应，被称为空间障碍效应。

2、空间障碍效应1）外扩散阻力是底物从宏观环境向酶颗粒表面传递过程中的一种扩散限制效应，它发生在反应之前，发生在固定化颗粒周围的液膜层。它会使底物在固相酶周围形成浓度梯度，通过增加搅拌速度和底物流速的方法可以减少外扩散效应。3、扩散限制效应

酶固定化使生物催化反应从均相转化为多相，于是产生了扩散阻力：2）内扩散阻力是指底物分子达到固相酶表面后传递到酶活性部位时的一种扩散阻力，它与催化反应同时进行。载体小而弯曲的细孔是产生内扩散阻力的要原因。因此使用低分子量底物，小的粒径、载体孔尽可能大而直且互相连通，或仅仅将酶固定在载体表面都可以降低这种内扩散阻力。第二节固定化细胞发酵一、定义•固定化细胞就是被限制自由移动的细胞，即细胞受到物理化学等因素约束或限制在一定的空间界限内，但细胞仍保留催化活性并具备能被反复或连续使用的活力。是在酶固定化基础上发展起来的一项技术。•固定化细胞可以将微生物发酵改为连续酶反应•可以获得更高的细胞浓度；•细胞可以重复使用；•在高稀释率时，不会产生洗脱现象；•单位容积的产率高；•提高遗传稳定性；•细胞不会受到剪切效应的影响。•发酵液中菌体含量少，有利与产品的分离纯化。二、固定化细胞的优点1.与游离细胞相比•免去了破碎细胞提取酶的手续•酶在细胞内的稳定性较高，完整细胞固定化后酶活性损失少•固定化细胞制备的成本比固定化酶低•无需辅酶再生2.与固定化酶相比•仅能利用胞内酶；•细胞膜、细胞壁和载体都存在着扩散限制作用；•载体形成的孔隙大小影响高分子底物的通透性；•可能有副反应。三、固定化细胞的缺点1，按细胞类型分为三类：•微生物•动物•植物四、固定化细胞的分类•死细胞：完整细胞、细胞碎片、细胞器。适用于一种酶催化的反应。•活细胞：增殖细胞、静止细胞、饥饿细胞。适用于多酶反应，特别是需要辅酶的反应。2.按生理状态分为两大类Adsorption（吸附）

covalentbonding（共价结合）

Crosslinking（交联）

Entrapment（包埋）

Encapsulation（微胶囊）五、细胞固定化的方法•利用载体和细胞表面所带电荷的静电引力，使细胞吸附于载体上。吸附法可分为物理吸附和离子吸附两种。该法操作简单，固定化过程对细胞活性影响小。吸附法1.原理•硅藻土•木屑•多孔玻璃•活性炭•多孔陶瓷•离子交换树脂•塑料2.载体的材料Z-电位细胞的性质和细胞壁的组成载体的性质

pH3.影响吸附固定化的因素•利用细胞表面的反应基团（如氨基、羧基、羟基、巯基、咪唑基）与活化的无机或有机载体反应，形成共价键将细胞固定。用该法制备的固定化细胞一般为死细胞。共价结合法•利用双功能或多功能试剂与细胞表面的反应基团（如氨基、羧基、羟基、巯基、咪唑基）反应