南师大细胞生物学考研课件第3章+细胞生物学研究方法

第三章细胞生物学研究方法1．细胞形态的结构结构的观察方法2．细胞及其组分的分离、显示鉴定及定量技术3．细胞体外操纵技术知识点：第一节细胞形态结构和观察方法细胞的形态观察

细胞的大小和计量单位鸵鸟卵=12-15cm人卵细胞=0.1mm多数细胞=10-30μm血细胞=7μm

显微镜观察范围

肉眼观察范围显微镜观察范围&肉眼观察范围细胞生物学及成像技术发展史17世纪中叶的滑竿显微镜荷兰眼镜商詹ZacchariasJanssen制造的第一台复合式显微镜

RobertHooke于1670年制造的显微镜现代显微镜•简洁紧凑的设计节省了镜座占用空间

•人机工程学设计，操作简单

•方便地安装各种CCD数码成像装置

•出色的光学性能与系统的优良品质•

•最新的UIS2光学系统赋予显微图像前所未有的优异对比度价格：几万至几十万元！！一.光学显微镜技术体式光学显微镜光学显微镜（一）普通复式光学显微镜技术

目镜

光学放大系统

物镜

光源1.组成

照明系统

折光镜

聚光镜

机械和支架系统光学显微镜的成像原理使用两个凸透镜，一个凸透镜把另外一个所成的像进一步放大，这就是复合式显微镜的基本原理。如果两个凸透镜一个能放大10倍，另一个能放大20倍，那么整个镜片组合的放大倍数就是10×20=200倍。复合显微镜中通常有两级串联放大系统，一级为物镜，另一级为目镜。2.分辨率：能够区别开的两个物点之间的距离

0.61λD=N.Sin(/2)

最大分辨率=0.2μm

N=1,λmin=450nm,=140→D=0.3um3.制样方法

固定、脱水、包埋、切片、染色、观察正置光学显微镜倒置显微镜光路系统正置显微镜与倒置显微镜光路比较（二）荧光显微技术什么是荧光?物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到低能状态时释放出的光，是非温度辐射光——冷光。即：物质吸收短波光，发射出的长波光。显微镜荧光利用光源激发——光化荧光Specimenabsorbslightatonewavelength(theexcitationwavelength)andemitslight(fluoresces)ataspecificandlongerwavelength.Mostfluorescentdyesemitvisiblelight.

将试剂抗原或试剂抗体用荧光素进行标记，试剂与标本中相应的抗体或抗原反应后，测定复合物中的荧光素，这种免疫技术，称为免疫荧光素技术。

免疫荧光技术RevealingSpecificProteinsinFixedCells

RevealingSpecificProteinsinLivingCellsDeterminingtheIntracellularConcentrationofCa2+andH+Ions

Thefluorescentpropertiesofcertaindyes,suchasfura-2,facilitatemeasurementoftheconcentrationoffreeCa2+inthecytosol.（三）激光扫描共聚焦显微镜技术价格：几百万元！！！传统的光学显微镜使用的是场光源，标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射或散射光的干扰；激光扫描共聚焦显微镜利用激光束经照明针孔形成点光源对标本内焦平面的每一点扫描，标本上的被照射点，在探测针孔处成像，由探测针孔后的光点倍增管（PMT）或冷电耦器件（cCCD）逐点或逐线接收，迅速在计算机监视器屏幕上形成荧光图像。照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和发射针孔，焦平面以外的点不会在探测针孔处成像，这样得到的共聚焦图像是标本的光学横断面，克服了普通显微镜图像模糊的缺点。

基本原理激光扫描共聚焦成像系统共聚焦显微镜的优点用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描。能显示细胞样品的立体结构。分辨力是普通光学显微镜的3倍。用途类似荧光显微镜，但能扫描不同层次，形成立体图像。FluorescentMicroscopeObjectiveArcLampEmissionFilterExcitationDiaphragmOcularExcitationFilterObjectiveLaserEmissionPinholeExcitationPinholePMTEmissionFilterExcitationFilterConfocalMicroscope3DImageReconstructionzxyzxyzyy3DImageReconstructionxyzyyz3DImageReconstruction.IsletofLangerhansTriplelabelledisletofLangerhansextractedfromPancreas.LabelledwithFITC-anti-isnsulin(green),CY3-ant-somatostatin(red)andCY5-anti-glucagon(blue)..MouseOocytes-calcium.DemonstratesnuclearCalciumfluctuationsinmouseoocytesattheonsetofmeioticresumption.NuCagreen(MolProbesInc)hasbeenusedastheCalciumprobe.t3colourprojectionof18opticalsectionsthroughalivingleaf.Visualisedbyauto-fluorescentLCSMImageofaXenopusMelanophoremicrotubulecytoskeleton(green)andthenucleus(blue)/（四）数字成像显微技术摄像机随机摄取同一区域的多幅图象，信号通过计算机放大，多幅图相加并平均，使信号反差增强。图象数字化处理技术提高信/噪比Anexampleoftheimagesproducedbytoday'simprovedmicroscopesispresentedinFigure1,whichillustratesadigitallycapturedmulticolorfluorescenceimageoftissueculturecellstakenonanEclipseE600microscopeusingtheCFI6040×fluoriteobjectiveandNikon'snewDXM1200digitalcamera.

暗视野显微镜（darkfieldmicroscope）的聚光镜中央有挡光片，使照明光线不直接进入物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。利用这种显微镜能见到小至4-200nm的微粒子，分辨率可比普通显微镜高50倍。（五）暗场显微技术

DarkfieldMicroscopyDictydiumcancellatumThephotomicrographbelowillustratestheslimemoldfungusDictydium

cancellatumunderdarkfieldillumination,imagedwitha10×objectiveonaNikonOptiphotmicroscope.（六）、相差显微镜

相差显微镜（phasecontrastmicroscope）由P．Zernike于1932年发明，并因此获1953年诺贝尔物理奖。这种显微镜最大的特点是可以观察未经染色的标本和活细胞。相差显微镜的基本原理是，把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。光线透过标本后发生折射，偏离了原来的光路，同时被延迟了1/4λ（波长），如果再增加或减少1/4λ，则光程差变为1/2λ，两束光合轴后干涉加强，振幅增大或减下，提高反差。在构造上，相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处：1.环形光阑（annulardiaphragm）位于光源与聚光器之间，作用是使透过聚光器的光线形成空心光锥，焦聚到标本上。2.相位板（annularphaseplate）在物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍射光的相位推迟1/4λ。分为两种：√A+相板：将直射光推迟1/4λ，两组光波合轴后光波相加，振幅加大，标本结构比周围介质更加变亮，形成亮反差（或称负反差）。√B+相板：将衍射光推迟1/4λ，两组光线合轴后光波相减，振幅变小，形成暗反差（或称正反差），结构比周围介质更加变暗。图2-6相差显微镜照明原理图2-7一种介壳虫的染色体（PCM照片）（七）、微分干涉差显微镜

1952年，Nomarski在相差显微镜原理的基础上发明了微分干涉差显微镜(differentialinterferencecontrast(DIC)microscope)，其优点是能显示结构的三维立体投影影像。与相差显微镜相比，其标本可略厚一点，折射率差别更大，故影像的立体感更强。调节DIC滑行器可使标本的细微结构呈现出正或负的投影形象，通常是一侧亮，而另一侧暗，这便造成了标本的人为三维立体感，类似大理石上的浮雕。DIC显微镜使细胞的细微结构，特别是一些较大的细胞器，如核、线粒体等，立体感特别强，适合于显微操作。目前像基因注入、核移植、转基因动物等生物工程的显微操作常在这种显微镜下进行。Fig.1-2:Afibroblastintissueculturevisualizedwithfourtypesoflightmicroscopy.Theimagein(A)wasobtainedbythesimpletransmissionoflightthroughthecell,atechniqueknownasbright-fieldmicroscopy.(B)Phase-contrastmicroscopy;(C)DICmicroscopy;and(D)dark-fieldmicroscopy.四种观察方式比较（七）录像增加反差显微技术录像机+图象处理技术高度光敏感摄像机获取信号可以数字化后输入计算机计算机弥补光学系统的缺点而达到理论上的分辨率0.61λ

分辨率

D=N=1,Sin180/2=1

N.Sin(/2)

λ越小分辨率越高

人们寻找更短波长的照明物质以提高分辨率

光学显微镜的分辨率在理论上不能小于0.2nm,这是因为受光波波长的局限,即可见光的波长不能小400nm。

电镜是利用电子束对样品放大成像的显微镜，电子束波长为0.01-0.9nm，因而分辨率大大提高。二、电子显微镜技术（一）电子显微镜的基本知识1.电子显微镜的分辨本领与有效放大倍数分辨本领：电镜在最佳状态下的分辨率可达0.2nm放大倍数：电镜比光镜观察到更加细微的结构，主要是因为电镜具有更高的分辨率而不是通常所说的放大倍数高。2.电镜与光镜的基本区别

光镜电镜光源可见光（300-700nm）

电子束紫外光（200nm）分辨率

100-200nm0.1nm透镜玻璃透镜磁透镜真空无要求1.33×10-3—10-5PaTEM3.电镜的基本构造电子照明系统电子枪（高频电流加热钨丝发出电子）聚光镜（静电透镜）—汇聚电子束电磁透镜成像系统物镜、中间镜、放大镜真空系统保持电子枪、镜筒和记录系统的高真空记录系统

荧光屏和感光胶片电源系统

供给高压、恒电电压和电流电镜的类型透射电镜TEM（TransmissionElectronMicroscope）内部结构观察扫描电镜SEM（ScanningElectronMicroscope）外部形态观察扫描透射电镜STEM（ScanningTransmissionElectronMicroscope）外部形态及内部结构观察超高压透射电镜

（Ultra-voltageTransmissionElectronMicroscope）活体观察扫描电镜结构和原理

扫描电镜利用从块状样品表面收集到的信号电子成像,因此相当于一种“反射式”显微镜(个别情况下也可采用透射模式)。ThismoldwasgrowingonablockofRomanocheeseinmyrefrigerator.Itwasbluishgreen,andisprobablyaPenicillum.Thepartsofmoldyouusuallyseearethereproductivestructures;thehyphaeunderneaththemarethepartsthatfeedonwhateverit'sgrowingon.Inthispicturetheyellowpartsarecalledconidiophores,andthegreensporesarecalledconidiaUnstainedbacteriophageT4.Afreeze-driedpreparationofbacteriophageT4andTMV.Thevirusconsistsofahead(normallyfullofdouble-strandedDNA),atailtube,abaseplateattheendofthetailtubeandthintailfibersattachedtothebaseplate.TheparticleatthelowerrighthaslostitsDNA.Themassperunitlengthofatailfiberis866+/-76kDa,indicatingitisatrimer.Thefull-scaleofthedark-fieldmicrographis0.512microns.（二）主要电镜技术介绍生物样品电镜技术的特殊要求样品薄ultrathinsection精细结构好fixation具反差staining主要电镜技术1.

超薄切片技术2.

负染技术3.

冰冻电镜技术4.

金属投影技术5.

冰冻断裂和冰冻蚀刻电镜技术6.

暗场电镜技术7.

整装细胞电镜技术8.

包埋—去包埋剂超薄切片电镜技术9.

高分辨率电镜技术10.

扫描电镜技术1.超薄切片技术

固定包埋切片染色观察2.负染技术重金属盐包埋Electronmicrographofnegativelystained'synthetic'actinfilaments.Actinfilamentsaredouble-helicalpolymersconsistingoftwolinearstrandsof42-kDactinsubunitsthatarehelicallytwistedaroundeachother.Theinsetrevealsa3-Dvolume-renderedrepresentationofafilament3-Dreconstruction.负染就是用重金属盐如磷钨酸或醋酸双氧铀对铺展在载网上的样品进行染色；吸去染料，样品干燥后，样品凹陷处铺了一薄层重金属盐，而凸的出地方则没有染料沉积，从而出现负染效果，分辨力可达1.5nm左右SeveraloftheTbacteriophageviruses3.冰冻电镜技术

避免化学固定剂、包埋剂等有机溶剂的影响，最大限度地保持样品真实性Fig.1-7:Traditionalthinsectionofaculturedfibroblastthatwasquick-frozenbyslammingitontoaliquidhelium-cooledcopperblock,andthenfreeze-substituted.Withinthe'stressfibers'(SF;seealsoFig.1-3),individualactinfilaments(seealsoFig.8)areclearlyresolved.Theunaggregated,widerfilaments(MT)aremicrotubules,andthesmalldarkparticles(R)representribosomes4.金属投影技术铂、钯、铬等在真空中加热蒸发Fig.1-9:Electronmicrographofamixtureofmyosinandnuclearlamin(L)dimersafterglycerolspraying/rotarymetalshadowingwithplatinum.Bothmoleculesarecomposedoftwoglobularheadslinkedtoacommonrod-liketail,approximately100nmlonginthecaseofmyosinand52nminthecaseofnuclearlamin.Fig.1-12:Surfacetopographyofmetal-coatedbacteriophageT4polyheadsrecordedbySTM(a,c)andbyTEM(b,d).Rawdata,topographrecordedintheSTM(a),andshadowgraphintheTEM(b).Surfacereliefs(c,d)computed(c)fromSTMtopographin(a),and(d)fromTEMshadowgraphin(b).5.冰冻断裂和冰冻蚀刻电镜技术冰冻蚀刻

冰冻蚀刻（freeze-etching）亦称冰冻断裂（freeze-fracture）。标本置于-100度的干冰或-196度的液氮中，进行冰冻。然后用冷刀骤然将标本断开，升温后，冰在真空条件下迅即升华，暴露出了断裂面的结构。冰升华暴露出标本内部结构的步骤称为蚀刻（etching）。蚀刻后，再向断裂面上喷涂一层蒸汽碳和铂。然后将组织溶掉，把碳和铂的膜剥下来，此膜即为复膜（replica）。复膜显示出了标本蚀刻面的形态，可置于电镜下观察。电镜下的影像即代表标本中细胞断裂面处的结构。ABC透射电镜照片与冰冻断裂和冰冻蚀刻电镜照片比较三、扫描隧道显微镜利用量子力学中的隧道效应，当原子尺度的针尖在不到1纳米的高度上扫描样品表面时，针尖与样品之间产生隧道效应，并且隧道电流(I)与针尖、样品间距(d)有一指数关系，这样d转化为I的函数可以测定，针尖的位置就可以测定，由此样品的表面形貌可以测定。Figure1-3.Comparisonofconstant-height

andconstant-currentmodeforSTMFigure1-2.SchematicoftipandsampleinteractionHereisaSTMimageshowingironatoms(Fe)adsorbonacopper(111)surfaceforminga“quantumcorral”inaverylowtemperature(4K).Actually,theimageshowsthecontourofthelocaldensityofelectronstates.Thecorralisabout14.3nmindiameter.原子力显微镜

ATOMICFORCEMICROSCOPY一种利用原子与分子间的相互作用力来观察物体表面微观形貌的新型实验技术。它有一根纳米级的探针，被固定在可灵敏操控的微米级弹性悬臂上。当探针很靠近样品时，其顶端的原子与样品表面原子间的作用力会使悬臂弯曲，偏离原来的位置。根据扫描样品时探针的偏离量或振动频率重建三维图像，就能间接获得样品表面的形貌或原子成分。

基本原理·提供真正的三维表面图·不需要对样品的任何特殊处理·在常压下甚至在液体环境下都可以良好工作

OneoftheadvantagesofAFMisthatitcanimagethenon-conductingsurfaces.Soitwasimmediatelyextendedtothebiologicalsystems,suchasanalyzingthecrystalsofaminoacidsandorganicmonolayers.第二节细胞组分的分析方法一.细胞及细胞组分的分离与纯化（一）细胞的分离技术1.破坏细胞外基质及细胞连接（蛋白水解酶和EDTA）2.从混合细胞群体中分离出不同类型细胞物理（沉降、离心/粘附能力）免疫（耦联材料：胶原、多糖小珠或塑料）荧光染料耦联抗体标记，流式分选（二）超离心技术细胞群体细胞崩解（低渗、超声粉碎、强制过滤或研磨）差速离心亚细胞组分和各种颗粒细胞内组分分离（三）细胞的选择性抽提化学抽提法选择性地抽提细胞的某些成分如：研究细胞骨架Cell

Triton等非离子去垢剂抽掉CM+可溶性成分骨架蛋白质体系进一步抽提核骨架-核纤层-中间纤维体系

蛋白酶消化蛋白质核骨架+DNA

（四）柱层析技术和电泳技术分析蛋白质与核酸分子可溶性细胞提取液中的蛋白质可用柱层析方法纯化蛋白质

分子量带电性分子亲和性蛋白分子量和亚基组成可用SDS(十二烷基磺酸钠）-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)测定分子量较大的不同核酸序列用琼脂糖凝胶电泳分析分离二.细胞内核酸、蛋白质、酶、糖、脂等的显示方法

DNA

Feulgen反应Shiff’s试剂紫红色多糖

PAS反应Shiff’s试剂脂肪

四氧化锇+不饱和脂肪酸=黑色苏丹Ⅲ（深红色）蛋白质

Millon反应红色酶如碱性磷酸酶的格莫瑞(Gomori)方法

三、特异性蛋白抗原的定位和定性（一）免疫荧光技术

免疫学方法+荧光标记技术主要程序

荧光抗体制备、标本处理、免疫染色、观察记录（二）免疫电镜技术免疫学方法+电镜标记技术主要程序同上（三）免疫印迹技术（WesternBlotting)聚丙烯酰胺凝胶电泳过的蛋白质转移到硝酸纤维素滤膜上1.

与某蛋白抗原的第一抗体反应；2.

与酶相连的抗第一抗体的第二抗体反应；3.

酶与对应底物反应，显色。(四）放射免疫沉淀分析(RIPA)技术可以对目的抗原（蛋白质）进行定性定量分析1.靶蛋白的同位素标记2.裂解细胞3.抗原抗体反应形成免疫复合物4.收集与分离免疫复合物（通常用固化的proteinA)5.对分离的免疫沉淀物中的标记化合物进行分析，用聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS或发射自显影技术优点：1.特异性高；2.灵敏度高；3.运用脉冲标记追踪可进行目的蛋白的动态分析。四、细胞内特异核酸的定位与定性（一）原位杂交技术用标记的核酸探针通过分子杂交确定特殊核苷酸顺序光镜电镜(二）Southern印迹技术

Southern印迹技术：把凝胶电泳上分离开的DNA片段，通过扩散或电泳转移到硝酸纤维膜上，做成一个凝胶复制品。使该膜与放射性DNA探针杂交，通过放射自显影可辨认出与DNA探针互补的特殊核苷酸顺序。Northern印迹技术：放射性探针与RNA杂交过程。六、利用同位素技术研究生物大分子在细胞内的合成动态放射自显影：利用放射性同位素的电离辐射对乳胶(含AgBr或AgCl)的感光作用，显示样品中同位素的研究方法。灵敏度高如：1.首次证明核仁是合成RNA的场所（尿嘧啶核苷首先掺入到核仁）；2.染色体的半保留复制。主要步骤：同位素标记的大分子前体的掺入细胞内同位素所在位置的显示（一）显微放射自显影

仓鼠细胞核的3H-TdR（二）电镜放射自显影七、定量细胞化学分析技术（一）显微分光光度测定技术FigureG.2.Schematiclighttransmission显微分光光度测定

SpectrophotometryUseoftheSpec20（二）元素分析电镜技术电子束非弹性散射

样品

X射线非弹性散射电子失去的能量是一个特征值，用它成像便能反映出元素的性质.

能量损失谱成像技术(ESI)直观显示样品中某元素的分布X射线也是一个特征值X射线微区分析不直观显示元素分布（三）流式细胞术与流式分选流式细胞术在流动的状态中检测细胞或颗粒的各项特性特异性强，灵敏度高，速度快，并能实现多参数分析可检测的样本种类多样：外周血，骨髓，细胞穿刺液，洗脱液，实体组织，培养细胞流式分选以流动状态的单个细胞的各项特性进行细胞分离也叫作Fluorescence-ActivatedCellSorting(FACS)1、概念2、流式工作原理通过激光激发高速流动的单个细胞所携带的各种荧光素和荧光染料，并检测由此产生的散射光和荧光的发射光，通过各种光信号的强弱来反应细胞的各种特征。FlowCellInjectorTipFluorescencesignalsFocusedlaserbeamSheathfluidPurdueUniversityCytometryLaboratories3、流式分析的类型★荧光标识Fluorescence-ActivatedCellSorting(FACS)★机械力分选MechanicalSorting★电荷分选ElectrostaticSorting

488nmlaser+-Fluorescence

Activated

Cell

SortingChargedPlatesSinglecellssortedintotesttubesFSCSensorFluorescencedetectorMechanicalSorting:TakesplacewithinaFlowcellWhenasortdecision“Greencell”hasbeenmadeitisdivertedintoa‘catcher’tubeeitherbymovingthetubeintothestream:Laserbeaminterrogatescellsoooooooooooooooorbyapplyinganacousticpulsetothestreamtodivertthecellintothetube.ooooooooooooooo

ooo

oHydrodynamicfocusingtakesplacewithinaflowcell.oooooooooooo

o

ooooooo

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o

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o

ooooooooElectrostaticSorting:Stream-in-airLaserinterrogationandsignalprocessingfollowedbysortdecision:whitesortright,bluesortleft,greenorblacknosort.

oooo

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left

waste

rightVariouscollectiondevicescanbeattached:tubes,slides,multi-wellplates.Hydrodynamicfocusinginanozzlevibratedbyatransducerproducesastreambreakingintodroplets.o

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ooElectronicdelayuntilcellreachesbreakoffpoint.Thenthestreamischarged:

+ifwhite

-ifblue.-

+Chargeddropletsdeflectbyelectrostaticfieldfromplatesheldathighvoltage(+/-3000volts).

o-

o+

o

o+o-

o

o+-++第三节细胞培养、细胞工程与显微技术一、细胞培养（一）原核生物培养细菌培养（二）真核单细胞生物培养酵母、